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Con el desarrollo de nuevos materiales ultrasuaves para dispositivos médicos y aplicaciones biomédicas, la caracterización integral de sus propiedades físicas y mecánicas es a la vez importante y desafiante.Se aplicó una técnica de nanoindentación de microscopía de fuerza atómica (AFM) modificada para caracterizar el módulo de superficie extremadamente bajo de la nueva lente de contacto de hidrogel de silicona biomimética lehfilcon, recubierta con una capa de estructuras de cepillo de polímero ramificado.Este método permite la determinación precisa de los puntos de contacto sin los efectos de la extrusión viscosa al acercarse a polímeros ramificados.Además, permite determinar las características mecánicas de elementos individuales del cepillo sin el efecto de la poroelasticidad.Esto se logra seleccionando una sonda AFM con un diseño (tamaño de punta, geometría y índice de resorte) que sea particularmente adecuado para medir las propiedades de materiales blandos y muestras biológicas.Este método mejora la sensibilidad y la precisión para una medición precisa del material muy blando lehfilcon A, que tiene un módulo de elasticidad extremadamente bajo en el área de la superficie (hasta 2 kPa) y una elasticidad extremadamente alta en el ambiente acuoso interno (casi 100%). .Los resultados del estudio de la superficie no sólo revelaron las propiedades de superficie ultrasuave de la lente lehfilcon A, sino que también mostraron que el módulo de los cepillos de polímero ramificado era comparable al del sustrato de silicio-hidrógeno.Esta técnica de caracterización de superficies se puede aplicar a otros materiales ultrasuaves y dispositivos médicos.
Las propiedades mecánicas de los materiales diseñados para el contacto directo con tejidos vivos suelen estar determinadas por el entorno biológico.La combinación perfecta de las propiedades de estos materiales ayuda a lograr las características clínicas deseadas del material sin causar respuestas celulares adversas1,2,3.Para materiales homogéneos a granel, la caracterización de las propiedades mecánicas es relativamente fácil debido a la disponibilidad de procedimientos y métodos de prueba estándar (por ejemplo, microindentación4,5,6).Sin embargo, para materiales ultrablandos como geles, hidrogeles, biopolímeros, células vivas, etc., estos métodos de prueba generalmente no son aplicables debido a las limitaciones de resolución de las mediciones y la falta de homogeneidad de algunos materiales7.A lo largo de los años, los métodos tradicionales de indentación se han modificado y adaptado para caracterizar una amplia gama de materiales blandos, pero muchos métodos todavía adolecen de graves deficiencias que limitan su uso8,9,10,11,12,13.La falta de métodos de prueba especializados que puedan caracterizar de manera precisa y confiable las propiedades mecánicas de los materiales superblandos y las capas superficiales limita severamente su uso en diversas aplicaciones.
En nuestro trabajo anterior, presentamos la lente de contacto lehfilcon A (CL), un material suave y heterogéneo con todas las propiedades de superficie ultrasuave derivadas de diseños potencialmente biomiméticos inspirados en la superficie de la córnea del ojo.Este biomaterial se desarrolló injertando una capa de polímero ramificado y reticulado de poli (2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) en un hidrogel de silicona (SiHy) 15 diseñado para dispositivos médicos.Este proceso de injerto crea una capa en la superficie que consiste en una estructura de cepillo polimérico ramificado muy suave y altamente elástico.Nuestro trabajo anterior ha confirmado que la estructura biomimética de lehfilcon A CL proporciona propiedades superficiales superiores, como una mejor prevención de humectación y suciedad, mayor lubricidad y reducción de la adhesión celular y bacteriana15,16.Además, el uso y desarrollo de este material biomimético también sugiere una mayor expansión a otros dispositivos biomédicos.Por lo tanto, es fundamental caracterizar las propiedades de la superficie de este material ultrablando y comprender su interacción mecánica con el ojo para crear una base de conocimientos integral que respalde futuros desarrollos y aplicaciones.La mayoría de las lentes de contacto de SiHy disponibles comercialmente están compuestas de una mezcla homogénea de polímeros hidrófilos e hidrófobos que forman una estructura material uniforme17.Se han realizado varios estudios para investigar sus propiedades mecánicas utilizando métodos tradicionales de prueba de compresión, tracción y microindentación18,19,20,21.Sin embargo, el novedoso diseño biomimético de lehfilcon A CL lo convierte en un material heterogéneo único en el que las propiedades mecánicas de las estructuras del cepillo de polímero ramificado difieren significativamente de las del sustrato base de SiHy.Por lo tanto, es muy difícil cuantificar con precisión estas propiedades utilizando métodos convencionales y de indentación.Un método prometedor utiliza el método de prueba de nanoindentación implementado en microscopía de fuerza atómica (AFM), un método que se ha utilizado para determinar las propiedades mecánicas de materiales viscoelásticos blandos, como células y tejidos biológicos, así como polímeros blandos22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.En la nanoindentación AFM, los fundamentos de las pruebas de nanoindentación se combinan con los últimos avances en la tecnología AFM para proporcionar una mayor sensibilidad de medición y pruebas de una amplia gama de materiales inherentemente superblandos31,32,33,34,35,36.Además, la tecnología ofrece otras ventajas importantes mediante el uso de diferentes geometrías.penetrador y sonda y la posibilidad de realizar pruebas en diversos medios líquidos.
