Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo uporabo posodobljenega brskalnika (ali onemogočanje načina združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega za zagotovitev stalne podpore spletno mesto prikazujemo brez slogov in JavaScripta.
Prikaže vrtiljak treh diapozitivov hkrati. Za premikanje med tremi diapozitivi hkrati uporabite gumba Prejšnji in Naslednji ali pa drsnike na koncu za premikanje med tremi diapozitivi hkrati.
Z razvojem novih ultra mehkih materialov za medicinske pripomočke in biomedicinske aplikacije je celovita karakterizacija njihovih fizikalnih in mehanskih lastnosti pomembna in hkrati zahtevna. Za karakterizacijo izjemno nizkega površinskega modula nove biomimetične silikonske hidrogelne kontaktne leče lehfilcon A, prevlečene s plastjo razvejanih polimernih krtačastih struktur, je bila uporabljena modificirana tehnika nanoindentacije z atomsko silovno mikroskopijo (AFM). Ta metoda omogoča natančno določanje kontaktnih točk brez učinkov viskozne ekstruzije pri približevanju razvejanim polimerom. Poleg tega omogoča določanje mehanskih lastnosti posameznih krtačastih elementov brez učinka poroelastičnosti. To se doseže z izbiro AFM sonde z zasnovo (velikost konice, geometrija in trdota vzmeti), ki je še posebej primerna za merjenje lastnosti mehkih materialov in bioloških vzorcev. Ta metoda izboljša občutljivost in natančnost za natančno merjenje zelo mehkega materiala lehfilcon A, ki ima izjemno nizek modul elastičnosti na površini (do 2 kPa) in izjemno visoko elastičnost v notranjem (skoraj 100 %) vodnem okolju. Rezultati študije površine niso le razkrili ultra mehkih površinskih lastnosti leče lehfilcon A, temveč so tudi pokazali, da je modul razvejanih polimernih ščetk primerljiv z modulom silicijevega vodikovega substrata. To tehniko karakterizacije površine je mogoče uporabiti tudi za druge ultra mehke materiale in medicinske pripomočke.
Mehanske lastnosti materialov, zasnovanih za neposreden stik z živim tkivom, pogosto določa biološko okolje. Popolno ujemanje teh lastnosti materiala pomaga doseči želene klinične lastnosti materiala, ne da bi pri tem povzročilo neželene celične odzive1,2,3. Pri homogenih materialih v razsutem stanju je karakterizacija mehanskih lastnosti relativno enostavna zaradi razpoložljivosti standardnih postopkov in preskusnih metod (npr. mikroindentacija4,5,6). Vendar pa za ultra mehke materiale, kot so geli, hidrogeli, biopolimeri, žive celice itd., te preskusne metode na splošno niso uporabne zaradi omejitev ločljivosti meritev in nehomogenosti nekaterih materialov7. Z leti so bile tradicionalne metode vtiskovanja spremenjene in prilagojene za karakterizacijo širokega spektra mehkih materialov, vendar številne metode še vedno trpijo zaradi resnih pomanjkljivosti, ki omejujejo njihovo uporabo8,9,10,11,12,13. Pomanjkanje specializiranih preskusnih metod, ki bi lahko natančno in zanesljivo karakterizirale mehanske lastnosti super mehkih materialov in površinskih plasti, močno omejuje njihovo uporabo v različnih aplikacijah.
V našem prejšnjem delu smo predstavili kontaktno lečo lehfilcon A (CL), mehak heterogeni material z vsemi ultra mehkimi površinskimi lastnostmi, ki izhajajo iz potencialno biomimetičnih zasnov, navdihnjenih s površino roženice očesa. Ta biomaterial je bil razvit s cepljenjem razvejane, zamrežene polimerne plasti poli(2-metakriloiloksietilfosforilholina (MPC)) (PMPC) na silikonski hidrogel (SiHy) 15, zasnovan za medicinske pripomočke na osnovi. Ta postopek cepljenja ustvari plast na površini, ki jo sestavlja zelo mehka in zelo elastična razvejana polimerna krtačasta struktura. Naše prejšnje delo je potrdilo, da biomimetična struktura lehfilcon A CL zagotavlja vrhunske površinske lastnosti, kot so izboljšano preprečevanje omočenja in obraščanja, povečana mazljivost ter zmanjšana adhezija celic in bakterij 15,16. Poleg tega uporaba in razvoj tega biomimetičnega materiala nakazujeta tudi nadaljnjo širitev na druge biomedicinske naprave. Zato je ključnega pomena karakterizirati površinske lastnosti tega ultra mehkega materiala in razumeti njegovo mehansko interakcijo z očesom, da bi ustvarili celovito bazo znanja za podporo prihodnjemu razvoju in uporabi. Večina komercialno dostopnih kontaktnih leč SiHy je sestavljena iz homogene mešanice hidrofilnih in hidrofobnih polimerov, ki tvorijo enotno strukturo materiala17. Izvedenih je bilo več študij za raziskovanje njihovih mehanskih lastnosti z uporabo tradicionalnih metod kompresijskega, nateznega in mikrovdolbinskega testiranja18,19,20,21. Vendar pa nova biomimetična zasnova lehfilcon A CL iz njega naredi edinstven heterogeni material, pri katerem se mehanske lastnosti razvejanih polimernih krtačastih struktur bistveno razlikujejo od lastnosti osnovnega substrata SiHy. Zato je te lastnosti zelo težko natančno količinsko opredeliti z uporabo konvencionalnih metod in metod vdolbinskega testiranja. Obetavna metoda uporablja metodo nanovdolbinskega testiranja, ki se uporablja v mikroskopiji na atomsko silo (AFM), metodi, ki se uporablja za določanje mehanskih lastnosti mehkih viskoelastičnih materialov, kot so biološke celice in tkiva, pa tudi mehki polimeri22,23,24,25, ,26,27,28,29,30. Pri nanoindentaciji AFM so osnove nanoindentacijskega testiranja združene z najnovejšim napredkom v tehnologiji AFM, kar zagotavlja povečano občutljivost merjenja in testiranje širokega nabora inherentno supermehkih materialov31,32,33,34,35,36. Poleg tega tehnologija ponuja druge pomembne prednosti z uporabo različnih geometrij vtiskovalnika in sonde ter možnostjo testiranja v različnih tekočih medijih.
