Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby zapewnić najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Wyświetla karuzelę trzech slajdów jednocześnie. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przewijać trzy slajdy naraz, lub przycisków suwaka na końcu, aby przewijać trzy slajdy naraz.
Wraz z rozwojem nowych ultramiękkich materiałów do urządzeń medycznych i zastosowań biomedycznych, kompleksowa charakterystyka ich właściwości fizycznych i mechanicznych jest zarówno ważna, jak i trudna. Zastosowano zmodyfikowaną technikę nanoindentacji mikroskopii sił atomowych (AFM) do scharakteryzowania wyjątkowo niskiego modułu sprężystości powierzchni nowej soczewki kontaktowej z biomimetycznego hydrożelu silikonowego Lehfilcon A, pokrytej warstwą rozgałęzionych struktur szczoteczkowych polimerów. Metoda ta umożliwia precyzyjne określenie punktów styku bez wpływu lepkiego wytłaczania podczas zbliżania się do rozgałęzionych polimerów. Ponadto umożliwia ona określenie właściwości mechanicznych poszczególnych elementów szczoteczkowych bez wpływu porowatości. Osiąga się to poprzez dobór sondy AFM o konstrukcji (rozmiar końcówki, geometria i sztywność sprężyny) szczególnie odpowiedniej do pomiaru właściwości miękkich materiałów i próbek biologicznych. Metoda ta poprawia czułość i dokładność, umożliwiając dokładny pomiar bardzo miękkiego materiału Lehfilcon A, który charakteryzuje się wyjątkowo niskim modułem sprężystości powierzchni (do 2 kPa) i wyjątkowo wysoką sprężystością w wewnętrznym (prawie 100%) środowisku wodnym. Wyniki badania powierzchni nie tylko ujawniły ultramiękkie właściwości powierzchni soczewki Lehfilcon A, ale również wykazały, że moduł sprężystości rozgałęzionych szczotek polimerowych był porównywalny z modułem podłoża krzemowo-wodorowego. Tę technikę charakteryzacji powierzchni można zastosować do innych ultramiękkich materiałów i wyrobów medycznych.
Właściwości mechaniczne materiałów przeznaczonych do bezpośredniego kontaktu z żywą tkanką są często determinowane przez środowisko biologiczne. Idealne dopasowanie tych właściwości materiału pomaga osiągnąć pożądane cechy kliniczne materiału bez powodowania niekorzystnych reakcji komórkowych1,2,3. W przypadku materiałów jednorodnych w masie, charakterystyka właściwości mechanicznych jest stosunkowo łatwa ze względu na dostępność standardowych procedur i metod badawczych (np. mikroindentacja4,5,6). Jednak w przypadku materiałów ultramiękkich, takich jak żele, hydrożele, biopolimery, żywe komórki itp., te metody badawcze na ogół nie mają zastosowania ze względu na ograniczenia rozdzielczości pomiaru i niejednorodność niektórych materiałów7. Na przestrzeni lat tradycyjne metody indentacji były modyfikowane i dostosowywane do charakterystyki szerokiej gamy miękkich materiałów, ale wiele metod nadal ma poważne wady, które ograniczają ich zastosowanie8,9,10,11,12,13. Brak wyspecjalizowanych metod badawczych, które mogłyby dokładnie i wiarygodnie charakteryzować właściwości mechaniczne materiałów supermiękkich i warstw powierzchniowych, poważnie ogranicza ich zastosowanie w różnych zastosowaniach.
W naszej poprzedniej pracy przedstawiliśmy soczewkę kontaktową Lehfilcon A (CL), miękki, heterogeniczny materiał o wszystkich ultramiękkich właściwościach powierzchniowych, pochodzących z potencjalnie biomimetycznych projektów inspirowanych powierzchnią rogówki oka. Ten biomateriał został opracowany poprzez wszczepienie rozgałęzionej, usieciowanej warstwy polimerowej poli(2-metakryloksyetylofosforylocholiny (MPC)) (PMPC) na hydrożel silikonowy (SiHy) 15, przeznaczony do wyrobów medycznych na bazie tego materiału. Ten proces wszczepiania tworzy na powierzchni warstwę składającą się z bardzo miękkiej i wysoce elastycznej, rozgałęzionej, szczoteczkowatej struktury polimerowej. Nasza poprzednia praca potwierdziła, że ​​biomimetyczna struktura Lehfilcon A CL zapewnia doskonałe właściwości powierzchniowe, takie jak lepsze zwilżanie i zapobieganie zanieczyszczeniom, zwiększoną lubrykację oraz zmniejszoną adhezję komórek i bakterii 15,16. Ponadto, zastosowanie i rozwój tego materiału biomimetycznego sugerują również dalszą ekspansję na inne urządzenia biomedyczne. Dlatego kluczowe jest scharakteryzowanie właściwości powierzchni tego ultramiękkiego materiału i zrozumienie jego mechanicznego oddziaływania z okiem, aby stworzyć kompleksową bazę wiedzy wspierającą przyszłe prace rozwojowe i zastosowania. Większość dostępnych w handlu soczewek kontaktowych SiHy składa się z jednorodnej mieszaniny polimerów hydrofilowych i hydrofobowych, które tworzą jednorodną strukturę materiału17. Przeprowadzono szereg badań w celu zbadania ich właściwości mechanicznych z wykorzystaniem tradycyjnych metod ściskania, rozciągania i mikrowciskania18,19,20,21. Jednak nowatorska biomimetyczna konstrukcja Lehfilconu A CL czyni go unikalnym materiałem heterogenicznym, w którym właściwości mechaniczne rozgałęzionych struktur szczotek polimerowych znacznie różnią się od właściwości podłoża SiHy. W związku z tym bardzo trudno jest dokładnie określić ilościowo te właściwości za pomocą metod konwencjonalnych i wciskania. Obiecująca metoda wykorzystuje metodę badania nanoindentacji, zaimplementowaną w mikroskopii sił atomowych (AFM), która została wykorzystana do określenia właściwości mechanicznych miękkich materiałów lepkosprężystych, takich jak komórki i tkanki biologiczne, a także miękkie polimery22,23,24,25,26,27,28,29,30. W metodzie AFM nanoindentacji, podstawy badania nanoindentacji są połączone z najnowszymi osiągnięciami technologii AFM, co zapewnia zwiększoną czułość pomiaru i umożliwia badanie szerokiej gamy z natury supermiękkich materiałów31,32,33,34,35,36. Ponadto technologia ta oferuje inne ważne zalety dzięki zastosowaniu różnych geometrii, wgłębnika i sondy oraz możliwości badania w różnych cieczach.