La nanoindentación AFM se puede dividir condicionalmente en tres componentes principales: (1) equipos (sensores, detectores, sondas, etc.);(2) parámetros de medición (como fuerza, desplazamiento, velocidad, tamaño de rampa, etc.);(3) Procesamiento de datos (corrección de línea de base, estimación de puntos de contacto, ajuste de datos, modelado, etc.).Un problema importante con este método es que varios estudios en la literatura que utilizan nanoindentación AFM reportan resultados cuantitativos muy diferentes para el mismo tipo de muestra/célula/material37,38,39,40,41.Por ejemplo, Lekka et al.Se estudió y comparó la influencia de la geometría de la sonda AFM en el módulo de Young medido de muestras de hidrogel mecánicamente homogéneo y células heterogéneas.Informan que los valores del módulo dependen en gran medida de la selección del voladizo y la forma de la punta, siendo el valor más alto para una sonda en forma de pirámide y el valor más bajo de 42 para una sonda esférica.De manera similar, Selhuber-Unkel et al.Se ha demostrado cómo la velocidad del penetrador, el tamaño del penetrador y el espesor de las muestras de poliacrilamida (PAAM) afectan el módulo de Young medido mediante nanoindentación ACM43.Otro factor que complica la situación es la falta de materiales de prueba estándar de módulo extremadamente bajo y de procedimientos de prueba gratuitos.Esto hace que sea muy difícil obtener resultados precisos con confianza.Sin embargo, el método es muy útil para mediciones relativas y evaluaciones comparativas entre tipos de muestras similares, por ejemplo usando nanoindentación AFM para distinguir células normales de células cancerosas 44, 45.
Al probar materiales blandos con nanoindentación AFM, una regla general es usar una sonda con una constante de resorte baja (k) que coincida estrechamente con el módulo de la muestra y una punta semiesférica/redonda para que la primera sonda no perfore las superficies de la muestra en Primer contacto con materiales blandos.También es importante que la señal de desviación generada por la sonda sea lo suficientemente fuerte como para ser detectada por el sistema detector láser24,34,46,47.En el caso de células, tejidos y geles heterogéneos ultrasuaves, otro desafío es superar la fuerza adhesiva entre la sonda y la superficie de la muestra para garantizar mediciones reproducibles y confiables48,49,50.Hasta hace poco, la mayor parte del trabajo sobre nanoindentación AFM se ha centrado en el estudio del comportamiento mecánico de células, tejidos, geles, hidrogeles y biomoléculas biológicas utilizando sondas esféricas relativamente grandes, comúnmente denominadas sondas coloidales (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Estas puntas tienen un radio de 1 a 50 µm y comúnmente están hechas de vidrio de borosilicato, polimetacrilato de metilo (PMMA), poliestireno (PS), dióxido de silicio (SiO2) y diamante. como el carbono (DLC).Aunque la nanoindentación CP-AFM suele ser la primera opción para la caracterización de muestras blandas, tiene sus propios problemas y limitaciones.El uso de puntas esféricas grandes, del tamaño de una micra, aumenta el área total de contacto de la punta con la muestra y da como resultado una pérdida significativa de resolución espacial.Para muestras blandas y no homogéneas, donde las propiedades mecánicas de los elementos locales pueden diferir significativamente del promedio en un área más amplia, la indentación CP puede ocultar cualquier falta de homogeneidad en las propiedades a escala local52.Las sondas coloidales generalmente se fabrican uniendo esferas coloidales del tamaño de una micra a voladizos sin punta utilizando adhesivos epoxi.El proceso de fabricación en sí está plagado de muchos problemas y puede provocar inconsistencias en el proceso de calibración de la sonda.Además, el tamaño y la masa de las partículas coloidales afectan directamente los principales parámetros de calibración del voladizo, como la frecuencia de resonancia, la rigidez del resorte y la sensibilidad a la deflexión56,57,58.Por lo tanto, los métodos comúnmente utilizados para sondas AFM convencionales, como la calibración de temperatura, pueden no proporcionar una calibración precisa para CP, y es posible que se requieran otros métodos para realizar estas correcciones57, 59, 60, 61. Los experimentos típicos de indentación de CP utilizan grandes desviaciones en voladizo para estudian las propiedades de muestras blandas, lo que crea otro problema al calibrar el comportamiento no lineal del voladizo con desviaciones relativamente grandes62,63,64.Los métodos modernos de indentación de sonda coloidal generalmente tienen en cuenta la geometría del voladizo utilizado para calibrar la sonda, pero ignoran la influencia de las partículas coloidales, lo que crea una incertidumbre adicional en la precisión del método38,61.De manera similar, los módulos elásticos calculados mediante el ajuste del modelo de contacto dependen directamente de la geometría de la sonda de indentación, y la falta de coincidencia entre las características de la punta y la superficie de la muestra puede generar imprecisiones27, 65, 66, 67, 68. Algunos trabajos recientes de Spencer et al.Se destacan los factores que se deben tener en cuenta al caracterizar cepillos de polímeros blandos utilizando el método de nanoindentación CP-AFM.Informaron que la retención de un fluido viscoso en cepillos de polímero en función de la velocidad da como resultado un aumento en la carga del cabezal y, por lo tanto, diferentes mediciones de las propiedades dependientes de la velocidad30,69,70,71.