AFM nanoindentacijo lahko pogojno razdelimo na tri glavne komponente: (1) opremo (senzorje, detektorje, sonde itd.); (2) merilne parametre (kot so sila, premik, hitrost, velikost rampe itd.); (3) obdelavo podatkov (korekcija izhodiščne vrednosti, ocena točke dotika, prilagajanje podatkov, modeliranje itd.). Pomembna težava te metode je, da več študij v literaturi, ki uporabljajo AFM nanoindentacijo, poroča o zelo različnih kvantitativnih rezultatih za isti vzorec/celico/vrsto materiala37,38,39,40,41. Na primer, Lekka in sod. so preučevali in primerjali vpliv geometrije AFM sonde na izmerjeni Youngov modul vzorcev mehansko homogenega hidrogela in heterogenih celic. Poročajo, da so vrednosti modulov zelo odvisne od izbire konzole in oblike konice, pri čemer je najvišja vrednost za piramidno sondo in najnižja vrednost 42 za sferično sondo. Podobno so Selhuber-Unkel in sod. Pokazalo se je, kako hitrost vtiskovalnika, velikost vtiskovalnika in debelina vtiskovalnika vzorcev poliakrilamida (PAAM) vplivajo na Youngov modul, izmerjen z nanoindentacijo ACM43. Drug oteževalni dejavnik je pomanjkanje standardnih testnih materialov z izjemno nizkim modulom in brezplačnih testnih postopkov. Zaradi tega je zelo težko dobiti natančne rezultate z zaupanjem. Vendar pa je metoda zelo uporabna za relativne meritve in primerjalne ocene med podobnimi tipi vzorcev, na primer z uporabo nanoindentacije AFM za razlikovanje normalnih celic od rakavih celic 44, 45.
Pri testiranju mehkih materialov z AFM nanoindentacijo velja splošno pravilo, da se uporablja sonda z nizko konstanto vzmeti (k), ki se tesno ujema z modulom vzorca, in polkrogelno/okroglo konico, tako da prva sonda ob prvem stiku z mehkimi materiali ne prebode površin vzorca. Pomembno je tudi, da je signal odklona, ​​ki ga ustvari sonda, dovolj močan, da ga zazna laserski detektorski sistem24,34,46,47. V primeru ultra mehkih heterogenih celic, tkiv in gelov je še en izziv premagovanje adhezivne sile med sondo in površino vzorca, da se zagotovijo ponovljive in zanesljive meritve48,49,50. Do nedavnega se je večina dela na AFM nanoindentaciji osredotočala na preučevanje mehanskega obnašanja bioloških celic, tkiv, gelov, hidrogelov in biomolekul z uporabo relativno velikih sferičnih sond, ki jih običajno imenujemo koloidne sonde (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Te konice imajo polmer od 1 do 50 µm in so običajno izdelane iz borosilikatnega stekla, polimetilmetakrilata (PMMA), polistirena (PS), silicijevega dioksida (SiO2) in diamantu podobnega ogljika (DLC). Čeprav je nanoindentacija CP-AFM pogosto prva izbira za karakterizacijo mehkih vzorcev, ima svoje težave in omejitve. Uporaba velikih, mikronskih sferičnih konic poveča skupno kontaktno površino konice z vzorcem in povzroči znatno izgubo prostorske ločljivosti. Pri mehkih, nehomogenih vzorcih, kjer se mehanske lastnosti lokalnih elementov lahko bistveno razlikujejo od povprečja na širšem območju, lahko vtiskovanje CP prikrije morebitno nehomogenost lastnosti na lokalni ravni52. Koloidne sonde so običajno izdelane tako, da se koloidne kroglice mikronske velikosti pritrdijo na konzole brez konic z uporabo epoksidnih lepil. Sam proizvodni proces je poln številnih težav in lahko povzroči nedoslednosti v postopku kalibracije sonde. Poleg tega velikost in masa koloidnih delcev neposredno vplivata na glavne kalibracijske parametre konzole, kot so resonančna frekvenca, togost vzmeti in občutljivost na odklon56,57,58. Zato pogosto uporabljene metode za konvencionalne AFM sonde, kot je kalibracija temperature, morda ne zagotavljajo natančne kalibracije za CP, zato bodo za izvedbo teh popravkov morda potrebne druge metode57, 59, 60, 61. Tipični poskusi vtiskovanja CP uporabljajo konzolo z velikimi odstopanji za preučevanje lastnosti mehkih vzorcev, kar ustvarja še eno težavo pri kalibraciji nelinearnega obnašanja konzole pri relativno velikih odstopanjih62,63,64. Sodobne metode vtiskovanja koloidnih sond običajno upoštevajo geometrijo konzole, ki se uporablja za kalibracijo sonde, vendar ne upoštevajo vpliva koloidnih delcev, kar ustvarja dodatno negotovost glede natančnosti metode38,61. Podobno so elastični moduli, izračunani s prilagajanjem kontaktnega modela, neposredno odvisni od geometrije vdolbinske sonde, neskladje med značilnostmi konice in površine vzorca pa lahko povzroči netočnosti27, 65, 66, 67, 68. V nedavnem delu Spencerja in sodelavcev so poudarjeni dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri karakterizaciji mehkih polimernih ščetk z uporabo metode nanoindentacije CP-AFM. Poročali so, da zadrževanje viskozne tekočine v polimernih ščetkah kot funkcija hitrosti povzroči povečanje obremenitve glave in s tem različne meritve lastnosti, odvisnih od hitrosti30,69,70,71.
