Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazí karusel s tromi snímkami naraz. Pomocou tlačidiel Predchádzajúca a Nasledujúca sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz alebo pomocou tlačidiel posuvníka na konci sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz.
S vývojom nových ultramäkkých materiálov pre zdravotnícke pomôcky a biomedicínske aplikácie je komplexná charakterizácia ich fyzikálnych a mechanických vlastností dôležitá aj náročná. Na charakterizáciu extrémne nízkeho povrchového modulu novej biomimetickej silikón-hydrogélovej kontaktnej šošovky lehfilcon A potiahnutej vrstvou rozvetvených polymérnych kefkových štruktúr bola použitá modifikovaná technika nanoindentácie atómovej silovej mikroskopie (AFM). Táto metóda umožňuje presné určenie kontaktných bodov bez účinkov viskóznej extrúzie pri priblížení sa k rozvetveným polymérom. Okrem toho umožňuje určiť mechanické vlastnosti jednotlivých kefkových prvkov bez vplyvu poroelasticity. To sa dosahuje výberom AFM sondy s dizajnom (veľkosť hrotu, geometria a tuhosť pružiny), ktorý je obzvlášť vhodný na meranie vlastností mäkkých materiálov a biologických vzoriek. Táto metóda zlepšuje citlivosť a presnosť pre presné meranie veľmi mäkkého materiálu lehfilcon A, ktorý má extrémne nízky modul pružnosti na povrchu (až do 2 kPa) a extrémne vysokú elasticitu vo vnútornom (takmer 100 %) vodnom prostredí. Výsledky štúdie povrchu nielenže odhalili ultramäkké povrchové vlastnosti šošovky lehfilcon A, ale tiež ukázali, že modul rozvetvených polymérnych kefiek bol porovnateľný s modulom kremíkovo-vodíkového substrátu. Túto techniku ​​charakterizácie povrchu možno použiť aj na iné ultramäkké materiály a zdravotnícke pomôcky.
Mechanické vlastnosti materiálov určených na priamy kontakt so živým tkanivom sú často určené biologickým prostredím. Dokonalá zhoda týchto materiálových vlastností pomáha dosiahnuť požadované klinické vlastnosti materiálu bez toho, aby spôsobovala nepriaznivé bunkové reakcie1,2,3. Pri objemových homogénnych materiáloch je charakterizácia mechanických vlastností relatívne jednoduchá vďaka dostupnosti štandardných postupov a testovacích metód (napr. mikroindentácia4,5,6). Avšak pri ultramäkkých materiáloch, ako sú gély, hydrogély, biopolyméry, živé bunky atď., tieto testovacie metódy vo všeobecnosti nie sú použiteľné kvôli obmedzeniam rozlíšenia merania a nehomogenite niektorých materiálov7. V priebehu rokov boli tradičné metódy indentácie modifikované a prispôsobené na charakterizáciu širokej škály mäkkých materiálov, ale mnohé metódy stále trpia vážnymi nedostatkami, ktoré obmedzujú ich použitie8,9,10,11,12,13. Nedostatok špecializovaných testovacích metód, ktoré dokážu presne a spoľahlivo charakterizovať mechanické vlastnosti supermäkkých materiálov a povrchových vrstiev, výrazne obmedzuje ich použitie v rôznych aplikáciách.
V našej predchádzajúcej práci sme predstavili kontaktnú šošovku lehfilcon A (CL), mäkký heterogénny materiál so všetkými ultra mäkkými povrchovými vlastnosťami odvodenými z potenciálne biomimetických dizajnov inšpirovaných povrchom rohovky oka. Tento biomateriál bol vyvinutý naštepením rozvetvenej, zosieťovanej polymérnej vrstvy poly(2-metakryloyloxyetylfosforylcholínu (MPC)) (PMPC) na silikónový hydrogél (SiHy) 15 určený pre zdravotnícke pomôcky na báze. Tento proces naštepovania vytvára na povrchu vrstvu pozostávajúcu z veľmi mäkkej a vysoko elastickej rozvetvenej polymérnej kefkovej štruktúry. Naša predchádzajúca práca potvrdila, že biomimetická štruktúra lehfilcon A CL poskytuje vynikajúce povrchové vlastnosti, ako je zlepšená ochrana proti zmáčaniu a znečisteniu, zvýšená lubrikácia a znížená adhézia buniek a baktérií 15,16. Okrem toho použitie a vývoj tohto biomimetického materiálu naznačuje aj ďalšie rozšírenie na ďalšie biomedicínske zariadenia. Preto je nevyhnutné charakterizovať povrchové vlastnosti tohto ultramäkkého materiálu a pochopiť jeho mechanickú interakciu s okom, aby sa vytvorila komplexná vedomostná základňa na podporu budúceho vývoja a aplikácií. Väčšina komerčne dostupných SiHy kontaktných šošoviek sa skladá z homogénnej zmesi hydrofilných a hydrofóbnych polymérov, ktoré tvoria jednotnú materiálovú štruktúru17. Bolo vykonaných niekoľko štúdií na skúmanie ich mechanických vlastností pomocou tradičných metód kompresie, ťahu a mikroindentácie18,19,20,21. Nový biomimetický dizajn lehfilcon A CL z neho robí jedinečný heterogénny materiál, v ktorom sa mechanické vlastnosti rozvetvených polymérnych kefkových štruktúr výrazne líšia od vlastností základného SiHy substrátu. Preto je veľmi ťažké presne kvantifikovať tieto vlastnosti pomocou konvenčných metód a metód indentácie. Sľubná metóda využíva metódu nanoindentácie implementovanú v atómovej silovej mikroskopii (AFM), metóde, ktorá sa používa na stanovenie mechanických vlastností mäkkých viskoelastických materiálov, ako sú biologické bunky a tkanivá, ako aj mäkké polyméry22,23,24,25, ,26,27,28,29,30. V AFM nanoindentácii sa základy nanoindentačného testovania kombinujú s najnovšími pokrokmi v technológii AFM, aby sa zabezpečila zvýšená citlivosť merania a testovanie širokej škály inherentne supermäkkých materiálov31,32,33,34,35,36. Okrem toho táto technológia ponúka ďalšie dôležité výhody vďaka použitiu rôznych geometrií vtlačovacieho telesa a sondy a možnosti testovania v rôznych kvapalných médiách.