En este estudio, hemos caracterizado el módulo de superficie del material ultrasuave y altamente elástico lehfilcon A CL utilizando un método de nanoindentación AFM modificado.Dadas las propiedades y la nueva estructura de este material, el rango de sensibilidad del método de indentación tradicional es claramente insuficiente para caracterizar el módulo de este material extremadamente blando, por lo que es necesario utilizar un método de nanoindentación AFM con mayor y menor sensibilidad.nivel.Después de revisar las deficiencias y los problemas de las técnicas de nanoindentación con sonda AFM coloidal existentes, mostramos por qué elegimos una sonda AFM más pequeña y diseñada a medida para eliminar la sensibilidad, el ruido de fondo, señalar el punto de contacto y medir el módulo de velocidad de materiales heterogéneos blandos, como la retención de líquidos. dependencia.y cuantificación precisa.Además, pudimos medir con precisión la forma y las dimensiones de la punta de indentación, lo que nos permitió utilizar el modelo de ajuste de cono-esfera para determinar el módulo de elasticidad sin evaluar el área de contacto de la punta con el material.Los dos supuestos implícitos que se cuantifican en este trabajo son las propiedades totalmente elásticas del material y el módulo de indentación independiente de la profundidad.Usando este método, primero probamos estándares ultrasuaves con un módulo conocido para cuantificar el método y luego usamos este método para caracterizar las superficies de dos materiales de lentes de contacto diferentes.Se espera que este método de caracterización de superficies de nanoindentación AFM con mayor sensibilidad sea aplicable a una amplia gama de materiales ultrablandos heterogéneos biomiméticos con uso potencial en dispositivos médicos y aplicaciones biomédicas.
Para los experimentos de nanoindentación se eligieron lentes de contacto Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EE. UU.) y sus sustratos de hidrogel de silicona.En el experimento se utilizó una montura de lente especialmente diseñada.Para instalar la lente para la prueba, se colocó con cuidado sobre el soporte en forma de cúpula, asegurándose de que no entraran burbujas de aire, y luego se fijó con los bordes.Un orificio en el dispositivo en la parte superior del soporte de la lente brinda acceso al centro óptico de la lente para experimentos de nanoindentación mientras mantiene el líquido en su lugar.Esto mantiene las lentes completamente hidratadas.Como solución de prueba se utilizaron 500 µl de solución de envasado para lentes de contacto.Para verificar los resultados cuantitativos, se prepararon hidrogeles de poliacrilamida no activada (PAAM) disponibles comercialmente a partir de una composición de poliacrilamida-cometileno-bisacrilamida (placas Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EE. UU.), un módulo elástico conocido de 1 kPa.Utilice 4-5 gotas (aproximadamente 125 µl) de solución salina tamponada con fosfato (PBS de Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EE. UU.) y 1 gota de solución para lentes de contacto OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EE. UU.).) en la interfaz hidrogel-sonda AFM.
Las muestras de sustratos Lehfilcon A CL y SiHy se visualizaron utilizando un sistema de microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FEG SEM) FEI Quanta 250 equipado con un detector de microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM).Para preparar las muestras, primero se lavaron las lentes con agua y se cortaron en trozos con forma de tarta.Para lograr un contraste diferencial entre los componentes hidrofílicos e hidrofóbicos de las muestras, se utilizó como colorante una solución estabilizada de RuO4 al 0,10%, en la que se sumergieron las muestras durante 30 min.La tinción con lehfilcon A CL RuO4 es importante no solo para lograr un contraste diferencial mejorado, sino que también ayuda a preservar la estructura de los cepillos de polímero ramificados en su forma original, que luego son visibles en las imágenes STEM.Luego se lavaron y deshidrataron en una serie de mezclas de etanol/agua con una concentración creciente de etanol.Luego, las muestras se moldearon con epoxi EMBed 812/Araldite, que curó durante la noche a 70°C.Los bloques de muestra obtenidos mediante polimerización de resina se cortaron con un ultramicrótomo y las secciones delgadas resultantes se visualizaron con un detector STEM en modo de bajo vacío a un voltaje de aceleración de 30 kV.Se utilizó el mismo sistema SEM para la caracterización detallada de la sonda AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Bárbara, CA, EE. UU.).Las imágenes SEM de la sonda AFM se obtuvieron en un modo típico de alto vacío con un voltaje de aceleración de 30 kV.Adquiera imágenes en diferentes ángulos y aumentos para registrar todos los detalles de la forma y el tamaño de la punta de la sonda AFM.Todas las dimensiones de la punta de interés en las imágenes se midieron digitalmente.