Nanoindentację AFM można warunkowo podzielić na trzy główne składniki: (1) sprzęt (czujniki, detektory, sondy itp.); (2) parametry pomiaru (takie jak siła, przemieszczenie, prędkość, rozmiar rampy itp.); (3) przetwarzanie danych (korekta linii bazowej, estymacja punktu styku, dopasowanie danych, modelowanie itp.). Istotnym problemem tej metody jest to, że wiele badań w literaturze dotyczących nanoindentacji AFM podaje bardzo różne wyniki ilościowe dla tego samego typu próbki/komórki/materiału37,38,39,40,41. Na przykład Lekka i in. zbadali i porównali wpływ geometrii sondy AFM na zmierzony moduł Younga próbek mechanicznie jednorodnego hydrożelu i niejednorodnych komórek. Podają, że wartości modułu są silnie zależne od wyboru wspornika i kształtu końcówki, przy czym najwyższa wartość przypada na sondę w kształcie piramidy, a najniższa na 42 dla sondy sferycznej. Podobnie Selhuber-Unkel i in. Wykazano, jak prędkość wgłębnika, jego rozmiar i grubość próbek poliakrylamidu (PAAM) wpływają na moduł Younga mierzony metodą nanoindentacji ACM43. Kolejnym czynnikiem komplikującym jest brak standardowych materiałów testowych o ekstremalnie niskim module sprężystości i darmowych procedur badawczych. Utrudnia to uzyskanie dokładnych i wiarygodnych wyników. Metoda ta jest jednak bardzo przydatna do pomiarów względnych i ocen porównawczych podobnych typów próbek, na przykład do odróżniania komórek zdrowych od nowotworowych za pomocą nanoindentacji AFM 44, 45 .
Podczas badania miękkich materiałów metodą nanoindentacji AFM, ogólną zasadą jest użycie sondy o niskiej stałej sprężystości (k), która ściśle odpowiada modułowi sprężystości próbki, oraz półkulistej/okrągłej końcówce, tak aby pierwsza sonda nie przebijała powierzchni próbki przy pierwszym kontakcie z miękkimi materiałami. Ważne jest również, aby sygnał odchylenia generowany przez sondę był wystarczająco silny, aby mógł zostać wykryty przez system detektora laserowego24,34,46,47. W przypadku ultramiękkich, heterogenicznych komórek, tkanek i żeli, kolejnym wyzwaniem jest pokonanie siły adhezji między sondą a powierzchnią próbki, aby zapewnić powtarzalne i wiarygodne pomiary48,49,50. Do niedawna większość prac nad nanoindentacją AFM koncentrowała się na badaniu zachowania mechanicznego komórek biologicznych, tkanek, żeli, hydrożeli i biocząsteczek przy użyciu stosunkowo dużych sond kulistych, powszechnie nazywanych sondami koloidalnymi (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Te końcówki mają promień od 1 do 50 µm i są powszechnie wykonane ze szkła borokrzemianowego, polimetakrylanu metylu (PMMA), polistyrenu (PS), dwutlenku krzemu (SiO2) i węgla diamentopodobnego (DLC). Chociaż nanoindentacja CP-AFM jest często pierwszym wyborem do charakteryzacji miękkich próbek, ma ona swoje własne problemy i ograniczenia. Zastosowanie dużych, mikronowych, sferycznych końcówek zwiększa całkowitą powierzchnię styku końcówki z próbką i powoduje znaczną utratę rozdzielczości przestrzennej. W przypadku miękkich, niejednorodnych próbek, gdzie właściwości mechaniczne lokalnych pierwiastków mogą znacznie różnić się od średniej na większym obszarze, indentacja CP może ukryć wszelkie niejednorodności właściwości w skali lokalnej52. Sondy koloidalne są zazwyczaj wytwarzane przez przymocowanie mikronowych kulek koloidalnych do bezkońcówkowych wsporników za pomocą klejów epoksydowych. Sam proces produkcyjny jest obarczony wieloma problemami i może prowadzić do niespójności w procesie kalibracji sondy. Ponadto rozmiar i masa cząstek koloidalnych bezpośrednio wpływają na główne parametry kalibracji dźwigni, takie jak częstotliwość rezonansowa, sztywność sprężyny i czułość na ugięcie56,57,58. Zatem powszechnie stosowane metody dla konwencjonalnych sond AFM, takie jak kalibracja temperaturowa, mogą nie zapewniać dokładnej kalibracji dla CP i do wykonania tych korekt mogą być wymagane inne metody57,59,60,61. Typowe eksperymenty z wciskaniem CP wykorzystują dźwignię o dużych odchyleniach do badania właściwości miękkich próbek, co stwarza kolejny problem podczas kalibracji nieliniowego zachowania dźwigni przy stosunkowo dużych odchyleniach62,63,64. Nowoczesne metody wciskania sond koloidalnych zazwyczaj uwzględniają geometrię dźwigni używanej do kalibracji sondy, ale ignorują wpływ cząstek koloidalnych, co powoduje dodatkową niepewność w dokładności metody38,61. Podobnie, moduły sprężystości obliczane metodą dopasowania modelu kontaktowego są bezpośrednio zależne od geometrii sondy wciskowej, a niedopasowanie między końcówką a charakterystyką powierzchni próbki może prowadzić do niedokładności27, 65, 66, 67, 68. W niedawnych pracach Spencera i in. podkreślono czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy charakteryzowaniu miękkich szczotek polimerowych metodą nanoindentacji CP-AFM. Autorzy donieśli, że zatrzymywanie lepkiej cieczy w szczotkach polimerowych w funkcji prędkości powoduje wzrost obciążenia głowicy, a tym samym różnice w pomiarach właściwości zależnych od prędkości30,69,70,71.