AFM nanoindentáciu možno podmienečne rozdeliť na tri hlavné komponenty: (1) vybavenie (senzory, detektory, sondy atď.); (2) parametre merania (ako sú sila, posunutie, rýchlosť, veľkosť rampy atď.); (3) spracovanie údajov (korekcia základnej línie, odhad bodu dotyku, prispôsobenie údajov, modelovanie atď.). Významným problémom tejto metódy je, že niekoľko štúdií v literatúre využívajúcich AFM nanoindentáciu uvádza veľmi odlišné kvantitatívne výsledky pre rovnaký typ vzorky/bunky/materiálu37,38,39,40,41. Napríklad Lekka a kol. skúmali a porovnávali vplyv geometrie AFM sondy na nameraný Youngov modul vzoriek mechanicky homogénneho hydrogélu a heterogénnych buniek. Uvádzajú, že hodnoty modulov sú vysoko závislé od výberu konzoly a tvaru hrotu, s najvyššou hodnotou pre sondu v tvare pyramídy a najnižšou hodnotou 42 pre guľovú sondu. Podobne Selhuber-Unkel a kol. Bolo preukázané, ako rýchlosť vtlačovania, veľkosť vtlačovacieho telesa a hrúbka polyakrylamidových (PAAM) vzoriek ovplyvňujú Youngov modul pružnosti meraný nanoindentáciou ACM43. Ďalším komplikujúcim faktorom je nedostatok štandardných testovacích materiálov s extrémne nízkym modulom a bezplatných testovacích postupov. To veľmi sťažuje získanie presných výsledkov s istotou. Metóda je však veľmi užitočná pre relatívne merania a porovnávacie hodnotenia medzi podobnými typmi vzoriek, napríklad pomocou nanoindentácie AFM na rozlíšenie normálnych buniek od rakovinových buniek 44, 45.
Pri testovaní mäkkých materiálov pomocou AFM nanoindentácie je všeobecným pravidlom použiť sondu s nízkou konštantou pružiny (k), ktorá sa čo najviac zhoduje s modulom vzorky, a s pologuľovitým/okrúhlym hrotom, aby prvá sonda pri prvom kontakte s mäkkými materiálmi neprepichla povrch vzorky. Je tiež dôležité, aby signál vychýlenia generovaný sondou bol dostatočne silný na to, aby ho detekoval laserový detektor24,34,46,47. V prípade ultramäkkých heterogénnych buniek, tkanív a gélov je ďalšou výzvou prekonať adhéznu silu medzi sondou a povrchom vzorky, aby sa zabezpečili reprodukovateľné a spoľahlivé merania48,49,50. Až donedávna sa väčšina prác na AFM nanoindentácii zameriavala na štúdium mechanického správania biologických buniek, tkanív, gélov, hydrogélov a biomolekúl pomocou relatívne veľkých sférických sond, bežne označovaných ako koloidné sondy (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Tieto hroty majú polomer 1 až 50 µm a bežne sa vyrábajú z borosilikátového skla, polymetylmetakrylátu (PMMA), polystyrénu (PS), oxidu kremičitého (SiO2) a diamantu podobného uhlíka (DLC). Hoci je nanoindentácia CP-AFM často prvou voľbou pre charakterizáciu mäkkých vzoriek, má svoje vlastné problémy a obmedzenia. Použitie veľkých sférických hrotov s mikrónovou veľkosťou zvyšuje celkovú kontaktnú plochu hrotu so vzorkou a vedie k výraznej strate priestorového rozlíšenia. Pri mäkkých, nehomogénnych vzorkách, kde sa mechanické vlastnosti lokálnych prvkov môžu výrazne líšiť od priemeru v širšej oblasti, môže indentácia CP skryť akúkoľvek nehomogenitu vlastností v lokálnom meradle52. Koloidné sondy sa typicky vyrábajú pripevnením koloidných guľôčok s mikrónovou veľkosťou k bezhrotovým konzolám pomocou epoxidových lepidiel. Samotný výrobný proces je plný mnohých problémov a môže viesť k nekonzistentnostiam v procese kalibrácie sondy. Okrem toho veľkosť a hmotnosť koloidných častíc priamo ovplyvňujú hlavné kalibračné parametre konzoly, ako je rezonančná frekvencia, tuhosť pružiny a citlivosť na vychýlenie56,57,58. Bežne používané metódy pre konvenčné AFM sondy, ako je kalibrácia teploty, teda nemusia poskytovať presnú kalibráciu pre CP a na vykonanie týchto korekcií môžu byť potrebné iné metódy57, 59, 60, 61. Typické experimenty s vtlačením CP používajú konzolu s veľkými odchýlkami na štúdium vlastností mäkkých vzoriek, čo vytvára ďalší problém pri kalibrácii nelineárneho správania konzoly pri relatívne veľkých odchýlkach62,63,64. Moderné metódy vtlačenia koloidných sond zvyčajne zohľadňujú geometriu konzoly použitej na kalibráciu sondy, ale ignorujú vplyv koloidných častíc, čo vytvára ďalšiu neistotu v presnosti metódy38,61. Podobne sú elastické moduly vypočítané prispôsobením kontaktného modelu priamo závislé od geometrie vtlačovacej sondy a nesúlad medzi charakteristikami hrotu a povrchu vzorky môže viesť k nepresnostiam27, 65, 66, 67, 68. Zdôrazňujú sa niektoré nedávne práce Spencera a kol. Faktory, ktoré by sa mali zohľadniť pri charakterizácii mäkkých polymérnych kief pomocou nanoindentačnej metódy CP-AFM. Uviedli, že zadržiavanie viskóznej tekutiny v polymérnych kefkách ako funkcia rýchlosti vedie k zvýšeniu zaťaženia hlavy, a teda k rôznym meraniam vlastností závislých od rýchlosti30,69,70,71.