V tej študiji smo z uporabo modificirane metode AFM nanoindentacije karakterizirali površinski modul ultra mehkega visoko elastičnega materiala lehfilcon A CL. Glede na lastnosti in novo strukturo tega materiala je območje občutljivosti tradicionalne metode vtiskovanja očitno nezadostno za karakterizacijo modula tega izjemno mehkega materiala, zato je treba uporabiti metodo AFM nanoindentacije z višjo in nižjo stopnjo občutljivosti. Po pregledu pomanjkljivosti in težav obstoječih tehnik koloidne AFM nanoindentacije prikazujemo, zakaj smo izbrali manjšo, po meri zasnovano AFM sondo, da bi odpravili občutljivost, šum v ozadju, natančno določili točko stika, izmerili modul hitrosti mehkih heterogenih materialov, kot je odvisnost od zadrževanja tekočine, in natančno kvantificirali. Poleg tega smo lahko natančno izmerili obliko in dimenzije konice vtiskovanja, kar nam je omogočilo uporabo modela stožčasto-krogelnega prileganja za določitev modula elastičnosti brez ocenjevanja površine stika konice z materialom. Dve implicitni predpostavki, ki sta kvantificirani v tem delu, sta popolnoma elastične lastnosti materiala in modul, neodvisen od globine vtiskovanja. S to metodo smo najprej preizkusili ultra mehke standarde z znanim modulom, da bi kvantificirali metodo, nato pa smo to metodo uporabili za karakterizacijo površin dveh različnih materialov kontaktnih leč. Pričakuje se, da bo ta metoda karakterizacije površin AFM nanoindentacije s povečano občutljivostjo uporabna za širok spekter biomimetičnih heterogenih ultra mehkih materialov s potencialno uporabo v medicinskih pripomočkih in biomedicinskih aplikacijah.
Za poskuse z nanoindentacijo so bile izbrane kontaktne leče Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Teksas, ZDA) in njihovi silikonski hidrogelni substrati. V poskusu je bil uporabljen posebej zasnovan nosilec za leče. Za namestitev leče za testiranje je bila leča previdno nameščena na kupolasto stojalo, pri čemer je bilo treba paziti, da v notranjost ne pridejo zračni mehurčki, nato pa je bila pritrjena z robovi. Luknja v pritrdilnem elementu na vrhu držala za leče omogoča dostop do optičnega središča leče za poskuse z nanoindentacijo, hkrati pa tekočina ostane na mestu. To ohranja leče popolnoma hidrirane. Kot testna raztopina je bilo uporabljenih 500 μl raztopine za pakiranje kontaktnih leč. Za preverjanje kvantitativnih rezultatov so bili komercialno dostopni neaktivirani poliakrilamidni (PAAM) hidrogeli pripravljeni iz sestave poliakrilamid-ko-metilen-bisakrilamid (100 mm Petrisoft petrijevke, Matrigen, Irvine, Kalifornija, ZDA), z znanim elastičnim modulom 1 kPa. Na vmesnik med hidrogelom in sondo AFM kanite 4–5 kapljic (približno 125 µl) fosfatno puferirane fiziološke raztopine (PBS podjetja Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, ZDA) in 1 kapljico raztopine za kontaktne leče OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, ZDA).
Vzorce substratov Lehfilcon A CL in SiHy smo vizualizirali z uporabo sistema FEI Quanta 250 Field Emission Screening Electron Microscope (FEG SEM), opremljenega z detektorjem vrstičnega elektronskega mikroskopa (STEM). Za pripravo vzorcev smo leče najprej oprali z vodo in jih razrezali na kline v obliki pite. Za doseganje diferencialnega kontrasta med hidrofilnimi in hidrofobnimi komponentami vzorcev smo kot barvilo uporabili 0,10 % stabilizirano raztopino RuO4, v katero smo vzorce potopili za 30 minut. Barvanje z lehfilcon A CL RuO4 ni pomembno le za doseganje izboljšanega diferencialnega kontrasta, temveč pomaga tudi pri ohranjanju strukture razvejanih polimernih ščetk v njihovi prvotni obliki, ki so nato vidne na STEM slikah. Nato smo jih oprali in dehidrirali v seriji mešanic etanola/vode z naraščajočo koncentracijo etanola. Vzorce smo nato ulili z epoksidno smolo EMBed 812/Araldite, ki se je čez noč strdila pri 70 °C. Vzorčni bloki, pridobljeni s polimerizacijo smole, so bili razrezani z ultramikrotomom, nastali tanki rezi pa so bili vizualizirani s STEM detektorjem v načinu nizkega vakuuma pri pospeševalni napetosti 30 kV. Isti SEM sistem je bil uporabljen za podrobno karakterizacijo AFM sonde PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornija, ZDA). SEM slike AFM sonde so bile pridobljene v tipičnem načinu visokega vakuuma s pospeševalno napetostjo 30 kV. Slike so bile posnete pod različnimi koti in povečavami, da so bile zabeležene vse podrobnosti oblike in velikosti konice AFM sonde. Vse dimenzije konice, ki nas zanimajo na slikah, so bile digitalno izmerjene.