W niniejszym badaniu scharakteryzowaliśmy moduł sprężystości powierzchni ultramiękkiego, wysoce elastycznego materiału Lehfilcon A CL, stosując zmodyfikowaną metodę nanoindentacji AFM. Biorąc pod uwagę właściwości i nową strukturę tego materiału, zakres czułości tradycyjnej metody indentacji jest wyraźnie niewystarczający do scharakteryzowania modułu sprężystości tego niezwykle miękkiego materiału, dlatego konieczne jest zastosowanie metody nanoindentacji AFM o wyższej i niższej czułości. Po przeanalizowaniu wad i problemów istniejących technik nanoindentacji sondą koloidalną AFM, pokazujemy, dlaczego wybraliśmy mniejszą, specjalnie zaprojektowaną sondę AFM, aby wyeliminować czułość, szum tła, precyzyjnie określić punkt kontaktu, zmierzyć moduł prędkości miękkich, heterogenicznych materiałów, takich jak zależność od retencji płynu, oraz umożliwić dokładną kwantyfikację. Ponadto, byliśmy w stanie dokładnie zmierzyć kształt i wymiary końcówki wciskowej, co pozwoliło nam wykorzystać model dopasowania stożka-kuli do określenia modułu sprężystości bez oceny powierzchni styku końcówki z materiałem. Dwa domniemane założenia, które zostały skwantyfikowane w tej pracy, to w pełni elastyczne właściwości materiału oraz moduł sprężystości niezależny od głębokości wcisku. Stosując tę ​​metodę, najpierw przetestowaliśmy ultramiękkie wzorce o znanym module, aby skwantyfikować metodę, a następnie wykorzystaliśmy ją do scharakteryzowania powierzchni dwóch różnych materiałów soczewek kontaktowych. Oczekuje się, że ta metoda charakteryzowania powierzchni nanoindentacji AFM o zwiększonej czułości znajdzie zastosowanie w szerokiej gamie biomimetycznych, heterogenicznych ultramiękkich materiałów, które mogą znaleźć zastosowanie w urządzeniach medycznych i zastosowaniach biomedycznych.
Soczewki kontaktowe Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Teksas, USA) i ich podłoża silikonowo-hydrożelowe wybrano do eksperymentów nanoindentacji. W eksperymencie wykorzystano specjalnie zaprojektowany uchwyt soczewki. Aby zainstalować soczewkę do testów, ostrożnie umieszczono ją na kopulastym statywie, upewniając się, że do środka nie dostały się żadne pęcherzyki powietrza, a następnie zamocowano krawędziami. Otwór w uchwycie na górze soczewki zapewnia dostęp do optycznego środka soczewki w celu przeprowadzenia eksperymentów nanoindentacji, jednocześnie utrzymując płyn na miejscu. Dzięki temu soczewki pozostają w pełni nawodnione. Jako roztwór testowy użyto 500 μl roztworu do pakowania soczewek kontaktowych. Aby zweryfikować wyniki ilościowe, przygotowano komercyjnie dostępne nieaktywowane hydrożele poliakrylamidowe (PAAM) z kompozycji poliakrylamidu-ko-metyleno-bisakrylamidu (płytki Petrisoft o średnicy 100 mm, Matrigen, Irvine, Kalifornia, USA) o znanym module sprężystości 1 kPa. Nanieść 4–5 kropli (około 125 µl) buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS firmy Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) i 1 kroplę roztworu do soczewek kontaktowych OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA). ) na styk hydrożelu i sondy AFM.
Próbki substratów Lehfilcon A CL i SiHy wizualizowano za pomocą mikroskopu elektronowego z emisją polową (FEG SEM) firmy FEI Quanta 250, wyposażonego w detektor skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego (STEM). Aby przygotować próbki, soczewki przemyto wodą i pocięto na kliny o kształcie koła. Aby uzyskać kontrast różnicowy między składnikami hydrofilowymi i hydrofobowymi próbek, jako barwnik zastosowano 0,10% stabilizowany roztwór RuO4, w którym próbki zanurzono na 30 minut. Barwienie Lehfilcon A CL RuO4 jest ważne nie tylko dla uzyskania lepszego kontrastu różnicowego, ale także pomaga zachować strukturę rozgałęzionych szczotek polimerowych w ich pierwotnej formie, która jest widoczna na obrazach STEM. Następnie próbki przemyto i odwodniono w serii mieszanin etanolu i wody o rosnącym stężeniu etanolu. Próbki odlano następnie z żywicy epoksydowej EMBed 812/Araldite, która utwardzała się przez noc w temperaturze 70°C. Bloki próbek uzyskane w wyniku polimeryzacji żywicy pocięto ultramikrotomem, a powstałe cienkie skrawki uwidoczniono za pomocą detektora STEM w trybie niskiej próżni przy napięciu przyspieszającym 30 kV. Ten sam system SEM został użyty do szczegółowej charakterystyki sondy AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornia, USA). Obrazy SEM sondy AFM uzyskano w typowym trybie wysokiej próżni przy napięciu przyspieszającym 30 kV. Obrazy akwizycji wykonano pod różnymi kątami i przy różnych powiększeniach, aby zarejestrować wszystkie szczegóły kształtu i rozmiaru końcówki sondy AFM. Wszystkie wymiary końcówki interesujące na obrazach zmierzono cyfrowo.