V tejto štúdii sme charakterizovali povrchový modul ultramäkkého vysoko elastického materiálu lehfilcon A CL pomocou modifikovanej metódy AFM nanoindentácie. Vzhľadom na vlastnosti a novú štruktúru tohto materiálu je rozsah citlivosti tradičnej metódy vtláčania zjavne nedostatočný na charakterizáciu modulu tohto extrémne mäkkého materiálu, preto je potrebné použiť metódu AFM nanoindentácie s vyššou aj nižšou úrovňou citlivosti. Po preskúmaní nedostatkov a problémov existujúcich techník koloidnej AFM nanoindentácie ukazujeme, prečo sme zvolili menšiu, na mieru navrhnutú AFM sondu, aby sme eliminovali citlivosť, šum pozadia, presne určili bod kontaktu, zmerali modul rýchlosti mäkkých heterogénnych materiálov, ako je závislosť od zadržiavania tekutín, a presne kvantifikovali. Okrem toho sme boli schopní presne zmerať tvar a rozmery vtláčacieho hrotu, čo nám umožnilo použiť model kužeľovo-guľového prispôsobenia na určenie modulu pružnosti bez posúdenia kontaktnej plochy hrotu s materiálom. Dva implicitné predpoklady, ktoré sú v tejto práci kvantifikované, sú plne elastické vlastnosti materiálu a modul nezávislý od hĺbky vtláčania. Pomocou tejto metódy sme najprv testovali ultramäkké štandardy so známym modulom na kvantifikáciu metódy a potom sme túto metódu použili na charakterizáciu povrchov dvoch rôznych materiálov kontaktných šošoviek. Očakáva sa, že táto metóda charakterizácie AFM nanoindentačných povrchov so zvýšenou citlivosťou bude použiteľná pre širokú škálu biomimetických heterogénnych ultramäkkých materiálov s potenciálnym využitím v zdravotníckych pomôckach a biomedicínskych aplikáciách.
Na experimenty s nanoindentáciou boli vybrané kontaktné šošovky Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) a ich silikón-hydrogélové substráty. V experimente bol použitý špeciálne navrhnutý držiak šošovky. Na inštaláciu šošovky na testovanie bola opatrne umiestnená na kupolovitý stojan, pričom sa dbalo na to, aby sa dovnútra nedostali žiadne vzduchové bubliny, a potom bola upevnená okrajmi. Otvor v upínacom prípravku v hornej časti držiaka šošovky poskytuje prístup k optickému stredu šošovky pre experimenty s nanoindentáciou a zároveň drží kvapalinu na mieste. Vďaka tomu sú šošovky úplne hydratované. Ako testovací roztok bolo použitých 500 μl roztoku na balenie kontaktných šošoviek. Na overenie kvantitatívnych výsledkov boli pripravené komerčne dostupné neaktivované polyakrylamidové (PAAM) hydrogély z polyakrylamid-ko-metylén-bisakrylamidovej kompozície (100 mm Petriho misky Petrisoft, Matrigen, Irvine, CA, USA) so známym modulom pružnosti 1 kPa. Na rozhranie hydrogélu a sondy AFM použite 4 – 5 kvapiek (približne 125 µl) fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS od spoločnosti Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) a 1 kvapku roztoku na kontaktné šošovky OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA).
Vzorky substrátov Lehfilcon A CL a SiHy boli vizualizované pomocou systému FEI Quanta 250 Field Emission Skenovací elektrónový mikroskop (FEG SEM) vybaveného detektorom Skenovací transmisný elektrónový mikroskop (STEM). Na prípravu vzoriek boli šošovky najskôr umyté vodou a narezané na kliny v tvare koláča. Na dosiahnutie diferenciálneho kontrastu medzi hydrofilnou a hydrofóbnou zložkou vzoriek bol ako farbivo použitý 0,10 % stabilizovaný roztok RuO4, do ktorého boli vzorky ponorené na 30 minút. Farbenie RuO4 s lehfilcon A CL je dôležité nielen na dosiahnutie zlepšeného diferenciálneho kontrastu, ale tiež pomáha zachovať štruktúru rozvetvených polymérnych štetcov v ich pôvodnej forme, ktoré sú potom viditeľné na STEM snímkach. Následne boli umyté a dehydratované v sérii zmesí etanol/voda so zvyšujúcou sa koncentráciou etanolu. Vzorky boli následne odliate epoxidom EMBed 812/Araldite, ktorý vytvrdzoval cez noc pri 70 °C. Vzorky získané polymerizáciou živice boli narezané ultramikrotomom a výsledné tenké rezy boli vizualizované pomocou STEM detektora v režime nízkeho vákua pri urýchľovacom napätí 30 kV. Rovnaký SEM systém bol použitý na detailnú charakterizáciu AFM sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). SEM snímky AFM sondy boli získané v typickom režime vysokého vákua s urýchľovacím napätím 30 kV. Snímky boli získané z rôznych uhlov a zväčšení, aby sa zaznamenali všetky detaily tvaru a veľkosti hrotu AFM sondy. Všetky rozmery hrotu, ktoré sú na snímkach zaujímavé, boli merané digitálne.