Za vizualizacijo in nanoindentacijo vzorcev lehfilcon A CL, SiHy substrata in hidrogela PAAm je bil uporabljen atomski silovni mikroskop Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornija, ZDA) z načinom »PeakForce QNM in Fluid«. Za slikovne poskuse je bila uporabljena sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) z nominalnim polmerom konice 1 nm za zajem visokoločljivostnih slik vzorca s hitrostjo skeniranja 0,50 Hz. Vse slike so bile posnete v vodni raztopini.
Poskusi AFM nanoindentacije so bili izvedeni z uporabo sonde PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Sonda AFM ima silicijev koniček na nitridni konzoli, debeline 345 nm, dolžine 54 µm in širine 4,5 µm, z resonančno frekvenco 45 kHz. Zasnovana je posebej za karakterizacijo in izvajanje kvantitativnih nanomehanskih meritev na mehkih bioloških vzorcih. Senzorji so individualno kalibrirani v tovarni s predhodno kalibriranimi nastavitvami vzmeti. Konstante vzmeti sond, uporabljenih v tej študiji, so bile v območju od 0,05 do 0,1 N/m. Za natančno določitev oblike in velikosti konice je bila sonda podrobno karakterizirana s SEM. Na sliki 1a je prikazana vrsta elektronskega mikrografije sonde PFQNM-LC-A-CAL z visoko ločljivostjo in majhno povečavo, ki zagotavlja celosten pogled na zasnovo sonde. Na sliki 1b je prikazan povečan pogled na vrh konice sonde, ki zagotavlja informacije o obliki in velikosti konice. Na skrajnem koncu je igla polobla s premerom približno 140 nm (slika 1c). Pod tem se konica zoži v stožčasto obliko in doseže izmerjeno dolžino približno 500 nm. Zunaj zoženega območja je konica valjasta in se konča s skupno dolžino konice 1,18 µm. To je glavni funkcionalni del konice sonde. Poleg tega je bila za testiranje kot koloidna sonda uporabljena tudi velika sferična polistirenska (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, ZDA) s premerom konice 45 µm in konstanto vzmeti 2 N/m, za primerjavo pa je bila uporabljena sonda PFQNM-LC-A-CAL 140 nm.
Poročali so, da se med nanoindentacijo lahko ujame tekočina med AFM sondo in polimerno krtačasto strukturo, kar bo na AFM sondo delovalo navzgor, še preden se dejansko dotakne površine69. Ta viskozni ekstruzijski učinek zaradi zadrževanja tekočine lahko spremeni navidezno točko stika in s tem vpliva na meritve modula površine. Za preučevanje vpliva geometrije sonde in hitrosti vtiskovanja na zadrževanje tekočine so bile krivulje sile vtiskovanja narisane za vzorce lehfilcon A CL z uporabo sonde s premerom 140 nm pri konstantnih hitrostih premika 1 µm/s in 2 µm/s. Premer sonde 45 µm, fiksna nastavitev sile 6 nN, dosežena pri 1 µm/s. Poskusi s sondo s premerom 140 nm so bili izvedeni pri hitrosti vtiskovanja 1 µm/s in nastavljeni sili 300 pN, izbrani tako, da ustvari kontaktni tlak znotraj fiziološkega območja (1–8 kPa) zgornje veke. tlak 72. Mehki, že pripravljeni vzorci hidrogela PAA s tlakom 1 kPa so bili preizkušeni na vtisno silo 50 pN pri hitrosti 1 μm/s z uporabo sonde s premerom 140 nm.
Ker je dolžina stožčastega dela konice sonde PFQNM-LC-A-CAL približno 500 nm, lahko za vsako globino vtiska < 500 nm varno predpostavimo, da bo geometrija sonde med vtiskom ostala zvesta svoji stožčasti obliki. Poleg tega se predpostavlja, da bo površina preizkušanega materiala kazala reverzibilen elastični odziv, kar bo potrjeno tudi v naslednjih razdelkih. Zato smo, odvisno od oblike in velikosti konice, za obdelavo naših poskusov AFM nanoindentacije (NanoScope) izbrali model prilagajanja stožca in krogle, ki so ga razvili Briscoe, Sebastian in Adams in je na voljo v programski opremi proizvajalca. Programska oprema za analizo ločitvenih podatkov, Bruker) 73. Model opisuje razmerje med silo in premikom F(δ) za stožec s sferično napako na vrhu. Na sliki ... Slika 2 prikazuje geometrijo stika med interakcijo togega stožca s sferično konico, kjer je R polmer sferične konice, a je polmer stika, b je polmer stika na koncu sferične konice, δ je polmer stika. Globina vdolbine, θ je polovični kot stožca. SEM slika te sonde jasno kaže, da se sferična konica s premerom 140 nm tangencialno združi v stožec, zato je tukaj b definiran le skozi R, tj. b = R cos θ. Programska oprema, ki jo dobavlja prodajalec, ponuja razmerje med stožcem in kroglo za izračun vrednosti Youngovega modula (E) iz podatkov o ločitvi sil, ob predpostavki, da je a > b. Razmerje:
kjer je F sila vtiskovanja, E Youngov modul, ν Poissonovo razmerje. Kontaktni polmer a lahko ocenimo z uporabo:
Shema kontaktne geometrije togega stožca s sferično konico, vtisnjeno v material kontaktne leče Lefilcon s površinsko plastjo razvejanih polimernih ščetk.
