Благодарим вас за посещение Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для оптимальной работы рекомендуем вам обновить браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трёх слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий» для перемещения по трём слайдам одновременно или кнопки-ползунки в конце для перемещения по трём слайдам одновременно.
С разработкой новых сверхмягких материалов для медицинских устройств и биомедицинских применений комплексная характеристика их физико-механических свойств является одновременно важной и сложной задачей. Модифицированный метод наноиндентирования атомно-силовой микроскопии (АСМ) был применен для характеристики чрезвычайно низкого модуля поверхности новой биомиметической силикон-гидрогелевой контактной линзы lehfilcon A, покрытой слоем разветвленных полимерных щеточных структур. Этот метод позволяет точно определять точки контакта без эффектов вязкой экструзии при приближении к разветвленным полимерам. Кроме того, он позволяет определять механические характеристики отдельных щеточных элементов без эффекта пороупругости. Это достигается путем выбора зонда АСМ с конструкцией (размером наконечника, геометрией и жесткостью пружины), которая особенно подходит для измерения свойств мягких материалов и биологических образцов. Этот метод повышает чувствительность и точность измерения очень мягкого материала лефилкон А, обладающего чрезвычайно низким модулем упругости на поверхности (до 2 кПа) и чрезвычайно высокой эластичностью во внутренней водной среде (практически 100%). Результаты исследования поверхности не только выявили сверхмягкие свойства поверхности линзы из лефилкона А, но и показали, что модуль упругости разветвленных полимерных щеток сопоставим с модулем упругости кремний-водородной подложки. Этот метод характеризации поверхности может быть применен к другим сверхмягким материалам и медицинским изделиям.
Механические свойства материалов, предназначенных для прямого контакта с живой тканью, часто определяются биологической средой. Идеальное соответствие этих свойств материала помогает достичь желаемых клинических характеристик материала, не вызывая неблагоприятных клеточных реакций1,2,3. Для объемных однородных материалов характеристика механических свойств относительно проста благодаря наличию стандартных процедур и методов испытаний (например, микроиндентирования4,5,6). Однако для сверхмягких материалов, таких как гели, гидрогели, биополимеры, живые клетки и т. д., эти методы испытаний, как правило, неприменимы из-за ограничений разрешения измерений и неоднородности некоторых материалов7. С течением лет традиционные методы индентирования были модифицированы и адаптированы для характеристики широкого спектра мягких материалов, но многие методы по-прежнему страдают от серьезных недостатков, которые ограничивают их применение8,9,10,11,12,13. Отсутствие специализированных методов испытаний, которые могли бы точно и надежно характеризовать механические свойства сверхмягких материалов и поверхностных слоев, серьезно ограничивает их использование в различных приложениях.
В нашей предыдущей работе мы представили контактную линзу lehfilcon A (CL), мягкий гетерогенный материал со всеми сверхмягкими поверхностными свойствами, полученными из потенциально биомиметических конструкций, вдохновленных поверхностью роговицы глаза. Этот биоматериал был разработан путем прививки разветвленного сшитого полимерного слоя поли (2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина (MPC)) (PMPC) на силикон-гидрогель (SiHy) 15, разработанный для медицинских устройств на его основе. Этот процесс прививки создает на поверхности слой, состоящий из очень мягкой и высокоэластичной разветвленной полимерной щеточной структуры. Наша предыдущая работа подтвердила, что биомиметическая структура lehfilcon A CL обеспечивает превосходные поверхностные свойства, такие как улучшенное смачивание и предотвращение загрязнения, повышенная смазывающая способность и сниженная адгезия клеток и бактерий15,16. Кроме того, использование и разработка этого биомиметического материала также предполагает дальнейшее расширение на другие биомедицинские устройства. Следовательно, крайне важно охарактеризовать поверхностные свойства этого сверхмягкого материала и понять его механическое взаимодействие с глазом, чтобы создать всеобъемлющую базу знаний для поддержки будущих разработок и приложений. Большинство коммерчески доступных контактных линз SiHy состоят из однородной смеси гидрофильных и гидрофобных полимеров, которые образуют однородную структуру материала17. Было проведено несколько исследований для изучения их механических свойств с использованием традиционных методов испытаний на сжатие, растяжение и микроиндентирование18,19,20,21. Однако новая биомиметическая конструкция lehfilcon A CL делает его уникальным гетерогенным материалом, в котором механические свойства разветвленных полимерных щеточных структур значительно отличаются от свойств базовой подложки SiHy. Поэтому очень сложно точно количественно оценить эти свойства с помощью традиционных методов и методов индентирования. Перспективный метод использует метод наноиндентирования, реализованный в атомно-силовой микроскопии (АСМ), который использовался для определения механических свойств мягких вязкоупругих материалов, таких как биологические клетки и ткани, а также мягкие полимеры22,23,24,25,26,27,28,29,30. В наноиндентировании с помощью АСМ основные принципы наноиндентирования сочетаются с новейшими достижениями в технологии АСМ, обеспечивая повышенную чувствительность измерений и тестирование широкого спектра сверхмягких по своей природе материалов31,32,33,34,35,36. Кроме того, технология предлагает другие важные преимущества за счет использования различных геометрий индентора и зонда, а также возможности проведения испытаний в различных жидких средах.