Na vizualizáciu a nanoindentáciu vzoriek lehfilcon A CL, SiHy substrátu a hydrogélu PAAm bol použitý atómový silový mikroskop Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) s režimom „PeakForce QNM in Fluid“. Pre zobrazovacie experimenty bola použitá sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) s nominálnym polomerom hrotu 1 nm na zachytenie snímok vzorky s vysokým rozlíšením pri rýchlosti skenovania 0,50 Hz. Všetky snímky boli zhotovené vo vodnom roztoku.
Experimenty s AFM nanoindentáciou boli vykonané s použitím sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Sonda AFM má kremíkový hrot na nitridovej konzole s hrúbkou 345 nm, dĺžkou 54 µm a šírkou 4,5 µm s rezonančnou frekvenciou 45 kHz. Je špeciálne navrhnutá na charakterizáciu a vykonávanie kvantitatívnych nanomechanických meraní na mäkkých biologických vzorkách. Senzory sú individuálne kalibrované vo výrobe s predkalibrovaným nastavením pružín. Pružinové konštanty sond použitých v tejto štúdii boli v rozsahu 0,05–0,1 N/m. Pre presné určenie tvaru a veľkosti hrotu bola sonda podrobne charakterizovaná pomocou SEM. Na obr. Obrázok 1a znázorňuje skenovací elektrónový mikrofotografiu sondy PFQNM-LC-A-CAL s vysokým rozlíšením a nízkym zväčšením, ktorá poskytuje holistický pohľad na dizajn sondy. Na obr. 1b znázorňuje zväčšený pohľad na vrch hrotu sondy, ktorý poskytuje informácie o tvare a veľkosti hrotu. Na krajnom konci má ihla tvar pologule s priemerom približne 140 nm (obr. 1c). Pod ňou sa hrot zužuje do kužeľovitého tvaru a dosahuje nameranú dĺžku približne 500 nm. Mimo zužovacej oblasti je hrot valcový a končí celkovou dĺžkou hrotu 1,18 µm. Toto je hlavná funkčná časť hrotu sondy. Okrem toho sa na testovanie ako koloidná sonda použila aj veľká sférická polystyrénová (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) s priemerom hrotu 45 µm a konštantou pružiny 2 N/m. Na porovnanie sa použila sonda PFQNM-LC-A-CAL 140 nm.
Bolo hlásené, že počas nanoindentácie sa môže medzi AFM sondou a štruktúrou polymérnej kefky zachytiť kvapalina, ktorá bude pôsobiť na AFM sondu silou smerom nahor ešte predtým, ako sa skutočne dotkne povrchu69. Tento efekt viskóznej extrúzie v dôsledku zadržiavania tekutiny môže zmeniť zdanlivý bod kontaktu, a tým ovplyvniť merania modulu povrchu. Na štúdium vplyvu geometrie sondy a rýchlosti vtláčania na retenciu tekutiny boli vynesené krivky sily vtláčania pre vzorky lehfilcon A CL s použitím sondy s priemerom 140 nm pri konštantných rýchlostiach posunu 1 µm/s a 2 µm/s. Priemer sondy 45 µm, fixné nastavenie sily 6 nN bolo dosiahnuté pri 1 µm/s. Experimenty so sondou s priemerom 140 nm boli vykonané pri rýchlosti vtláčania 1 µm/s a nastavenej sile 300 pN, zvolenej tak, aby sa vytvoril kontaktný tlak vo fyziologickom rozsahu (1–8 kPa) horného viečka. tlak 72. Mäkké hotové vzorky hydrogélu PAA s tlakom 1 kPa boli testované na vtlačovaciu silu 50 pN pri rýchlosti 1 μm/s pomocou sondy s priemerom 140 nm.
Keďže dĺžka kužeľovej časti hrotu sondy PFQNM-LC-A-CAL je približne 500 nm, pre akúkoľvek hĺbku vtlačenia < 500 nm možno bezpečne predpokladať, že geometria sondy počas vtlačenia zostane verná svojmu kužeľovému tvaru. Okrem toho sa predpokladá, že povrch testovaného materiálu bude vykazovať reverzibilnú elastickú odozvu, čo bude potvrdené aj v nasledujúcich častiach. Preto sme v závislosti od tvaru a veľkosti hrotu zvolili model prispôsobenia kužeľ-guľa vyvinutý Briscoeom, Sebastianom a Adamsom, ktorý je dostupný v softvéri dodávateľa, na spracovanie našich experimentov s AFM nanoindentáciou (NanoScope). Softvér na analýzu separačných údajov, Bruker) 73. Model popisuje vzťah sily a posunutia F(δ) pre kužeľ so sférickou vrcholovou chybou. Na obr. Obrázok 2 znázorňuje geometriu kontaktu počas interakcie tuhého kužeľa s guľovým hrotom, kde R je polomer guľového hrotu, a je kontaktný polomer, b je kontaktný polomer na konci guľového hrotu, δ je kontaktný polomer. θ je hĺbka vtlačenia, polovičný uhol kužeľa. SEM snímka tejto sondy jasne ukazuje, že guľový hrot s priemerom 140 nm tangenciálne prechádza do kužeľa, takže b je tu definované iba cez R, t. j. b = R cos θ. Softvér dodaný dodávateľom poskytuje vzťah kužeľ-guľa na výpočet hodnôt Youngovho modulu (E) z údajov o oddelení síl za predpokladu, že a > b. Vzťah:
kde F je vtlačovacia sila, E je Youngov modul, ν je Poissonov pomer. Kontaktný polomer a možno odhadnúť pomocou:
Schéma kontaktnej geometrie tuhého kužeľa s guľovitým hrotom zatlačeným do materiálu kontaktnej šošovky Lefilcon s povrchovou vrstvou rozvetvených polymérnych štetcov.