Če je a ≤ b, se relacija zreducira na enačbo za konvencionalni sferični vtiskovalnik;
Menimo, da bo interakcija vdolbinske sonde z razvejano strukturo polimerne ščetke PMPC povzročila, da bo kontaktni polmer a večji od sferičnega kontaktnega polmera b. Zato smo za vse kvantitativne meritve elastičnega modula, izvedene v tej študiji, uporabili odvisnost, dobljeno za primer a > b.
Ultramehki biomimetični materiali, ki smo jih proučevali v tej študiji, so bili celovito posneti z uporabo vrstične transmisijske elektronske mikroskopije (STEM) prečnega prereza vzorca in atomske silovne mikroskopije (AFM) površine. Ta podrobna karakterizacija površine je bila izvedena kot razširitev našega predhodno objavljenega dela, v katerem smo ugotovili, da dinamično razvejana polimerna krtačasta struktura površine PMPC-modificiranega lehfilcon A CL kaže podobne mehanske lastnosti kot naravno tkivo roženice 14. Zaradi tega površine kontaktnih leč imenujemo biomimetični materiali 14. Na sliki 3a in b sta prikazana prečna prereza razvejanih polimernih krtačastih struktur PMPC na površini substrata lehfilcon A CL oziroma neobdelanega SiHy substrata. Površini obeh vzorcev sta bili nadalje analizirani z uporabo visokoločljivostnih AFM slik, ki so dodatno potrdile rezultate STEM analize (slika 3c in d). Skupaj te slike prikazujejo približno dolžino razvejane polimerne krtačaste strukture PMPC pri 300–400 nm, kar je ključnega pomena za interpretacijo meritev AFM nanoindentacije. Druga ključna ugotovitev, pridobljena na podlagi slik, je, da se celotna površinska struktura biomimetičnega materiala CL morfološko razlikuje od strukture substratnega materiala SiHy. Ta razlika v njihovi površinski morfologiji se lahko pokaže med njihovo mehansko interakcijo z vdolbinsko AFM sondo in posledično v izmerjenih vrednostih modula.
Presečne STEM slike (a) lehfilcon A CL in (b) SiHy substrata. Merilna črta, 500 nm. AFM slike površine lehfilcon A CL substrata (c) in osnovnega SiHy substrata (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirirani polimeri in polimerne krtačaste strukture so že po naravi mehki in so bili široko preučevani ter uporabljeni v različnih biomedicinskih aplikacijah74,75,76,77. Zato je pomembno uporabiti metodo nanoindentacije AFM, ki lahko natančno in zanesljivo izmeri njihove mehanske lastnosti. Hkrati pa edinstvene lastnosti teh ultra mehkih materialov, kot so izjemno nizek modul elastičnosti, visoka vsebnost tekočine in visoka elastičnost, pogosto otežujejo izbiro pravega materiala, oblike in velikosti vdolbine. To je pomembno, da vdolbina ne prebode mehke površine vzorca, kar bi povzročilo napake pri določanju točke stika s površino in območja stika.
Za to je bistveno celovito razumevanje morfologije ultra mehkih biomimetičnih materialov (lehfilcon A CL). Informacije o velikosti in strukturi razvejanih polimernih ščetk, pridobljene z metodo slikanja, zagotavljajo osnovo za mehansko karakterizacijo površine z uporabo tehnik AFM nanoindentacije. Namesto sferičnih koloidnih sond mikronske velikosti smo izbrali sondo iz silicijevega nitrida PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) s premerom konice 140 nm, posebej zasnovano za kvantitativno kartiranje mehanskih lastnosti bioloških vzorcev 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Razlog za uporabo relativno ostrih sond v primerjavi s konvencionalnimi koloidnimi sondami je mogoče pojasniti s strukturnimi značilnostmi materiala. Če primerjamo velikost konice sonde (~140 nm) z razvejanimi polimernimi ščetkami na površini CL lehfilcon A, prikazanimi na sliki 3a, lahko sklepamo, da je konica dovolj velika, da pride v neposreden stik s temi ščetkastimi strukturami, kar zmanjša možnost, da bi konica prebodla skoznje. Za ponazoritev te točke je na sliki 4 prikazana STEM slika lehfilcon A CL in vdolbine konice AFM sonde (narisana v merilu).
Shematski prikaz STEM slike lehfilcon A CL in vdolbinske sonde ACM (narisano v merilu).
Poleg tega je velikost konice 140 nm dovolj majhna, da se izognemo tveganju za lepljive ekstruzijske učinke, o katerih smo že poročali pri polimernih ščetkah, izdelanih z metodo nanoindentacije CP-AFM69,71. Predvidevamo, da zaradi posebne stožčasto-sferične oblike in relativno majhne velikosti te konice AFM (slika 1) narava krivulje sile, ki jo ustvari nanoindentacija lehfilcon A CL, ne bo odvisna od hitrosti vtiskovanja ali hitrosti nalaganja/razbremenjevanja. Zato nanjo ne vplivajo poroelastični učinki. Za preizkus te hipoteze so bili vzorci lehfilcon A CL vtisnjeni s fiksno največjo silo z uporabo sonde PFQNM-LC-A-CAL, vendar pri dveh različnih hitrostih, nastale krivulje natezne in uvlečne sile pa so bile uporabljene za prikaz sile (nN) v razmiku (µm), kar je prikazano na sliki 5a. Jasno je, da se krivulje sile med obremenitvijo in razbremenitvijo popolnoma prekrivajo in da ni jasnih dokazov, da se strižna sila pri ničelni globini vtiska povečuje s hitrostjo vtiska na sliki, kar kaže na to, da so bili posamezni elementi ščetke okarakterizirani brez poroelastičnega učinka. Nasprotno pa so učinki zadrževanja tekočine (viskozna ekstruzija in učinki poroelastičnosti) očitni pri sondi AFM s premerom 45 µm pri enaki hitrosti vtiska in so poudarjeni s histerezo med krivuljama raztezanja in umika, kot je prikazano na sliki 5b. Ti rezultati podpirajo hipotezo in kažejo, da so sonde s premerom 140 nm dobra izbira za karakterizacijo takšnih mehkih površin.