Do wizualizacji i nanoindentacji próbek lehfilconu A CL, podłoża SiHy oraz hydrożelu PAAm wykorzystano mikroskop sił atomowych Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornia, USA) z trybem „PeakForce QNM in Fluid”. Do eksperymentów obrazowania wykorzystano sondę PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) o nominalnym promieniu końcówki 1 nm, która rejestrowała obrazy próbki o wysokiej rozdzielczości z częstotliwością skanowania 0,50 Hz. Wszystkie obrazy wykonano w roztworze wodnym.
Eksperymenty nanoindentacji AFM przeprowadzono z użyciem sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Sonda AFM ma krzemową końcówkę na wsporniku azotkowym o grubości 345 nm, długości 54 µm i szerokości 4,5 µm, z częstotliwością rezonansową 45 kHz. Została ona specjalnie zaprojektowana do charakteryzowania i wykonywania ilościowych pomiarów nanomechanicznych na miękkich próbkach biologicznych. Czujniki są indywidualnie kalibrowane w fabryce z wstępnie skalibrowanymi ustawieniami sprężyny. Stałe sprężyny sond użytych w tym badaniu mieściły się w zakresie 0,05–0,1 N/m. Aby dokładnie określić kształt i rozmiar końcówki, sondę szczegółowo scharakteryzowano za pomocą SEM. Na rys. 1a przedstawiono zdjęcie sondy PFQNM-LC-A-CAL z mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości i niskim powiększeniu, zapewniające całościowy obraz konstrukcji sondy. Na rys. Rysunek 1b przedstawia powiększony widok wierzchołka końcówki sondy, dostarczając informacji o jej kształcie i rozmiarze. Na skrajnym końcu igła ma kształt półkuli o średnicy około 140 nm (rys. 1c). Poniżej końcówka zwęża się do kształtu stożka, osiągając zmierzoną długość około 500 nm. Poza obszarem zwężenia końcówka jest cylindryczna i kończy się na całkowitej długości 1,18 µm. Jest to główna część funkcjonalna końcówki sondy. Dodatkowo, do testów użyto dużej, sferycznej sondy polistyrenowej (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) o średnicy końcówki 45 µm i stałej sprężystości 2 N/m, jako sondy koloidalnej. Dla porównania, sondę PFQNM-LC-A-CAL 140 nm.
Donoszono, że podczas nanoindentacji pomiędzy sondą AFM a polimerową strukturą szczoteczki może gromadzić się ciecz, co powoduje wywieranie siły skierowanej ku górze na sondę AFM, zanim faktycznie dotknie ona powierzchni69. Ten efekt lepkiego wytłaczania spowodowany zatrzymywaniem płynu może zmienić pozorny punkt kontaktu, wpływając tym samym na pomiary modułu sprężystości powierzchni. Aby zbadać wpływ geometrii sondy i prędkości wciskania na zatrzymywanie płynu, wykreślono krzywe siły wciskania dla próbek Lehfilcon A CL, używając sondy o średnicy 140 nm przy stałych prędkościach przemieszczenia 1 µm/s i 2 µm/s. Średnica sondy 45 µm, stałe ustawienie siły 6 nN osiągnięte przy 1 µm/s. Eksperymenty z sondą o średnicy 140 nm przeprowadzono przy prędkości wciskania 1 µm/s i ustalonej sile 300 pN, dobranej tak, aby wytworzyć ciśnienie kontaktowe w zakresie fizjologicznym (1–8 kPa) górnej powieki. ciśnienie 72. Miękkie, gotowe próbki hydrożelu PAA o ciśnieniu 1 kPa badano przy sile wciskania 50 pN przy prędkości 1 μm/s, stosując sondę o średnicy 140 nm.
Ponieważ długość stożkowej części końcówki sondy PFQNM-LC-A-CAL wynosi około 500 nm, dla każdej głębokości wciskania < 500 nm można bezpiecznie założyć, że geometria sondy podczas wciskania pozostanie wierna jej stożkowemu kształtowi. Ponadto zakłada się, że powierzchnia badanego materiału będzie wykazywać odwracalną odpowiedź sprężystą, co również zostanie potwierdzone w kolejnych sekcjach. Dlatego, w zależności od kształtu i rozmiaru końcówki, wybraliśmy model dopasowania stożka do kuli opracowany przez Briscoe, Sebastiana i Adamsa, który jest dostępny w oprogramowaniu producenta, do przetwarzania naszych eksperymentów nanoindentacji AFM (NanoScope). Oprogramowanie do analizy danych separacyjnych, Bruker) 73. Model opisuje zależność siła-przemieszczenie F(δ) dla stożka z defektem wierzchołka w kształcie kuli. Na rys. Rysunek 2 przedstawia geometrię styku podczas interakcji sztywnego stożka z kulistą końcówką, gdzie R to promień kulistego wierzchołka, a to promień styku, b to promień styku na końcu kulistego wierzchołka, δ to promień styku. Głębokość wgłębienia, θ to połowa kąta stożka. Obraz SEM tej sondy wyraźnie pokazuje, że kulista końcówka o średnicy 140 nm przechodzi stycznie w stożek, więc tutaj b jest zdefiniowane tylko przez R, tj. b = R cos θ. Oprogramowanie dostarczone przez producenta zapewnia zależność stożek-kula do obliczenia wartości modułu Younga (E) na podstawie danych dotyczących siły rozdzielającej, przy założeniu a > b. Zależność:
gdzie F to siła wcisku, E to moduł Younga, ν to współczynnik Poissona. Promień styku a można oszacować za pomocą:
Schemat geometrii kontaktu sztywnego stożka z kulistą końcówką wciśniętego w materiał soczewki kontaktowej Lefilcon z warstwą powierzchniową z rozgałęzionych szczoteczek polimerowych.