Ak a ≤ b, vzťah sa redukuje na rovnicu pre konvenčný guľový vtlačovací teliesko;
Domnievame sa, že interakcia vtláčacej sondy s rozvetvenou štruktúrou polymérnej kefy PMPC spôsobí, že kontaktný polomer a bude väčší ako sférický kontaktný polomer b. Preto sme pre všetky kvantitatívne merania modulu pružnosti vykonané v tejto štúdii použili závislosť získanú pre prípad a > b.
Ultramäkké biomimetické materiály študované v tejto štúdii boli komplexne zobrazené pomocou skenovacej transmisnej elektrónovej mikroskopie (STEM) prierezu vzorky a atómovej silovej mikroskopie (AFM) povrchu. Táto podrobná charakterizácia povrchu bola vykonaná ako rozšírenie našej predtým publikovanej práce, v ktorej sme zistili, že dynamicky rozvetvená polymérna kefová štruktúra povrchu PMPC-modifikovaného lehfilcon A CL vykazovala podobné mechanické vlastnosti ako natívne tkanivo rohovky 14. Z tohto dôvodu označujeme povrchy kontaktných šošoviek ako biomimetické materiály 14. Na obr. 3a,b sú znázornené prierezy rozvetvených polymérnych kefových štruktúr PMPC na povrchu substrátu lehfilcon A CL a neošetreného SiHy substrátu. Povrchy oboch vzoriek boli ďalej analyzované pomocou AFM snímok s vysokým rozlíšením, ktoré ďalej potvrdili výsledky STEM analýzy (obr. 3c, d). Tieto snímky spolu poskytujú približnú dĺžku rozvetvenej polymérnej kefovej štruktúry PMPC pri 300 – 400 nm, čo je rozhodujúce pre interpretáciu meraní AFM nanoindentácie. Ďalším kľúčovým pozorovaním z obrázkov je, že celková povrchová štruktúra biomimetického materiálu CL je morfologicky odlišná od povrchovej štruktúry SiHy substrátového materiálu. Tento rozdiel v ich povrchovej morfológii sa môže prejaviť počas ich mechanickej interakcie s vtlačovacou AFM sondou a následne v nameraných hodnotách modulu.
Prierezové STEM snímky (a) lehfilcon A CL a (b) SiHy substrátu. Mierka, 500 nm. AFM snímky povrchu lehfilcon A CL substrátu (c) a základného SiHy substrátu (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinšpirované polyméry a štruktúry polymérnych kefiek sú inherentne mäkké a boli široko študované a používané v rôznych biomedicínskych aplikáciách74,75,76,77. Preto je dôležité používať metódu AFM nanoindentácie, ktorá dokáže presne a spoľahlivo merať ich mechanické vlastnosti. Zároveň však jedinečné vlastnosti týchto ultramäkkých materiálov, ako je extrémne nízky modul pružnosti, vysoký obsah kvapaliny a vysoká elasticita, často sťažujú výber správneho materiálu, tvaru a veľkosti vtlačovacej sondy. To je dôležité, aby vtlačovacie teliesko neprepichlo mäkký povrch vzorky, čo by viedlo k chybám pri určovaní bodu kontaktu s povrchom a plochy kontaktu.
Na to je nevyhnutné komplexné pochopenie morfológie ultramäkkých biomimetických materiálov (lehfilcon A CL). Informácie o veľkosti a štruktúre rozvetvených polymérnych štetcov získané zobrazovacou metódou poskytujú základ pre mechanickú charakterizáciu povrchu pomocou techník AFM nanoindentácie. Namiesto sférických koloidných sond mikrónovej veľkosti sme zvolili sondu z nitridu kremíka PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) s priemerom hrotu 140 nm, špeciálne navrhnutú na kvantitatívne mapovanie mechanických vlastností biologických vzoriek 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Dôvod použitia relatívne ostrých sond v porovnaní s konvenčnými koloidnými sondami možno vysvetliť štrukturálnymi vlastnosťami materiálu. Porovnaním veľkosti hrotu sondy (~140 nm) s rozvetvenými polymérnymi štetcami na povrchu CL lehfilcon A, znázornenými na obr. 3a, možno konštatovať, že hrot je dostatočne veľký na to, aby prišiel do priameho kontaktu s týmito štetinovými štruktúrami, čo znižuje pravdepodobnosť, že ich hrot prerazí. Pre ilustráciu tohto bodu je na obr. 4 znázornený STEM obrázok lehfilcon A CL a vtlačovacieho hrotu AFM sondy (nakreslený v mierke).
Schematické znázornenie STEM snímky lehfilconu A CL a vtlačovacej sondy ACM (nakreslené v mierke).
Okrem toho je veľkosť hrotu 140 nm dostatočne malá na to, aby sa predišlo riziku účinkov lepkavej extrúzie, ktoré boli predtým hlásené pre polymérne kefy vyrobené metódou nanoindentácie CP-AFM69,71. Predpokladáme, že vzhľadom na špeciálny kužeľovito-guľovitý tvar a relatívne malú veľkosť tohto hrotu AFM (obr. 1) nebude povaha krivky sily generovanej nanoindentáciou lehfilcon A CL závisieť od rýchlosti vtláčania ani od rýchlosti nakladania/vykladania. Preto nie je ovplyvnená poroelastickými efektmi. Na overenie tejto hypotézy boli vzorky lehfilcon A CL vtláčané pri pevnej maximálnej sile pomocou sondy PFQNM-LC-A-CAL, ale pri dvoch rôznych rýchlostiach, a výsledné krivky ťahovej a retrakčnej sily boli použité na vynesenie sily (nN) v odstupe (µm) ako je znázornené na obrázku 5a. Je zrejmé, že krivky sily počas zaťaženia a odľahčenia sa úplne prekrývajú a neexistuje žiadny jasný dôkaz o tom, že by sa šmyková sila pri nulovej hĺbke vtlačenia zvyšovala s rýchlosťou vtlačenia na obrázku, čo naznačuje, že jednotlivé prvky kefky boli charakterizované bez poroelastického efektu. Naproti tomu účinky zadržiavania tekutín (viskózna extrúzia a účinky poroelasticity) sú zrejmé pre AFM sondu s priemerom 45 µm pri rovnakej rýchlosti vtlačenia a sú zvýraznené hysteréziou medzi krivkami natiahnutia a zatiahnutia, ako je znázornené na obrázku 5b. Tieto výsledky podporujú hypotézu a naznačujú, že sondy s priemerom 140 nm sú dobrou voľbou na charakterizáciu takýchto mäkkých povrchov.