АСМ наноиндентирование можно условно разделить на три основных компонента: (1) оборудование (датчики, детекторы, зонды и т. д.); (2) параметры измерения (такие как сила, смещение, скорость, размер наклонной плоскости и т. д.); (3) обработка данных (коррекция базовой линии, оценка точки касания, подгонка данных, моделирование и т. д.). Существенной проблемой этого метода является то, что несколько исследований в литературе, использующих АСМ наноиндентирование, сообщают о очень разных количественных результатах для одного и того же типа образца/ячейки/материала37,38,39,40,41. Например, Lekka et al. Было изучено и сравнено влияние геометрии зонда АСМ на измеренный модуль Юнга образцов механически однородного гидрогеля и гетерогенных клеток. Они сообщают, что значения модуля сильно зависят от выбора кантилевера и формы кончика, с наибольшим значением для зонда в форме пирамиды и наименьшим значением 42 для сферического зонда. Аналогично, Selhuber-Unkel et al. Было показано, как скорость индентора, размер индентора и толщина образцов полиакриламида (PAAM) влияют на модуль Юнга, измеренный методом наноиндентирования ACM43. Еще одним осложняющим фактором является отсутствие стандартных испытательных материалов с крайне низким модулем упругости и доступных методик испытаний. Это существенно затрудняет получение точных и надежных результатов. Тем не менее, этот метод весьма полезен для относительных измерений и сравнительной оценки образцов схожих типов, например, при использовании наноиндентирования АСМ для различения нормальных и раковых клеток44, 45.
При испытании мягких материалов методом наноиндентирования АСМ общим правилом является использование зонда с низкой константой упругости (k), близкой к модулю упругости образца, и полусферическим/круглым наконечником, чтобы первый зонд не прокалывал поверхность образца при первом контакте с мягкими материалами. Также важно, чтобы сигнал отклонения, генерируемый зондом, был достаточно сильным для обнаружения системой лазерного детектора24,34,46,47. В случае ультрамягких гетерогенных клеток, тканей и гелей еще одной проблемой является преодоление силы адгезии между зондом и поверхностью образца для обеспечения воспроизводимых и надежных измерений48,49,50. До недавнего времени большинство работ по наноиндентированию АСМ было сосредоточено на изучении механического поведения биологических клеток, тканей, гелей, гидрогелей и биомолекул с использованием относительно больших сферических зондов, обычно называемых коллоидными зондами (КЗ). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Эти наконечники имеют радиус от 1 до 50 мкм и обычно изготавливаются из боросиликатного стекла, полиметилметакрилата (ПММА), полистирола (ПС), диоксида кремния (SiO2) и алмазоподобного углерода (DLC). Хотя наноиндентирование CP-AFM часто является первым выбором для характеризации мягких образцов, оно имеет свои собственные проблемы и ограничения. Использование больших сферических наконечников микронного размера увеличивает общую площадь контакта наконечника с образцом и приводит к значительной потере пространственного разрешения. Для мягких неоднородных образцов, где механические свойства локальных элементов могут значительно отличаться от среднего по более широкой области, индентирование CP может скрыть любую неоднородность свойств в локальном масштабе52. Коллоидные зонды обычно изготавливаются путем прикрепления коллоидных сфер микронного размера к кантилеверам без наконечника с помощью эпоксидных клеев. Сам процесс изготовления сопряжен со множеством проблем и может привести к несоответствиям в процессе калибровки зонда. Кроме того, размер и масса коллоидных частиц напрямую влияют на основные калибровочные параметры кантилевера, такие как резонансная частота, жесткость пружины и чувствительность к прогибу56,57,58. Таким образом, общепринятые методы для традиционных АСМ-зондов, такие как температурная калибровка, могут не обеспечивать точной калибровки для КП, и для выполнения этих поправок могут потребоваться другие