Krivulje sile vtiskovanja lehfilcon A CL z uporabo ACM; (a) z uporabo sonde s premerom 140 nm pri dveh hitrostih obremenitve, ki dokazuje odsotnost poroelastičnega učinka med površinskim vtiskovanjem; (b) z uporabo sond s premerom 45 µm in 140 nm. s prikazujejo učinke viskozne ekstruzije in poroelastičnosti za velike sonde v primerjavi z manjšimi sondami.
Za karakterizacijo ultra mehkih površin morajo imeti metode AFM nanoindentacije najboljšo sondo za preučevanje lastnosti preučevanega materiala. Poleg oblike in velikosti konice imajo pomembno vlogo pri določanju natančnosti in zanesljivosti meritev nanoindentacije tudi občutljivost detektorskega sistema AFM, občutljivost na odklon konice v testnem okolju in togost konzole. Za naš sistem AFM je meja zaznavanja pozicijsko občutljivega detektorja (PSD) približno 0,5 mV in temelji na predhodno kalibrirani vzmetni trdnosti, izračunana občutljivost sonde PFQNM-LC-A-CAL na odklon tekočine pa je manjša od 0,1 pN. Zato ta metoda omogoča merjenje minimalne sile vtiskovanja ≤ 0,1 pN brez kakršne koli periferne komponente šuma. Vendar pa je za sistem AFM skoraj nemogoče zmanjšati periferni šum na to raven zaradi dejavnikov, kot so mehanske vibracije in dinamika tekočin. Ti dejavniki omejujejo splošno občutljivost metode AFM nanoindentacije in povzročijo tudi signal šuma v ozadju približno ≤ 10 pN. Za karakterizacijo površine so bili vzorci substrata lehfilcon A CL in SiHy v popolnoma hidriranih pogojih vdolbeni z uporabo 140 nm sonde za SEM karakterizacijo, nastale krivulje sile pa so bile preklopljene med silo (pN) in tlak. Ločitveni diagram (µm) je prikazan na sliki 6a. V primerjavi z osnovnim substratom SiHy krivulja sile lehfilcon A CL jasno kaže prehodno fazo, ki se začne na točki stika z viličasto polimerno ščetko in konča z ostro spremembo naklona, ​​ki označuje stik konice s podložnim materialom. Ta prehodni del krivulje sile poudarja resnično elastično obnašanje razvejane polimerne ščetke na površini, kar dokazuje krivulja stiskanja, ki tesno sledi krivulji napetosti, in kontrast v mehanskih lastnostih med strukturo ščetke in voluminoznim materialom SiHy. Pri primerjavi lefilcona. Ločitev povprečne dolžine razvejane polimerne ščetke na STEM sliki PCS (slika 3a) in njene krivulje sile vzdolž abscise na sliki 3a. Slika 6a kaže, da metoda zazna konico in razvejan polimer, ki dosežeta sam vrh površine. Stik med krtačnima strukturama. Poleg tega tesno prekrivanje krivulj sile kaže na odsotnost učinka zadrževanja tekočine. V tem primeru med iglo in površino vzorca ni absolutno nobene adhezije. Zgornji deli krivulj sile za oba vzorca se prekrivajo, kar odraža podobnost mehanskih lastnosti substratnih materialov.
(a) Krivulje sile AFM nanoindentacije za substrate lehfilcon A CL in substrate SiHy, (b) krivulje sile, ki prikazujejo oceno kontaktne točke z uporabo metode praga šuma ozadja.
Za preučevanje podrobnosti krivulje sile je na sliki 6b ponovno prikazana krivulja napetosti vzorca lehfilcon A CL z največjo silo 50 pN vzdolž osi y. Ta graf zagotavlja pomembne informacije o prvotnem šumu v ozadju. Šum je v območju ±10 pN, kar se uporablja za natančno določitev kontaktne točke in izračun globine vdolbine. Kot je navedeno v literaturi, je identifikacija kontaktnih točk ključnega pomena za natančno oceno lastnosti materiala, kot je modul85. Pristop, ki vključuje avtomatsko obdelavo podatkov krivulje sile, je pokazal izboljšano ujemanje med prilagajanjem podatkov in kvantitativnimi meritvami za mehke materiale86. V tem delu je naša izbira kontaktnih točk relativno preprosta in objektivna, vendar ima svoje omejitve. Naš konzervativen pristop k določanju kontaktne točke lahko povzroči nekoliko precenjene vrednosti modulov za manjše globine vdolbine (< 100 nm). Uporaba algoritmičnega zaznavanja kontaktnih točk in avtomatizirane obdelave podatkov bi lahko bila nadaljevanje tega dela v prihodnosti za nadaljnje izboljšanje naše metode. Tako za intrinzični šum ozadja reda velikosti ±10 pN definiramo kontaktno točko kot prvo podatkovno točko na osi x na sliki 6b z vrednostjo ≥10 pN. Nato v skladu s pragom šuma 10 pN navpična črta na ravni ~0,27 µm označuje točko stika s površino, po kateri se krivulja raztezanja nadaljuje, dokler podlaga ne doseže globine vdolbine ~270 nm. Zanimivo je, da je glede na velikost razvejanih polimernih krtačastih značilnosti (300–400 nm), izmerjeno z metodo slikanja, globina vdolbine vzorca CL lehfilcon A, opazovanega z metodo praga šuma ozadja, približno 270 nm, kar je zelo blizu velikosti merjenja s STEM. Ti rezultati dodatno potrjujejo združljivost in uporabnost oblike in velikosti konice sonde AFM za vdolbino te zelo mehke in zelo elastične razvejane polimerne krtačaste strukture. Ti podatki zagotavljajo tudi močan dokaz v podporo naši metodi uporabe šuma ozadja kot praga za natančno določanje kontaktnih točk. Zato bi morali biti vsi kvantitativni rezultati, pridobljeni z matematičnim modeliranjem in prilagajanjem krivulje sile, relativno natančni.