Se utilizó un microscopio de fuerza atómica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Bárbara, CA, EE. UU.) con modo "PeakForce QNM in Fluid" para visualizar y nanoindentar muestras de lehfilcon A CL, sustrato SiHy y hidrogel PAAm.Para los experimentos de imágenes, se utilizó una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) con un radio de punta nominal de 1 nm para capturar imágenes de alta resolución de la muestra a una velocidad de escaneo de 0,50 Hz.Todas las imágenes fueron tomadas en solución acuosa.
Los experimentos de nanoindentación AFM se llevaron a cabo utilizando una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).La sonda AFM tiene una punta de silicio en un voladizo de nitruro de 345 nm de espesor, 54 µm de largo y 4,5 µm de ancho con una frecuencia de resonancia de 45 kHz.Está diseñado específicamente para caracterizar y realizar mediciones nanomecánicas cuantitativas en muestras biológicas blandas.Los sensores se calibran individualmente en fábrica con ajustes de resorte precalibrados.Las constantes de resorte de las sondas utilizadas en este estudio estuvieron en el rango de 0,05 a 0,1 N/m.Para determinar con precisión la forma y el tamaño de la punta, la sonda se caracterizó en detalle mediante SEM.En la fig.La Figura 1a muestra una micrografía electrónica de barrido de alta resolución y bajo aumento de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que proporciona una vista holística del diseño de la sonda.En la fig.1b muestra una vista ampliada de la parte superior de la punta de la sonda, proporcionando información sobre la forma y el tamaño de la punta.En el extremo, la aguja es un hemisferio de unos 140 nm de diámetro (Fig. 1c).Debajo de esto, la punta se estrecha hasta adquirir una forma cónica, alcanzando una longitud medida de aproximadamente 500 nm.Fuera de la región ahusada, la punta es cilíndrica y termina en una longitud total de punta de 1,18 µm.Esta es la parte funcional principal de la punta de la sonda.Además, para las pruebas también se utilizó como sonda coloidal una sonda esférica grande de poliestireno (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EE. UU.) con un diámetro de punta de 45 µm y una constante de resorte de 2 N/m.con sonda PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm para comparación.
Se ha informado que el líquido puede quedar atrapado entre la sonda AFM y la estructura del cepillo de polímero durante la nanoindentación, lo que ejercerá una fuerza hacia arriba sobre la sonda AFM antes de que realmente toque la superficie69.Este efecto de extrusión viscosa debido a la retención de fluidos puede cambiar el punto de contacto aparente, afectando así las mediciones del módulo de superficie.Para estudiar el efecto de la geometría de la sonda y la velocidad de indentación en la retención de líquidos, se trazaron curvas de fuerza de indentación para muestras de lehfilcon A CL utilizando una sonda de 140 nm de diámetro a velocidades de desplazamiento constantes de 1 µm/s y 2 µm/s.diámetro de la sonda 45 µm, ajuste de fuerza fija 6 nN logrado a 1 µm/s.Se llevaron a cabo experimentos con una sonda de 140 nm de diámetro a una velocidad de indentación de 1 µm/s y una fuerza establecida de 300 pN, elegida para crear una presión de contacto dentro del rango fisiológico (1–8 kPa) del párpado superior.presión 72. Se probaron muestras blandas preparadas de hidrogel PAA con una presión de 1 kPa para una fuerza de indentación de 50 pN a una velocidad de 1 μm/s usando una sonda con un diámetro de 140 nm.
Dado que la longitud de la parte cónica de la punta de la sonda PFQNM-LC-A-CAL es de aproximadamente 500 nm, para cualquier profundidad de indentación < 500 nm se puede asumir con seguridad que la geometría de la sonda durante la indentación permanecerá fiel a su forma de cono.Además, se supone que la superficie del material bajo prueba exhibirá una respuesta elástica reversible, que también se confirmará en las siguientes secciones.Por lo tanto, dependiendo de la forma y el tamaño de la punta, elegimos el modelo de ajuste cono-esfera desarrollado por Briscoe, Sebastian y Adams, que está disponible en el software del proveedor, para procesar nuestros experimentos de nanoindentación AFM (NanoScope).Software de análisis de datos de separación, Bruker) 73. El modelo describe la relación fuerza-desplazamiento F(δ) para un cono con un defecto en el vértice esférico.En la fig.La Figura 2 muestra la geometría de contacto durante la interacción de un cono rígido con una punta esférica, donde R es el radio de la punta esférica, a es el radio de contacto, b es el radio de contacto en el extremo de la punta esférica, δ es el radio de contacto.profundidad de sangría, θ es el medio ángulo del cono.La imagen SEM de esta sonda muestra claramente que la punta esférica de 140 nm de diámetro se fusiona tangencialmente en un cono, por lo que aquí b se define solo a través de R, es decir, b = R cos θ.El software proporcionado por el proveedor proporciona una relación cono-esfera para calcular los valores del módulo de Young (E) a partir de los datos de separación de fuerzas suponiendo a > b.Relación:
donde F es la fuerza de indentación, E es el módulo de Young, ν es la relación de Poisson.El radio de contacto a se puede estimar usando:
Esquema de la geometría de contacto de un cono rígido con una punta esférica presionado en el material de una lente de contacto Lefilcon con una capa superficial de cepillos de polímero ramificado.