Jeżeli a ≤ b, zależność ta sprowadza się do równania dla konwencjonalnego wgłębnika sferycznego;
Uważamy, że interakcja sondy wciskowej z rozgałęzioną strukturą szczotki polimerowej PMPC spowoduje, że promień kontaktu a będzie większy niż promień kontaktu sferycznego b. Dlatego we wszystkich ilościowych pomiarach modułu sprężystości przeprowadzonych w tym badaniu zastosowaliśmy zależność uzyskaną dla przypadku a > b.
Ultramiękkie materiały biomimetyczne badane w tym badaniu zostały kompleksowo zobrazowane przy użyciu skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) przekroju próbki i mikroskopii sił atomowych (AFM) powierzchni. Ta szczegółowa charakterystyka powierzchni została wykonana jako rozszerzenie naszej wcześniej opublikowanej pracy, w której ustaliliśmy, że dynamicznie rozgałęziona polimerowa struktura szczotkowa modyfikowanej PMPC powierzchni lehfilcon A CL wykazuje podobne właściwości mechaniczne do natywnej tkanki rogówki14. Z tego powodu nazywamy powierzchnie soczewek kontaktowych materiałami biomimetycznymi14. Na rys. 3a, b przedstawiono przekroje poprzeczne rozgałęzionych polimerowych struktur szczotkowych PMPC na powierzchni podłoża lehfilcon A CL i nieobrobionego podłoża SiHy. Powierzchnie obu próbek zostały dodatkowo przeanalizowane przy użyciu obrazów AFM o wysokiej rozdzielczości, co dodatkowo potwierdziło wyniki analizy STEM (rys. 3c, d). Łącznie, obrazy te dają przybliżoną długość struktury szczotkowej rozgałęzionego polimeru PMPC w zakresie 300–400 nm, co jest kluczowe dla interpretacji pomiarów nanoindentacji AFM. Inną kluczową obserwacją wynikającą z tych obrazów jest fakt, że ogólna struktura powierzchni materiału biomimetycznego CL różni się morfologicznie od struktury podłoża SiHy. Ta różnica w morfologii ich powierzchni może stać się widoczna podczas ich mechanicznej interakcji z sondą AFM, która wbija się w materiał, a następnie w zmierzonych wartościach modułu sprężystości.
Obrazy STEM przekroju poprzecznego (a) lehfilconu A CL i (b) podłoża SiHy. Skala: 500 nm. Obrazy AFM powierzchni podłoża lehfilconu A CL (c) i podłoża bazowego SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polimery inspirowane biologią i polimerowe struktury szczotkowe są z natury miękkie i były szeroko badane oraz wykorzystywane w różnych zastosowaniach biomedycznych74,75,76,77. Dlatego ważne jest zastosowanie metody nanoindentacji AFM, która pozwala na dokładny i wiarygodny pomiar ich właściwości mechanicznych. Jednocześnie jednak unikalne właściwości tych ultramiękkich materiałów, takie jak wyjątkowo niski moduł sprężystości, wysoka zawartość cieczy i wysoka elastyczność, często utrudniają dobór odpowiedniego materiału, kształtu i rozmiaru sondy wgłębnika. Jest to istotne, aby wgłębnik nie przebił miękkiej powierzchni próbki, co prowadziłoby do błędów w określeniu punktu styku z powierzchnią i powierzchni styku.
W tym celu niezbędne jest kompleksowe zrozumienie morfologii ultramiękkich materiałów biomimetycznych (lehfilcon A CL). Informacje o rozmiarze i strukturze rozgałęzionych szczotek polimerowych, uzyskane metodą obrazowania, stanowią podstawę do mechanicznej charakterystyki powierzchni za pomocą technik nanoindentacji AFM. Zamiast mikronowych sferycznych sond koloidalnych, wybraliśmy sondę azotku krzemu PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) o średnicy końcówki 140 nm, specjalnie zaprojektowaną do ilościowego mapowania właściwości mechanicznych próbek biologicznych 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Uzasadnienie stosowania stosunkowo ostrych sond w porównaniu z konwencjonalnymi sondami koloidalnymi można wyjaśnić cechami strukturalnymi materiału. Porównując rozmiar końcówki sondy (~140 nm) z rozgałęzionymi szczotkami polimerowymi na powierzchni CL lehfilcon A, pokazanymi na rys. 3a, można stwierdzić, że końcówka jest wystarczająco duża, aby stykać się bezpośrednio z tymi strukturami szczotkowymi, co zmniejsza ryzyko ich przebicia. Aby to zilustrować, na rys. 4 przedstawiono obraz STEM CL lehfilcon A i wgłębienie sondy AFM (rysunek w skali).
Schemat przedstawiający obraz STEM lehfilconu A CL i sondy wgłębnej ACM (narysowany w skali).
Ponadto rozmiar końcówki 140 nm jest wystarczająco mały, aby uniknąć ryzyka wystąpienia efektów lepkiego wytłaczania, o których wcześniej informowano w przypadku szczotek polimerowych wytwarzanych metodą nanoindentacji CP-AFM69,71. Zakładamy, że ze względu na specjalny stożkowo-kulisty kształt i stosunkowo mały rozmiar tej końcówki AFM (rys. 1), charakter krzywej siły generowanej przez nanoindentację lehfilcon A CL nie będzie zależał od prędkości wciskania ani prędkości ładowania/odciążania. Dlatego nie ma na nią wpływu efekt poroelastyczny. Aby przetestować tę hipotezę, próbki lehfilcon A CL wciskano przy ustalonej maksymalnej sile za pomocą sondy PFQNM-LC-A-CAL, ale przy dwóch różnych prędkościach, a otrzymane krzywe siły rozciągania i cofania wykorzystano do wykreślenia siły (nN) w separacji (µm), co pokazano na rysunku 5a. Wyraźnie widać, że krzywe siły podczas obciążenia i odciążenia całkowicie się pokrywają, a na rysunku nie ma jednoznacznych dowodów na to, że siła ścinająca przy zerowej głębokości wciskania rośnie wraz z prędkością wciskania, co sugeruje, że poszczególne elementy szczotkowe zostały scharakteryzowane bez efektu porowatości. Natomiast efekty retencji płynu (wyciskanie lepkie i efekty porowatości) są widoczne dla sondy AFM o średnicy 45 µm przy tej samej prędkości wciskania i są uwydatnione przez histerezę między krzywymi rozciągania i cofania, jak pokazano na rysunku 5b. Wyniki te potwierdzają hipotezę i sugerują, że sondy o średnicy 140 nm są dobrym wyborem do charakteryzowania tak miękkich powierzchni.