Krivky vtlačovacej sily lehfilcon A CL s použitím ACM; (a) s použitím sondy s priemerom 140 nm pri dvoch rýchlostiach zaťaženia, demonštrujúce absenciu poroelastického efektu počas povrchového vtlačenia; (b) s použitím sond s priemerom 45 µm a 140 nm. s ukazujú účinky viskóznej extrúzie a poroelasticity pre veľké sondy v porovnaní s menšími sondami.
Na charakterizáciu ultramäkkých povrchov musia mať metódy AFM nanoindentácie najlepšiu sondu na štúdium vlastností skúmaného materiálu. Okrem tvaru a veľkosti hrotu zohráva dôležitú úlohu pri určovaní presnosti a spoľahlivosti nanoindentačných meraní citlivosť detektora AFM, citlivosť na vychýlenie hrotu v testovacom prostredí a tuhosť konzoly. Pre náš systém AFM je limit detekcie polohovo citlivého detektora (PSD) približne 0,5 mV a je založený na predkalibrovanej tuhosti pružiny a vypočítanej citlivosti sondy PFQNM-LC-A-CAL na vychýlenie kvapaliny, ktorá zodpovedá teoretickej citlivosti na zaťaženie. Táto metóda preto umožňuje meranie minimálnej vtlačovacej sily ≤ 0,1 pN bez akejkoľvek periférnej šumovej zložky. Pre systém AFM je však takmer nemožné znížiť periférny šum na túto úroveň kvôli faktorom, ako sú mechanické vibrácie a dynamika tekutín. Tieto faktory obmedzujú celkovú citlivosť metódy AFM nanoindentácie a tiež vedú k signálu šumu pozadia približne ≤ 10 pN. Pre charakterizáciu povrchu boli vzorky substrátu lehfilcon A CL a SiHy vtlačené za plne hydratovaných podmienok pomocou 140 nm sondy pre charakterizáciu SEM a výsledné krivky sily boli superponované medzi silou (pN) a tlakom. Separačný graf (µm) je znázornený na obrázku 6a. V porovnaní so základným substrátom SiHy, krivka sily lehfilcon A CL jasne ukazuje prechodnú fázu začínajúcu v bode kontaktu s vidlicovou polymérnou kefkou a končiacou ostrou zmenou sklonu, ktorá označuje kontakt hrotu s podkladovým materiálom. Táto prechodná časť krivky sily zdôrazňuje skutočne elastické správanie rozvetvenej polymérnej kefky na povrchu, o čom svedčí kompresná krivka tesne nasledujúca po krivke napätia a kontrast v mechanických vlastnostiach medzi štruktúrou kefky a objemným SiHy materiálom. Pri porovnaní lefilconu. Oddelenie priemernej dĺžky rozvetvenej polymérnej kefky na STEM snímke PCS (obr. 3a) a jej krivka sily pozdĺž osi x na obr. 3a. Obrázok 6a ukazuje, že metóda je schopná detekovať hrot a rozvetvený polymér dosahujúci úplný vrch povrchu. Kontakt medzi kefkovými štruktúrami. Okrem toho, tesné prekrytie kriviek sily naznačuje žiadny efekt zadržiavania kvapaliny. V tomto prípade neexistuje absolútne žiadna adhézia medzi ihlou a povrchom vzorky. Najvyššie časti kriviek sily pre obe vzorky sa prekrývajú, čo odráža podobnosť mechanických vlastností substrátových materiálov.
(a) Krivky sily AFM nanoindentácie pre substráty lehfilcon A CL a substráty SiHy, (b) krivky sily znázorňujúce odhad kontaktného bodu pomocou metódy prahu šumu pozadia.
Aby bolo možné študovať jemnejšie detaily krivky sily, krivka napätia vzorky lehfilcon A CL je znovu znázornená na obr. 6b s maximálnou silou 50 pN pozdĺž osi y. Tento graf poskytuje dôležité informácie o pôvodnom šume pozadia. Šum je v rozsahu ±10 pN, čo sa používa na presné určenie kontaktného bodu a výpočet hĺbky vtlačenia. Ako sa uvádza v literatúre, identifikácia kontaktných bodov je kľúčová pre presné posúdenie materiálových vlastností, ako je modul85. Prístup zahŕňajúci automatické spracovanie údajov krivky sily ukázal zlepšenú zhodu medzi prispôsobením údajov a kvantitatívnymi meraniami pre mäkké materiály86. V tejto práci je náš výber kontaktných bodov relatívne jednoduchý a objektívny, ale má svoje obmedzenia. Náš konzervatívny prístup k určeniu kontaktného bodu môže viesť k mierne nadhodnoteným hodnotám modulu pre menšie hĺbky vtlačenia (< 100 nm). Použitie detekcie dotykových bodov na základe algoritmu a automatizovaného spracovania údajov by mohlo byť pokračovaním tejto práce v budúcnosti s cieľom ďalej zlepšiť našu metódu. Pre vnútorný šum pozadia rádovo ±10 pN definujeme kontaktný bod ako prvý dátový bod na osi x na obrázku 6b s hodnotou ≥10 pN. Potom, v súlade s prahom šumu 10 pN, zvislá čiara na úrovni ~0,27 µm označuje bod kontaktu s povrchom, po ktorom krivka naťahovania pokračuje, kým substrát nedosiahne hĺbku vtlačenia ~270 nm. Je zaujímavé, že na základe veľkosti rozvetvených polymérnych kefkových prvkov (300 – 400 nm) meranej zobrazovacou metódou je hĺbka vtlačenia vzorky CL lehfilcon A pozorovaná pomocou metódy prahu šumu pozadia približne 270 nm, čo je veľmi blízke veľkosti meranej pomocou STEM. Tieto výsledky ďalej potvrdzujú kompatibilitu a použiteľnosť tvaru a veľkosti hrotu sondy AFM na vtlačenie tejto veľmi mäkkej a vysoko elastickej rozvetvenej polymérnej kefkovej štruktúry. Tieto údaje tiež poskytujú silný dôkaz na podporu našej metódy použitia šumu pozadia ako prahu na presné určenie kontaktných bodov. Preto by akékoľvek kvantitatívne výsledky získané z matematického modelovania a fitovania krivky sily mali byť relatívne presné.