Si a ≤ b, la relación se reduce a la ecuación de un penetrador esférico convencional;
Creemos que la interacción de la sonda de indentación con la estructura ramificada del cepillo de polímero PMPC hará que el radio de contacto a sea mayor que el radio de contacto esférico b.Por lo tanto, para todas las mediciones cuantitativas del módulo elástico realizadas en este estudio, utilizamos la dependencia obtenida para el caso a > b.
Se obtuvieron imágenes completas de los materiales biomiméticos ultrablandos estudiados en este estudio mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) de la sección transversal de la muestra y microscopía de fuerza atómica (AFM) de la superficie.Esta caracterización detallada de la superficie se realizó como una extensión de nuestro trabajo publicado anteriormente, en el que determinamos que la estructura de cepillo polimérico dinámicamente ramificada de la superficie lehfilcon A CL modificada con PMPC exhibía propiedades mecánicas similares al tejido corneal nativo 14.Por este motivo, nos referimos a las superficies de las lentes de contacto como materiales biomiméticos14.En la fig.3a,b muestran secciones transversales de estructuras de cepillos de polímero PMPC ramificados en la superficie de un sustrato de lehfilcon A CL y un sustrato de SiHy sin tratar, respectivamente.Las superficies de ambas muestras se analizaron más a fondo utilizando imágenes AFM de alta resolución, lo que confirmó aún más los resultados del análisis STEM (Fig. 3c, d).En conjunto, estas imágenes proporcionan una longitud aproximada de la estructura del cepillo de polímero ramificado de PMPC a 300-400 nm, lo cual es fundamental para interpretar las mediciones de nanoindentación de AFM.Otra observación clave derivada de las imágenes es que la estructura superficial general del material biomimético CL es morfológicamente diferente de la del material sustrato SiHy.Esta diferencia en la morfología de su superficie puede hacerse evidente durante su interacción mecánica con la sonda AFM de indentación y posteriormente en los valores de módulo medidos.
Imágenes STEM transversales de (a) lehfilcon A CL y (b) sustrato de SiHy.Barra de escala, 500 nm.Imágenes AFM de la superficie del sustrato lehfilcon A CL (c) y el sustrato base SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Los polímeros bioinspirados y las estructuras de cepillos poliméricos son inherentemente suaves y han sido ampliamente estudiados y utilizados en diversas aplicaciones biomédicas74,75,76,77.Por lo tanto, es importante utilizar el método de nanoindentación AFM, que puede medir de forma precisa y fiable sus propiedades mecánicas.Pero al mismo tiempo, las propiedades únicas de estos materiales ultrablandos, como un módulo de elasticidad extremadamente bajo, un alto contenido de líquido y una alta elasticidad, a menudo dificultan la elección del material, la forma y la forma adecuados de la sonda de indentación.tamaño.Esto es importante para que el penetrador no perfore la superficie blanda de la muestra, lo que daría lugar a errores al determinar el punto de contacto con la superficie y el área de contacto.
Para ello, es esencial una comprensión integral de la morfología de los materiales biomiméticos ultrablandos (lehfilcon A CL).La información sobre el tamaño y la estructura de los cepillos de polímero ramificado obtenidos mediante el método de obtención de imágenes proporciona la base para la caracterización mecánica de la superficie mediante técnicas de nanoindentación AFM.En lugar de sondas coloidales esféricas del tamaño de una micra, elegimos la sonda de nitruro de silicio PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) con un diámetro de punta de 140 nm, especialmente diseñada para el mapeo cuantitativo de las propiedades mecánicas de muestras biológicas 78, 79, 80. , 81, 82, 83, 84 La razón para utilizar sondas relativamente afiladas en comparación con las sondas coloidales convencionales puede explicarse por las características estructurales del material.Al comparar el tamaño de la punta de la sonda (~ 140 nm) con los cepillos de polímero ramificados en la superficie de CL lehfilcon A, que se muestra en la Fig. 3a, se puede concluir que la punta es lo suficientemente grande como para entrar en contacto directo con estas estructuras de cepillo, que reduce la posibilidad de que la punta los atraviese.Para ilustrar este punto, en la Fig. 4 se muestra una imagen STEM del lehfilcon A CL y la punta de sangría de la sonda AFM (dibujada a escala).
Esquema que muestra la imagen STEM de lehfilcon A CL y una sonda de indentación ACM (dibujada a escala).