Krzywe siły wciskania lehfilcon A CL uzyskane przy użyciu ACM; (a) przy użyciu sondy o średnicy 140 nm przy dwóch szybkościach obciążania, wykazujące brak efektu porowatości podczas wciskania powierzchni; (b) przy użyciu sond o średnicy 45 µm i 140 nm. s przedstawiają efekty lepkiej ekstruzji i porowatości w przypadku dużych sond w porównaniu z sondami o mniejszych średnicach.
Aby scharakteryzować ultramiękkie powierzchnie, metody nanoindentacji AFM wymagają najlepszej sondy do badania właściwości badanego materiału. Oprócz kształtu i rozmiaru końcówki, czułość układu detektora AFM, czułość na ugięcie końcówki w środowisku testowym oraz sztywność wspornika odgrywają ważną rolę w określaniu dokładności i niezawodności pomiarów nanoindentacji. W przypadku naszego systemu AFM granica wykrywalności detektora czułego na położenie (PSD) wynosi około 0,5 mV i jest oparta na wstępnie skalibrowanej sztywności sprężyny oraz obliczonej czułości ugięcia cieczy sondy PFQNM-LC-A-CAL, która odpowiada teoretycznej czułości obciążenia. Dlatego metoda ta umożliwia pomiar minimalnej siły wciskania ≤ 0,1 pN bez składowej szumu obwodowego. Jednak system AFM praktycznie nie jest w stanie zredukować szumu obwodowego do tego poziomu ze względu na czynniki takie jak drgania mechaniczne i dynamika płynów. Czynniki te ograniczają ogólną czułość metody nanoindentacji AFM, a także powodują sygnał szumu tła wynoszący około ≤ 10 pN. W celu scharakteryzowania powierzchni, próbki podłoża Lehfilcon A CL i SiHy wciskano w warunkach pełnego uwodnienia, używając sondy 140 nm do charakteryzacji SEM, a uzyskane krzywe siły nałożono na siebie pomiędzy siłą (pN) a ciśnieniem. Wykres separacji (µm) przedstawiono na rysunku 6a. W porównaniu z podłożem bazowym SiHy, krzywa siły Lehfilcon A CL wyraźnie pokazuje fazę przejściową rozpoczynającą się w punkcie kontaktu z rozwidloną szczotką polimerową i kończącą się ostrą zmianą nachylenia oznaczającą kontakt końcówki z materiałem podłoża. Ta przejściowa część krzywej siły podkreśla prawdziwie sprężyste zachowanie rozgałęzionej szczotki polimerowej na powierzchni, o czym świadczy krzywa ściskania ściśle podążająca za krzywą rozciągania oraz kontrast właściwości mechanicznych między strukturą szczotki a materiałem SiHy o dużej objętości. Porównując lefilcon… Rozdzielenie średniej długości rozgałęzionego pędzla polimerowego na obrazie STEM PCS (rys. 3a) i jego krzywej siły wzdłuż osi odciętych na rys. 3a.6a pokazuje, że metoda jest w stanie wykryć końcówkę i rozgałęziony polimer sięgający samej górnej powierzchni. Kontakt między strukturami pędzla. Ponadto, bliskie nakładanie się krzywych siły wskazuje na brak efektu retencji cieczy. W tym przypadku nie występuje absolutnie żadna przyczepność między igłą a powierzchnią próbki. Najwyższe odcinki krzywych siły dla obu próbek nakładają się na siebie, co odzwierciedla podobieństwo właściwości mechanicznych materiałów podłoża.
(a) Krzywe siły nanoindentacji AFM dla podłoży Lehfilcon A CL i podłoży SiHy, (b) krzywe siły pokazujące oszacowanie punktu styku przy użyciu metody progu szumu tła.
Aby zbadać dokładniej krzywą siły, krzywa naprężenia próbki Lehfilcon A CL została ponownie przedstawiona na rys. 6b z maksymalną siłą 50 pN wzdłuż osi y. Wykres ten dostarcza ważnych informacji o pierwotnym szumie tła. Szum mieści się w zakresie ±10 pN, co pozwala na dokładne określenie punktu styku i obliczenie głębokości wcisku. Jak donoszono w literaturze, identyfikacja punktów styku ma kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny właściwości materiału, takich jak moduł85. Podejście obejmujące automatyczne przetwarzanie danych z krzywej siły wykazało lepsze dopasowanie między dopasowaniem danych a pomiarami ilościowymi dla materiałów miękkich86. W niniejszej pracy nasz wybór punktów styku jest stosunkowo prosty i obiektywny, ale ma swoje ograniczenia. Nasze konserwatywne podejście do określania punktu styku może skutkować nieznacznie zawyżonymi wartościami modułu dla mniejszych głębokości wcisku (<100 nm). Wykorzystanie algorytmicznego wykrywania punktów styku i automatycznego przetwarzania danych mogłoby być kontynuacją tej pracy w przyszłości w celu dalszego udoskonalenia naszej metody. Tak więc dla wewnętrznego szumu tła rzędu ±10 pN, definiujemy punkt kontaktu jako pierwszy punkt danych na osi x na rysunku 6b o wartości ≥10 pN. Następnie, zgodnie z progiem szumu 10 pN, pionowa linia na poziomie ~0,27 µm oznacza punkt kontaktu z powierzchnią, po czym krzywa rozciągania kontynuuje się, aż podłoże spotka się z głębokością wgniecenia ~270 nm. Co ciekawe, na podstawie rozmiaru cech szczotki rozgałęzionego polimeru (300–400 nm) zmierzonego metodą obrazowania, głębokość wgniecenia próbki CL lehfilcon A obserwowanej za pomocą metody progu szumu tła wynosi około 270 nm, co jest bardzo bliskie rozmiarowi pomiaru za pomocą STEM. Wyniki te dodatkowo potwierdzają zgodność i stosowalność kształtu i rozmiaru końcówki sondy AFM do wgniecenia tej bardzo miękkiej i wysoce elastycznej struktury szczotki rozgałęzionego polimeru. Dane te dostarczają również mocnych dowodów na poparcie naszej metody wykorzystania szumu tła jako progu do precyzyjnego określania punktów styku. Zatem wszelkie wyniki ilościowe uzyskane z modelowania matematycznego i dopasowania krzywej siły powinny być stosunkowo dokładne.