Kvantitatívne merania metódami AFM nanoindentácie sú úplne závislé od matematických modelov použitých na výber údajov a následnú analýzu. Preto je dôležité pred výberom konkrétneho modelu zvážiť všetky faktory súvisiace s výberom vtlačovacieho telesa, materiálovými vlastnosťami a mechanikou ich interakcie. V tomto prípade bola geometria hrotu starostlivo charakterizovaná pomocou SEM mikrofotografií (obr. 1) a na základe výsledkov je AFM nanoindentačná sonda s priemerom 140 nm s tvrdým kužeľom a guľovou geometriou hrotu dobrou voľbou na charakterizáciu vzoriek lehfilcon A CL79. Ďalším dôležitým faktorom, ktorý je potrebné starostlivo vyhodnotiť, je elasticita testovaného polymérneho materiálu. Hoci počiatočné údaje z nanoindentácie (obr. 5a a 6a) jasne načrtávajú znaky prekrývania kriviek ťahu a kompresie, t. j. úplné elastické zotavenie materiálu, je mimoriadne dôležité potvrdiť čisto elastickú povahu kontaktov. Za týmto účelom boli vykonané dva po sebe nasledujúce vtlačenia na rovnakom mieste na povrchu vzorky lehfilcon A CL pri rýchlosti vtlačenia 1 µm/s za podmienok plnej hydratácie. Výsledné údaje o krivke sily sú znázornené na obr. 7 a ako sa očakávalo, krivky rozťažnosti a kompresie oboch výtlačkov sú takmer identické, čo zdôrazňuje vysokú elasticitu rozvetvenej polymérnej kefkovej štruktúry.
Dve krivky vtlačovacej sily na rovnakom mieste na povrchu lehfilcon A CL naznačujú ideálnu elasticitu povrchu šošovky.
Na základe informácií získaných zo SEM a STEM snímok hrotu sondy a povrchu lehfilcon A CL je kužeľovo-guľový model rozumným matematickým znázornením interakcie medzi hrotom AFM sondy a testovaným mäkkým polymérnym materiálom. Okrem toho pre tento kužeľovo-guľový model platia základné predpoklady o elastických vlastnostiach potlačeného materiálu aj pre tento nový biomimetický materiál a používajú sa na kvantifikáciu modulu pružnosti.
Po komplexnom vyhodnotení metódy AFM nanoindentácie a jej komponentov, vrátane vlastností vtláčacej sondy (tvar, veľkosť a tuhosť pružiny), citlivosti (šum pozadia a odhad kontaktného bodu) a modelov prispôsobenia údajov (kvantitatívne merania modulov), bola táto metóda použitá na charakterizáciu komerčne dostupných ultramäkkých vzoriek na overenie kvantitatívnych výsledkov. Komerčný polyakrylamidový (PAAM) hydrogél s modulom pružnosti 1 kPa bol testovaný za hydratovaných podmienok pomocou sondy s dĺžkou 140 nm. Podrobnosti o testovaní modulov a výpočtoch sú uvedené v doplnkových informáciách. Výsledky ukázali, že priemerný nameraný modul bol 0,92 kPa a %RSD a percentuálna (%) odchýlka od známeho modulu boli menšie ako 10 %. Tieto výsledky potvrdzujú presnosť a reprodukovateľnosť metódy AFM nanoindentácie použitej v tejto práci na meranie modulov ultramäkkých materiálov. Povrchy vzoriek lehfilcon A CL a substrátu SiHy boli ďalej charakterizované pomocou rovnakej metódy AFM nanoindentácie, aby sa študoval zdanlivý kontaktný modul ultramäkkého povrchu ako funkcia hĺbky vtlačenia. Krivky separácie vtlačnej sily boli vygenerované pre tri vzorky každého typu (n = 3; jeden vtlačok na vzorku) pri sile 300 pN, rýchlosti 1 µm/s a plnej hydratácii. Krivka rozdelenia vtlačnej sily bola aproximovaná pomocou kužeľovo-guľového modelu. Na získanie modulu závislého od hĺbky vtlačenia bola nastavená 40 nm široká časť silovej krivky na každý prírastok 20 nm od bodu kontaktu a namerané hodnoty modulu v každom kroku silovej krivky. Spin Cy a kol. Podobný prístup bol použitý na charakterizáciu gradientu modulu polymérnych kefiek z poly(laurylmetakrylátu) (P12MA) pomocou koloidnej AFM nanoindentácie sondou a sú v súlade s údajmi pomocou Hertzovho kontaktného modelu. Tento prístup poskytuje graf zdanlivého kontaktného modulu (kPa) oproti hĺbke vtlačenia (nm), ako je znázornené na obrázku 8, ktorý ilustruje gradient zdanlivého kontaktného modulu/hĺbky. Vypočítaný modul pružnosti vzorky CL lehfilcon A je v rozsahu 2 – 3 kPa v horných 100 nm vzorky, za ktorým sa začína s hĺbkou zvyšovať. Na druhej strane, pri testovaní substrátu SiHy bez kefkovitej vrstvy na povrchu je maximálna hĺbka vtlačenia dosiahnutá pri sile 300 pN menšia ako 50 nm a hodnota modulu získaná z údajov je približne 400 kPa, čo je porovnateľné s hodnotami Youngovho modulu pre sypké materiály.