Además, el tamaño de la punta de 140 nm es lo suficientemente pequeño como para evitar el riesgo de cualquiera de los efectos de extrusión pegajosos informados anteriormente para cepillos de polímero producidos mediante el método de nanoindentación CP-AFM69,71.Suponemos que debido a la forma especial de cono esférico y al tamaño relativamente pequeño de esta punta de AFM (Fig. 1), la naturaleza de la curva de fuerza generada por la nanoindentación lehfilcon A CL no dependerá de la velocidad de indentación o de la velocidad de carga/descarga. .Por tanto, no se ve afectado por efectos poroelásticos.Para probar esta hipótesis, se sangraron muestras de lehfilcon A CL con una fuerza máxima fija usando una sonda PFQNM-LC-A-CAL, pero a dos velocidades diferentes, y las curvas de fuerza de tracción y retracción resultantes se usaron para trazar la fuerza (nN). en separación (μm) se muestra en la Figura 5a.Está claro que las curvas de fuerza durante la carga y descarga se superponen completamente, y no hay evidencia clara de que la fuerza cortante a una profundidad de indentación cero aumente con la velocidad de indentación en la figura, lo que sugiere que los elementos individuales del cepillo se caracterizaron sin un efecto poroelástico.Por el contrario, los efectos de retención de fluidos (extrusión viscosa y efectos de poroelasticidad) son evidentes para la sonda AFM de 45 µm de diámetro a la misma velocidad de indentación y se resaltan por la histéresis entre las curvas de estiramiento y retracción, como se muestra en la Figura 5b.Estos resultados respaldan la hipótesis y sugieren que las sondas de 140 nm de diámetro son una buena opción para caracterizar superficies tan blandas.
curvas de fuerza de indentación de lehfilcon A CL usando ACM;(a) usar una sonda con un diámetro de 140 nm a dos velocidades de carga, demostrando la ausencia de un efecto poroelástico durante la indentación de la superficie;(b) utilizando sondas con un diámetro de 45 µm y 140 nm.s muestran los efectos de la extrusión viscosa y la poroelasticidad para sondas grandes en comparación con sondas más pequeñas.
Para caracterizar superficies ultrablandas, los métodos de nanoindentación AFM deben tener la mejor sonda para estudiar las propiedades del material en estudio.Además de la forma y el tamaño de la punta, la sensibilidad del sistema detector AFM, la sensibilidad a la desviación de la punta en el entorno de prueba y la rigidez del voladizo juegan un papel importante en la determinación de la precisión y confiabilidad de la nanoindentación.mediciones.Para nuestro sistema AFM, el límite de detección del detector sensible a la posición (PSD) es de aproximadamente 0,5 mV y se basa en la tasa de resorte precalibrada y la sensibilidad de deflexión del fluido calculada de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que corresponde a la sensibilidad de carga teórica.es inferior a 0,1 pN.Por lo tanto, este método permite medir una fuerza de indentación mínima ≤ 0,1 pN sin ningún componente de ruido periférico.Sin embargo, es casi imposible que un sistema AFM reduzca el ruido periférico a este nivel debido a factores como la vibración mecánica y la dinámica de fluidos.Estos factores limitan la sensibilidad general del método de nanoindentación AFM y también dan como resultado una señal de ruido de fondo de aproximadamente ≤ 10 pN.Para la caracterización de la superficie, se sangraron muestras de sustrato de lehfilcon A CL y SiHy en condiciones completamente hidratadas utilizando una sonda de 140 nm para la caracterización SEM, y las curvas de fuerza resultantes se superpusieron entre fuerza (pN) y presión.El gráfico de separación (μm) se muestra en la Figura 6a.En comparación con el sustrato base de SiHy, la curva de fuerza de lehfilcon A CL muestra claramente una fase de transición que comienza en el punto de contacto con el cepillo de polímero bifurcado y termina con un cambio brusco en la pendiente que marca el contacto de la punta con el material subyacente.Esta parte de transición de la curva de fuerza resalta el comportamiento verdaderamente elástico del cepillo de polímero ramificado en la superficie, como lo demuestra la curva de compresión que sigue de cerca la curva de tensión y el contraste en las propiedades mecánicas entre la estructura del cepillo y el material voluminoso de SiHy.Al comparar lefilcon.Separación de la longitud promedio de un cepillo de polímero ramificado en la imagen STEM del PCS (Fig. 3a) y su curva de fuerza a lo largo de la abscisa en la Fig. 3a.6a muestra que el método es capaz de detectar la punta y el polímero ramificado que llega a la parte superior de la superficie.Contacto entre estructuras de cepillos.Además, la estrecha superposición de las curvas de fuerza indica que no hay efecto de retención de líquido.En este caso, no hay absolutamente ninguna adherencia entre la aguja y la superficie de la muestra.Las secciones superiores de las curvas de fuerza de las dos muestras se superponen, reflejando la similitud de las propiedades mecánicas de los materiales del sustrato.
(a) Curvas de fuerza de nanoindentación AFM para sustratos lehfilcon A CL y sustratos SiHy, (b) curvas de fuerza que muestran la estimación del punto de contacto utilizando el método de umbral de ruido de fondo.