Kvantitativne meritve z metodami AFM nanoindentacije so popolnoma odvisne od matematičnih modelov, uporabljenih za izbiro podatkov in nadaljnjo analizo. Zato je pomembno, da se pred izbiro določenega modela upoštevajo vsi dejavniki, povezani z izbiro vtiskovalnika, lastnostmi materiala in mehaniko njihove interakcije. V tem primeru je bila geometrija konice skrbno okarakterizirana z uporabo SEM mikrografij (slika 1) in na podlagi rezultatov je AFM nanoindentacijska sonda s premerom 140 nm, trdim stožcem in sferično geometrijo konice dobra izbira za karakterizacijo vzorcev lehfilcon A CL79. Drug pomemben dejavnik, ki ga je treba skrbno oceniti, je elastičnost testiranega polimernega materiala. Čeprav začetni podatki nanoindentacije (sliki 5a in 6a) jasno opisujejo značilnosti prekrivanja krivulj napetosti in stiskanja, tj. popolno elastično okrevanje materiala, je izjemno pomembno potrditi zgolj elastično naravo stikov. V ta namen sta bila na istem mestu na površini vzorca lehfilcon A CL izvedena dva zaporedna vtiska s hitrostjo vtiska 1 µm/s pod pogoji polne hidratacije. Nastali podatki krivulje sile so prikazani na sliki 7 in kot je bilo pričakovano, sta krivulji raztezanja in stiskanja obeh odtisov skoraj enaki, kar poudarja visoko elastičnost razvejane polimerne krtačaste strukture.
Dve krivulji sile vtiskovanja na istem mestu na površini lehfilcon A CL kažeta na idealno elastičnost površine leče.
Na podlagi informacij, pridobljenih iz SEM in STEM slik konice sonde oziroma površine lehfilcon A CL, je model stožca in krogle razumen matematični prikaz interakcije med konico sonde AFM in testiranim mehkim polimernim materialom. Poleg tega za ta model stožca in krogle veljajo temeljne predpostavke o elastičnih lastnostih vtisnjenega materiala za ta novi biomimetični material in se uporabljajo za kvantifikacijo modula elastičnosti.
Po celovitem vrednotenju metode AFM nanoindentacije in njenih komponent, vključno z lastnostmi vdolbinske sonde (oblika, velikost in togost vzmeti), občutljivostjo (hrup v ozadju in ocena kontaktnih točk) in modeli prilagajanja podatkov (meritve kvantitativnih modulov), je bila metoda uporabljena za karakterizacijo komercialno dostopnih ultra mehkih vzorcev za preverjanje kvantitativnih rezultatov. Komercialni poliakrilamidni (PAAM) hidrogel z elastičnim modulom 1 kPa je bil testiran v hidriranih pogojih z uporabo 140 nm sonde. Podrobnosti o testiranju modulov in izračunih so navedene v dodatnih informacijah. Rezultati so pokazali, da je bil povprečni izmerjeni modul 0,92 kPa, odstopanje %RSD in odstotek (%) od znanega modula pa sta bila manjša od 10 %. Ti rezultati potrjujejo natančnost in ponovljivost metode AFM nanoindentacije, uporabljene v tem delu za merjenje modulov ultra mehkih materialov. Površine vzorcev lehfilcon A CL in osnovnega substrata SiHy so bile nadalje karakterizirane z isto metodo AFM nanoindentacije za preučevanje navideznega kontaktnega modula ultramehke površine kot funkcije globine vdolbine. Krivulje ločevanja sile vdolbine so bile ustvarjene za tri vzorce vsake vrste (n = 3; en vdolbina na vzorec) pri sili 300 pN, hitrosti 1 µm/s in polni hidraciji. Krivulja porazdelitve sile vdolbine je bila aproksimirana z modelom stožca in krogle. Za pridobitev modula, odvisnega od globine vdolbine, je bil 40 nm širok del krivulje sile nastavljen na vsak korak 20 nm, začenši od točke stika, in izmerjene vrednosti modula na vsakem koraku krivulje sile. Spin Cy et al. Podoben pristop je bil uporabljen za karakterizacijo gradienta modula polimernih ščetk poli(lauril metakrilata) (P12MA) z uporabo koloidne AFM nanoindentacije in so skladni s podatki, pridobljenimi z uporabo Hertzovega kontaktnega modela. Ta pristop omogoča graf navideznega kontaktnega modula (kPa) glede na globino vdolbine (nm), kot je prikazano na sliki 8, ki ponazarja gradient navideznega kontaktnega modula/globine. Izračunani elastični modul vzorca CL lehfilcon A je v območju 2–3 kPa znotraj zgornjih 100 nm vzorca, nad katerim se začne z globino povečevati. Po drugi strani pa je pri testiranju osnovne podlage SiHy brez čopičastega filma na površini največja dosežena globina vdolbine pri sili 300 pN manjša od 50 nm, vrednost modula, dobljena iz podatkov, pa je približno 400 kPa, kar je primerljivo z vrednostmi Youngovega modula za razsute materiale.