Zdanlivý kontaktný modul (kPa) vs. hĺbka vtlačenia (nm) pre substráty lehfilcon A CL a SiHy s použitím metódy AFM nanoindentácie s geometriou kužeľ-guľa na meranie modulu.
Najvrchnejší povrch novej biomimetickej rozvetvenej polymérnej kefky vykazuje extrémne nízky modul pružnosti (2–3 kPa). To bude zodpovedať voľne visiacemu koncu vidlicovej polymérnej kefky, ako je znázornené na obrázku STEM. Hoci existujú určité dôkazy o gradiente modulu na vonkajšom okraji CL, hlavný substrát s vysokým modulom je vplyvnejší. Horných 100 nm povrchu sa však nachádza do 20 % celkovej dĺžky rozvetvenej polymérnej kefky, takže je rozumné predpokladať, že namerané hodnoty modulu v tomto rozsahu hĺbky vtlačenia sú relatívne presné a nezávisia silne od vplyvu spodného objektu.
Vzhľadom na unikátny biomimetický dizajn kontaktných šošoviek lehfilcon A, pozostávajúcich z rozvetvených kefkových štruktúr z polyméru PMPC naštepených na povrch SiHy substrátov, je veľmi ťažké spoľahlivo charakterizovať mechanické vlastnosti ich povrchových štruktúr pomocou tradičných metód merania. V tejto práci predstavujeme pokročilú metódu AFM nanoindentácie na presnú charakterizáciu ultramäkkých materiálov, ako je lefilcon A, s vysokým obsahom vody a extrémne vysokou elasticitou. Táto metóda je založená na použití AFM sondy, ktorej veľkosť a geometria hrotu sú starostlivo zvolené tak, aby zodpovedali štrukturálnym rozmerom ultramäkkých povrchových prvkov, ktoré sa majú potlačiť. Táto kombinácia rozmerov medzi sondou a štruktúrou poskytuje zvýšenú citlivosť, čo nám umožňuje merať nízky modul a inherentné elastické vlastnosti rozvetvených polymérnych kefkových prvkov bez ohľadu na poroelastické účinky. Výsledky ukázali, že unikátne rozvetvené kefkové štruktúry z polyméru PMPC charakteristické pre povrch šošovky mali extrémne nízky modul pružnosti (až do 2 kPa) a veľmi vysokú elasticitu (takmer 100 %) pri testovaní vo vodnom prostredí. Výsledky AFM nanoindentácie nám tiež umožnili charakterizovať zdanlivý gradient kontaktného modulu/hĺbky (30 kPa/200 nm) povrchu biomimetickej šošovky. Tento gradient môže byť spôsobený rozdielom modulov medzi rozvetvenými polymérnymi kefami a SiHy substrátom alebo rozvetvenou štruktúrou/hustotou polymérnych kefiek, alebo ich kombináciou. Na úplné pochopenie vzťahu medzi štruktúrou a vlastnosťami, najmä vplyvu rozvetvenia kefiek na mechanické vlastnosti, sú však potrebné ďalšie hĺbkové štúdie. Podobné merania môžu pomôcť charakterizovať mechanické vlastnosti povrchu iných ultramäkkých materiálov a zdravotníckych pomôcok.
Súbory údajov vygenerované a/alebo analyzované počas aktuálnej štúdie sú k dispozícii od príslušných autorov na základe odôvodnenej žiadosti.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. a Haugen, HJ Biologické reakcie na fyzikálne a chemické vlastnosti povrchov biomateriálov. Chemical society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM a Liu, X. Zlepšenie biomateriálov ľudského pôvodu pre tkanivové inžinierstvo. programovanie. polymér. veda. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. a kol. Návrh, klinická implementácia a imunitná odpoveď biomateriálov v regeneratívnej medicíne. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK a Farr GM Vylepšená metóda na stanovenie tvrdosti a modulu pružnosti pomocou experimentov s vtlačením s meraniami zaťaženia a posunutia. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historický pôvod testovania tvrdosti vtlačením. alma mater. the science. technologies. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Merania tvrdosti vtlačením na makro-, mikro- a nanomierke: Kritický prehľad. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD a Clapperich, SM Chyby v detekcii povrchu vedú k nadhodnoteniu modulu pri nanoindentácii mäkkých materiálov. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR a Yahya M.Yu. Vyhodnotenie metódy nanoindentácie na určenie mechanických vlastností heterogénnych nanokompozitov pomocou experimentálnych a výpočtových metód. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR a Owart, TS Mechanická charakterizácia mäkkých viskoelastických gélov pomocou indentácie a optimalizačnej inverznej analýzy konečných prvkov. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J a Chaneler D. Optimalizácia stanovenia viskoelasticity pomocou kompatibilných meracích systémov. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. a Pellillo, E. Nanoindentácia polymérnych povrchov. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. a Van Vliet KJ Charakterizácia viskoelastických mechanických vlastností vysoko elastických polymérov a biologických tkanív pomocou šokového vtlačenia. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Vyhodnotenie modulu pružnosti a adhéznej práce mäkkých materiálov pomocou rozšírenej Borodichovej-Galanovovej (BG) metódy a hlbokého vtlačenia. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. a kol. Nanoškálová morfológia a mechanické vlastnosti biomimetických polymérnych povrchov silikónovo-hydrogélových kontaktných šošoviek. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).