Para estudiar los detalles más finos de la curva de fuerza, la curva de tensión de la muestra de lehfilcon A CL se vuelve a trazar en la Fig. 6b con una fuerza máxima de 50 pN a lo largo del eje y.Este gráfico proporciona información importante sobre el ruido de fondo original.El ruido está en el rango de ±10 pN, que se utiliza para determinar con precisión el punto de contacto y calcular la profundidad de la indentación.Como se informa en la literatura, la identificación de los puntos de contacto es fundamental para evaluar con precisión las propiedades del material, como el módulo85.Un enfoque que implica el procesamiento automático de datos de curvas de fuerza ha demostrado un mejor ajuste entre el ajuste de datos y las mediciones cuantitativas para materiales blandos86.En este trabajo, nuestra elección de puntos de contacto es relativamente simple y objetiva, pero tiene sus limitaciones.Nuestro enfoque conservador para determinar el punto de contacto puede dar como resultado valores de módulo ligeramente sobreestimados para profundidades de indentación más pequeñas (<100 nm).El uso de detección de puntos de contacto basada en algoritmos y procesamiento de datos automatizado podría ser una continuación de este trabajo en el futuro para mejorar aún más nuestro método.Por lo tanto, para un ruido de fondo intrínseco del orden de ±10 pN, definimos el punto de contacto como el primer punto de datos en el eje x en la Figura 6b con un valor de ≥10 pN.Luego, de acuerdo con el umbral de ruido de 10 pN, una línea vertical al nivel de ~0,27 µm marca el punto de contacto con la superficie, después de lo cual la curva de estiramiento continúa hasta que el sustrato alcanza la profundidad de indentación de ~270 nm.Curiosamente, según el tamaño de las características del cepillo de polímero ramificado (300–400 nm) medidas mediante el método de imágenes, la profundidad de la sangría de la muestra CL lehfilcon A observada utilizando el método de umbral de ruido de fondo es de aproximadamente 270 nm, que está muy cerca de el tamaño de medición con STEM.Estos resultados confirman aún más la compatibilidad y aplicabilidad de la forma y el tamaño de la punta de la sonda AFM para la indentación de esta estructura de cepillo de polímero ramificado muy suave y altamente elástico.Estos datos también proporcionan pruebas sólidas que respaldan nuestro método de utilizar el ruido de fondo como umbral para identificar puntos de contacto.Por lo tanto, cualquier resultado cuantitativo obtenido del modelado matemático y del ajuste de la curva de fuerza debería ser relativamente preciso.
Las mediciones cuantitativas mediante métodos de nanoindentación AFM dependen completamente de los modelos matemáticos utilizados para la selección de datos y el análisis posterior.Por lo tanto, es importante considerar todos los factores relacionados con la elección del penetrador, las propiedades del material y la mecánica de su interacción antes de elegir un modelo en particular.En este caso, la geometría de la punta se caracterizó cuidadosamente mediante micrografías SEM (Fig. 1) y, según los resultados, la sonda de nanoindentación AFM de 140 nm de diámetro con un cono duro y una geometría de punta esférica es una buena opción para caracterizar muestras de lehfilcon A CL79. .Otro factor importante que debe evaluarse cuidadosamente es la elasticidad del material polimérico que se está probando.Aunque los datos iniciales de la nanoindentación (Figs. 5a y 6a) describen claramente las características de la superposición de las curvas de tensión y compresión, es decir, la recuperación elástica completa del material, es extremadamente importante confirmar la naturaleza puramente elástica de los contactos. .Con este fin, se realizaron dos indentaciones sucesivas en el mismo lugar de la superficie de la muestra de lehfilcon A CL a una velocidad de indentación de 1 µm/s en condiciones de hidratación total.Los datos de la curva de fuerza resultante se muestran en la fig.7 y, como era de esperar, las curvas de expansión y compresión de las dos impresiones son casi idénticas, destacando la alta elasticidad de la estructura del cepillo de polímero ramificado.
Dos curvas de fuerza de indentación en el mismo lugar de la superficie de lehfilcon A CL indican la elasticidad ideal de la superficie de la lente.
Según la información obtenida de imágenes SEM y STEM de la punta de la sonda y la superficie lehfilcon A CL, respectivamente, el modelo de cono-esfera es una representación matemática razonable de la interacción entre la punta de la sonda AFM y el material polimérico blando que se está probando.Además, para este modelo de cono-esfera, los supuestos fundamentales sobre las propiedades elásticas del material impreso son válidos para este nuevo material biomimético y se utilizan para cuantificar el módulo elástico.