Pomiary ilościowe metodami nanoindentacji AFM są całkowicie zależne od modeli matematycznych użytych do selekcji danych i późniejszej analizy. Dlatego ważne jest, aby przed wyborem konkretnego modelu uwzględnić wszystkie czynniki związane z wyborem wgłębnika, właściwościami materiału i mechaniką ich interakcji. W tym przypadku geometrię końcówki dokładnie scharakteryzowano za pomocą mikrofotografii SEM (rys. 1), a na podstawie wyników, sonda AFM o średnicy 140 nm do nanoindentacji z twardym stożkiem i kulistą geometrią końcówki jest dobrym wyborem do charakteryzowania próbek Lehfilcon A CL79. Kolejnym ważnym czynnikiem, który należy dokładnie ocenić, jest sprężystość badanego materiału polimerowego. Chociaż wstępne dane z nanoindentacji (rys. 5a i 6a) wyraźnie wskazują na nakładanie się krzywych rozciągania i ściskania, tj. całkowity powrót sprężysty materiału, niezwykle ważne jest potwierdzenie czysto sprężystej natury styków. W tym celu wykonano dwa kolejne wgłębienia w tym samym miejscu na powierzchni próbki lehfilconu A CL z prędkością wgłębienia 1 µm/s w warunkach pełnego uwodnienia. Uzyskane dane krzywej siły przedstawiono na rys. 7 i, zgodnie z oczekiwaniami, krzywe rozszerzalności i ściskania obu odcisków są niemal identyczne, co podkreśla wysoką elastyczność rozgałęzionej struktury szczotkowej polimeru.
Dwie krzywe siły wciskania w tym samym miejscu na powierzchni lehfilcon A CL wskazują na idealną elastyczność powierzchni soczewki.
Na podstawie informacji uzyskanych z obrazów SEM i STEM, odpowiednio końcówki sondy i powierzchni Lehfilcon A CL, model stożka-sfery stanowi racjonalne matematyczne odwzorowanie interakcji między końcówką sondy AFM a testowanym miękkim materiałem polimerowym. Ponadto, w przypadku tego modelu stożka-sfery, podstawowe założenia dotyczące właściwości sprężystych odciśniętego materiału są prawdziwe dla tego nowego materiału biomimetycznego i służą do ilościowego określenia modułu sprężystości.
Po kompleksowej ocenie metody nanoindentacji AFM i jej składników, w tym właściwości sondy wciskowej (kształt, rozmiar i sztywność sprężyny), czułości (szum tła i estymacja punktu styku) oraz modeli dopasowania danych (ilościowe pomiary modułu), zastosowano tę metodę. Scharakteryzowano dostępne komercyjnie próbki ultramiękkie w celu weryfikacji wyników ilościowych. Komercyjny hydrożel poliakrylamidowy (PAAM) o module sprężystości 1 kPa został przetestowany w warunkach uwodnionych przy użyciu sondy 140 nm. Szczegóły dotyczące testowania modułów i obliczeń podano w Informacjach uzupełniających. Wyniki wykazały, że średni zmierzony moduł wyniósł 0,92 kPa, a %RSD i odchylenie procentowe (%) od znanego modułu były mniejsze niż 10%. Wyniki te potwierdzają dokładność i powtarzalność metody nanoindentacji AFM zastosowanej w tej pracy do pomiaru modułów materiałów ultramiękkich. Powierzchnie próbek lehfilcon A CL i podłoża bazowego SiHy zostały dodatkowo scharakteryzowane przy użyciu tej samej metody nanoindentacji AFM w celu zbadania pozornego modułu sprężystości powierzchni ultramiękkiej w funkcji głębokości wciskania. Krzywe rozdzielenia siły wciskania wygenerowano dla trzech próbek każdego typu (n = 3; jedno wciskanie na próbkę) przy sile 300 pN, prędkości 1 µm/s i pełnym uwodnieniu. Krzywą podziału siły wciskania aproksymowano za pomocą modelu stożkowo-sferycznego. Aby uzyskać moduł zależny od głębokości wciskania, odcinek krzywej siły o szerokości 40 nm ustawiano co 20 nm, zaczynając od punktu styku, a wartości modułu mierzono na każdym etapie krzywej siły. Spin Cy i in. Podobne podejście zostało zastosowane do scharakteryzowania gradientu modułu szczotki polimeru poli(laurylometakrylanu) (P12MA) przy użyciu nanoindentacji sondy koloidalnej AFM i są one zgodne z danymi uzyskanymi przy użyciu modelu kontaktu Hertza. To podejście zapewnia wykres pozornego modułu kontaktu (kPa) w funkcji głębokości wciskania (nm), jak pokazano na rysunku 8, który ilustruje pozorny moduł kontaktu/gradient głębokości. Obliczony moduł sprężystości próbki CL lehfilcon A mieści się w zakresie 2–3 kPa w górnych 100 nm próbki, po przekroczeniu którego zaczyna wzrastać wraz z głębokością. Z drugiej strony, podczas badania podłoża bazowego SiHy bez szczotkowej warstwy na powierzchni, maksymalna głębokość wciskania osiągnięta przy sile 300 pN jest mniejsza niż 50 nm, a wartość modułu uzyskana z danych wynosi około 400 kPa, co jest porównywalne z wartościami modułu Younga dla materiałów masowych.