Navidezni kontaktni modul (kPa) v odvisnosti od globine vdolbine (nm) za substrate lehfilcon A CL in SiHy z uporabo metode nanoindentacije AFM s stožčasto-krogelno geometrijo za merjenje modula.
Zgornja površina nove biomimetične strukture razvejane polimerne ščetke kaže izjemno nizek modul elastičnosti (2–3 kPa). To se bo ujemalo s prosto visečim koncem viličaste polimerne ščetke, kot je prikazano na sliki STEM. Čeprav obstajajo nekateri dokazi o gradientu modula na zunanjem robu CL, je glavni substrat z visokim modulom bolj vpliven. Vendar pa je zgornjih 100 nm površine znotraj 20 % celotne dolžine razvejane polimerne ščetke, zato je smiselno domnevati, da so izmerjene vrednosti modula v tem območju globine vdolbine relativno natančne in niso močno odvisne od vpliva spodnjega predmeta.
Zaradi edinstvene biomimetične zasnove kontaktnih leč lehfilcon A, ki so sestavljene iz razvejanih polimernih ščetkastih struktur PMPC, cepljenih na površino SiHy substratov, je zelo težko zanesljivo opredeliti mehanske lastnosti njihovih površinskih struktur z uporabo tradicionalnih merilnih metod. Tukaj predstavljamo napredno metodo AFM nanoindentacije za natančno karakterizacijo ultra mehkih materialov, kot je lefilcon A, z visoko vsebnostjo vode in izjemno visoko elastičnostjo. Ta metoda temelji na uporabi AFM sonde, katere velikost in geometrija konice sta skrbno izbrani tako, da se ujemata s strukturnimi dimenzijami ultra mehkih površinskih značilnosti, ki jih je treba odtisniti. Ta kombinacija dimenzij med sondo in strukturo zagotavlja povečano občutljivost, kar nam omogoča merjenje nizkega modula in inherentnih elastičnih lastnosti razvejanih polimernih ščetkastih elementov, ne glede na poroelastične učinke. Rezultati so pokazali, da imajo edinstvene razvejane polimerne ščetke PMPC, značilne za površino leče, izjemno nizek elastični modul (do 2 kPa) in zelo visoko elastičnost (skoraj 100 %) pri testiranju v vodnem okolju. Rezultati AFM nanoindentacije so nam omogočili tudi karakterizacijo navideznega kontaktnega modula/gradienta globine (30 kPa/200 nm) površine biomimetične leče. Ta gradient je lahko posledica razlike v modulu med razvejanimi polimernimi ščetkami in SiHy substratom ali razvejane strukture/gostote polimernih ščetk ali kombinacije le-teh. Vendar pa so potrebne nadaljnje poglobljene študije, da bi v celoti razumeli razmerje med strukturo in lastnostmi, zlasti vpliv razvejanosti ščetk na mehanske lastnosti. Podobne meritve lahko pomagajo pri karakterizaciji mehanskih lastnosti površine drugih ultra mehkih materialov in medicinskih pripomočkov.
Nabori podatkov, ustvarjeni in/ali analizirani med trenutno študijo, so na voljo pri ustreznih avtorjih na razumno zahtevo.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. in Haugen, HJ Biološke reakcije na fizikalne in kemijske lastnosti površin biomaterialov. Chemical society. Ur. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM in Liu, X. Izboljšanje človeških biomaterialov za tkivno inženirstvo. programiranje. polimer. znanost. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Zasnova, klinična izvedba in imunski odziv biomaterialov v regenerativni medicini. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK in Farr GM Izboljšana metoda za določanje trdote in elastičnega modula z uporabo poskusov vtiskovanja z meritvami obremenitve in premika. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Zgodovinski izvor merjenja trdote z vdolbino. alma mater. znanost. tehnologije. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Meritve trdote z vdolbino na makro, mikro in nanoskali: kritični pregled. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD in Clapperich, SM Napake pri zaznavanju površin vodijo do precenjevanja modula pri nanoindentaciji mehkih materialov. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR in Yahya M.Yu. Vrednotenje metode nanoindentacije za določanje mehanskih lastnosti heterogenih nanokompozitov z uporabo eksperimentalnih in računalniških metod. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR in Owart, TS Mehanska karakterizacija mehkih viskoelastičnih gelov z vdolbino in optimizacijsko analizo inverznih končnih elementov. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J in Chaneler D. Optimizacija določanja viskoelastičnosti z uporabo združljivih merilnih sistemov. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. in Pellillo, E. Nanoindentacija polimernih površin. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. in Van Vliet KJ Karakterizacija viskoelastičnih mehanskih lastnosti visoko elastičnih polimerov in bioloških tkiv z uporabo udarnega vtiskovanja. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Vrednotenje elastičnega modula in adhezijskega dela mehkih materialov z uporabo razširjene Borodich-Galanov (BG) metode in globokega vtiskovanja. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Nanoskalna morfologija in mehanske lastnosti biomimetičnih polimernih površin kontaktnih leč iz silikonskega hidrogela. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).