Después de una evaluación exhaustiva del método de nanoindentación AFM y sus componentes, incluidas las propiedades de la sonda de indentación (forma, tamaño y rigidez del resorte), la sensibilidad (ruido de fondo y estimación del punto de contacto) y los modelos de ajuste de datos (mediciones cuantitativas del módulo), el método fue usado.caracterizar muestras ultrablandas disponibles comercialmente para verificar resultados cuantitativos.Se probó un hidrogel comercial de poliacrilamida (PAAM) con un módulo elástico de 1 kPa en condiciones hidratadas utilizando una sonda de 140 nm.Los detalles de las pruebas y los cálculos del módulo se proporcionan en la Información complementaria.Los resultados mostraron que el módulo promedio medido fue de 0,92 kPa, y el %RSD y el porcentaje (%) de desviación del módulo conocido fueron inferiores al 10%.Estos resultados confirman la precisión y reproducibilidad del método de nanoindentación AFM utilizado en este trabajo para medir los módulos de materiales ultrablandos.Las superficies de las muestras de lehfilcon A CL y el sustrato base SiHy se caracterizaron adicionalmente utilizando el mismo método de nanoindentación AFM para estudiar el módulo de contacto aparente de la superficie ultrablanda en función de la profundidad de la indentación.Se generaron curvas de separación de la fuerza de indentación para tres muestras de cada tipo (n = 3; una indentación por muestra) a una fuerza de 300 pN, una velocidad de 1 µm/s e hidratación completa.La curva de distribución de la fuerza de indentación se aproximó utilizando un modelo de cono-esfera.Para obtener el módulo dependiente de la profundidad de la indentación, se estableció una porción de 40 nm de ancho de la curva de fuerza en cada incremento de 20 nm a partir del punto de contacto, y se midieron los valores del módulo en cada paso de la curva de fuerza.Spin Cy et al.Se ha utilizado un enfoque similar para caracterizar el gradiente de módulo de los cepillos de polímero de poli (metacrilato de laurilo) (P12MA) utilizando nanoindentación con sonda AFM coloidal, y son consistentes con los datos que utilizan el modelo de contacto de Hertz.Este enfoque proporciona una gráfica del módulo de contacto aparente (kPa) versus la profundidad de indentación (nm), como se muestra en la Figura 8, que ilustra el módulo de contacto aparente/gradiente de profundidad.El módulo elástico calculado de la muestra CL lehfilcon A está en el rango de 2 a 3 kPa dentro de los 100 nm superiores de la muestra, más allá de los cuales comienza a aumentar con la profundidad.Por otro lado, cuando se prueba el sustrato base de SiHy sin una película similar a un cepillo en la superficie, la profundidad máxima de indentación lograda con una fuerza de 300 pN es inferior a 50 nm, y el valor del módulo obtenido a partir de los datos es de aproximadamente 400 kPa. , que es comparable a los valores del módulo de Young para materiales a granel.
Módulo de contacto aparente (kPa) frente a profundidad de indentación (nm) para sustratos lehfilcon A CL y SiHy utilizando el método de nanoindentación AFM con geometría de cono-esfera para medir el módulo.
La superficie superior de la nueva estructura de cepillo de polímero ramificado biomimético exhibe un módulo de elasticidad extremadamente bajo (2-3 kPa).Esto coincidirá con el extremo que cuelga libremente del cepillo de polímero bifurcado como se muestra en la imagen de STEM.Si bien hay cierta evidencia de un gradiente de módulo en el borde exterior del CL, el sustrato principal de alto módulo es más influyente.Sin embargo, los 100 nm superiores de la superficie están dentro del 20% de la longitud total del cepillo de polímero ramificado, por lo que es razonable suponer que los valores medidos del módulo en este rango de profundidad de indentación son relativamente precisos y no fuertemente Depende del efecto del objeto inferior.
Debido al diseño biomimético único de las lentes de contacto lehfilcon A, que consisten en estructuras de cepillo de polímero PMPC ramificadas injertadas en la superficie de sustratos de SiHy, es muy difícil caracterizar de manera confiable las propiedades mecánicas de sus estructuras superficiales utilizando métodos de medición tradicionales.Aquí presentamos un método avanzado de nanoindentación AFM para caracterizar con precisión materiales ultrablandos como lefilcon A con alto contenido de agua y elasticidad extremadamente alta.Este método se basa en el uso de una sonda AFM cuyo tamaño y geometría de punta se eligen cuidadosamente para que coincidan con las dimensiones estructurales de las características de la superficie ultrasuave que se van a imprimir.Esta combinación de dimensiones entre la sonda y la estructura proporciona una mayor sensibilidad, lo que nos permite medir el módulo bajo y las propiedades elásticas inherentes de los elementos de cepillo de polímero ramificado, independientemente de los efectos poroelásticos.Los resultados mostraron que los exclusivos cepillos de polímero PMPC ramificados característicos de la superficie de la lente tenían un módulo elástico extremadamente bajo (hasta 2 kPa) y una elasticidad muy alta (casi el 100 %) cuando se probaron en un ambiente acuoso.Los resultados de la nanoindentación AFM también nos permitieron caracterizar el módulo de contacto aparente/gradiente de profundidad (30 kPa/200 nm) de la superficie de la lente biomimética.Este gradiente puede deberse a la diferencia de módulo entre los cepillos de polímero ramificado y el sustrato de SiHy, o la estructura/densidad ramificada de los cepillos de polímero, o una combinación de los mismos.Sin embargo, se necesitan más estudios en profundidad para comprender completamente la relación entre estructura y propiedades, especialmente el efecto de la ramificación del cepillo sobre las propiedades mecánicas.Mediciones similares pueden ayudar a caracterizar las propiedades mecánicas de la superficie de otros materiales ultrasuaves y dispositivos médicos.
Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a través de los respectivos autores previa solicitud razonable.
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