Moduł pozornego kontaktu (kPa) w funkcji głębokości wciśnięcia (nm) dla podłoży Lehfilcon A CL i SiHy przy użyciu metody nanoindentacji AFM z geometrią stożka i kuli do pomiaru modułu.
Górna powierzchnia nowej biomimetycznej struktury szczotki z rozgałęzionego polimeru charakteryzuje się wyjątkowo niskim modułem sprężystości (2–3 kPa). Będzie on odpowiadał swobodnie zwisającemu końcowi rozwidlonej szczotki polimerowej, jak pokazano na obrazie STEM. Chociaż istnieją pewne dowody na gradient modułu sprężystości na zewnętrznej krawędzi struktury szczotki polimerowej, główny substrat o wysokim module sprężystości ma większy wpływ. Jednak górne 100 nm powierzchni znajduje się w granicach 20% całkowitej długości rozgałęzionej szczotki polimerowej, dlatego można założyć, że zmierzone wartości modułu sprężystości w tym zakresie głębokości wgłębienia są stosunkowo dokładne i nie zależą silnie od wpływu dolnego obiektu.
Ze względu na unikalną biomimetyczną konstrukcję soczewek kontaktowych Lehfilcon A, składających się z rozgałęzionych struktur szczotek polimerowych PMPC szczepionych na powierzchni podłoży SiHy, bardzo trudno jest wiarygodnie scharakteryzować właściwości mechaniczne ich struktur powierzchniowych za pomocą tradycyjnych metod pomiarowych. W niniejszym artykule przedstawiamy zaawansowaną metodę nanoindentacji AFM, służącą do dokładnej charakterystyki ultramiękkich materiałów, takich jak Lehfilcon A, o wysokiej zawartości wody i wyjątkowo wysokiej elastyczności. Metoda ta opiera się na zastosowaniu sondy AFM, której rozmiar i geometria końcówki są starannie dobrane do wymiarów strukturalnych ultramiękkich cech powierzchni, które mają zostać odciśnięte. Takie połączenie wymiarów sondy i struktury zapewnia zwiększoną czułość, umożliwiając pomiar niskiego modułu sprężystości i naturalnych właściwości sprężystych rozgałęzionych elementów szczotek polimerowych, niezależnie od efektów poroelastycznych. Wyniki pokazały, że unikalne rozgałęzione szczoteczki polimerowe PMPC, charakterystyczne dla powierzchni soczewki, charakteryzowały się wyjątkowo niskim modułem sprężystości (do 2 kPa) i bardzo wysoką elastycznością (prawie 100%) podczas badań w środowisku wodnym. Wyniki nanoindentacji AFM pozwoliły nam również scharakteryzować pozorny gradient modułu sprężystości/głębokości (30 kPa/200 nm) powierzchni soczewki biomimetycznej. Gradient ten może wynikać z różnicy modułów sprężystości między rozgałęzionymi szczotkami polimerowymi a podłożem SiHy, rozgałęzionej struktury/gęstości szczotków polimerowych lub ich kombinacji. Konieczne są jednak dalsze, pogłębione badania, aby w pełni zrozumieć związek między strukturą a właściwościami, a zwłaszcza wpływ rozgałęzienia szczotki na właściwości mechaniczne. Podobne pomiary mogą pomóc w scharakteryzowaniu właściwości mechanicznych powierzchni innych ultramiękkich materiałów i wyrobów medycznych.
Zestawy danych wygenerowane i/lub przeanalizowane w trakcie niniejszego badania są dostępne u ich autorów na uzasadnione żądanie.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Reakcje biologiczne na właściwości fizyczne i chemiczne powierzchni biomateriałów. Chemical. Society. Red. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Ulepszanie biomateriałów pochodzenia ludzkiego do inżynierii tkankowej. programowanie. polimer. nauka. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. i in. Projektowanie, wdrożenie kliniczne i odpowiedź immunologiczna biomateriałów w medycynie regeneracyjnej. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Ulepszona metoda określania twardości i modułu sprężystości z wykorzystaniem eksperymentów wciskania z pomiarami obciążenia i przemieszczenia. J. Alma mater. zbiornik magazynowy. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historyczne początki badania twardości metodą wciskania. Alma Mater. Nauka. Technologie. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Pomiary twardości metodą wciskania w skali makro-, mikro- i nano: krytyczny przegląd. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Błędy wykrywania powierzchni prowadzą do przeszacowania modułu w nanoindentacji miękkich materiałów. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu. Ocena metody nanoindentacji do określania właściwości mechanicznych heterogenicznych nanokompozytów z wykorzystaniem metod eksperymentalnych i obliczeniowych. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR i Owart, TS Charakterystyka mechaniczna miękkich żeli lepkosprężystych poprzez analizę odwrotnych elementów skończonych opartą na wciskaniu i optymalizacji. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optymalizacja wyznaczania lepkosprężystości z wykorzystaniem kompatybilnych systemów pomiarowych. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentacja powierzchni polimerowych. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Charakterystyka lepkosprężystych właściwości mechanicznych wysoce elastycznych polimerów i tkanek biologicznych z wykorzystaniem wciskania uderzeniowego. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Ocena modułu sprężystości i pracy adhezji miękkich materiałów z wykorzystaniem rozszerzonej metody Borodicha-Galanowa (BG) i głębokiego wciskania. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. i in. Morfologia w skali nano i właściwości mechaniczne biomimetycznych powierzchni polimerowych soczewek kontaktowych z hydrożelu silikonowego. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).