методы57,59,60,61. Типичные эксперименты по индентированию КП используют кантилевер с большими отклонениями для изучения свойств мягких образцов, что создает еще одну проблему при калибровке нелинейного поведения кантилевера при относительно больших отклонениях62,63,64. Современные методы индентирования коллоидных зондов обычно учитывают геометрию кантилевера, используемого для калибровки зонда, но игнорируют влияние коллоидных частиц, что создает дополнительную неопределенность в точности метода38,61. Аналогично, модули упругости, рассчитанные методом подгонки контактной модели, напрямую зависят от геометрии индентирующего зонда, и несоответствие характеристик наконечника и поверхности образца может привести к неточностям27, 65, 66, 67, 68. В некоторых недавних работах Спенсера и др. рассматриваются факторы, которые следует учитывать при исследовании мягких полимерных щёток методом наноиндентирования КП-АСМ. Авторы сообщают, что удержание вязкой жидкости в полимерных щётках в зависимости от скорости приводит к увеличению нагрузки на головку и, следовательно, к разным измерениям свойств, зависящих от скорости30, 69, 70, 71.
В этом исследовании мы охарактеризовали модуль поверхности ультрамягкого высокоэластичного материала lehfilcon A CL, используя модифицированный метод наноиндентирования АСМ. Учитывая свойства и новую структуру этого материала, диапазон чувствительности традиционного метода индентирования явно недостаточен для характеристики модуля этого чрезвычайно мягкого материала, поэтому необходимо использовать метод наноиндентирования АСМ с более высокой и более низкой чувствительностью. уровнем. После обзора недостатков и проблем существующих методов наноиндентирования коллоидных зондов АСМ мы показываем, почему мы выбрали меньший, специально разработанный зонд АСМ для устранения чувствительности, фонового шума, точной точки контакта, измерения модуля скорости мягких гетерогенных материалов, таких как зависимость удержания жидкости. и точной количественной оценки. Кроме того, мы смогли точно измерить форму и размеры кончика индентирования, что позволило нам использовать модель подгонки конус-сфера для определения модуля упругости без оценки площади контакта кончика с материалом. В данной работе количественно оцениваются два неявных предположения: полностью эластичные свойства материала и модуль упругости, не зависящий от глубины индентирования. Используя этот метод, мы сначала протестировали ультрамягкие эталоны с известным модулем упругости для количественной оценки метода, а затем применили его для исследования поверхностей двух различных материалов контактных линз. Ожидается, что этот метод исследования поверхностей наноиндентирования АСМ с повышенной чувствительностью будет применим к широкому спектру биомиметических гетерогенных ультрамягких материалов, потенциально используемых в медицинских устройствах и биомедицинских приложениях.
Контактные линзы Lehfilcon A (Alcon, Форт-Уэрт, Техас, США) и их силикон-гидрогелевые субстраты были выбраны для экспериментов по наноиндентированию. В эксперименте использовалось специально разработанное крепление для линз. Для установки линзы для тестирования ее аккуратно помещали на куполообразный штатив, следя за тем, чтобы внутрь не попали пузырьки воздуха, а затем фиксировали по краям. Отверстие в приспособлении в верхней части держателя линзы обеспечивает доступ к оптическому центру линзы для экспериментов по наноиндентированию, удерживая жидкость на месте. Это сохраняет линзы полностью увлажненными. В качестве тестового раствора использовали 500 мкл раствора для упаковки контактных линз. Для проверки количественных результатов были приготовлены коммерчески доступные неактивированные гидрогели полиакриламида (PAAM) из композиции полиакриламида-со-метилен-бисакриламида (чашки Петри Petrisoft диаметром 100 мм, Matrigen, Ирвайн, Калифорния, США) с известным модулем упругости 1 кПа. Нанесите 4–5 капель (приблизительно 125 мкл) фосфатного буферного раствора (PBS от Corning Life Sciences, Тьюксбери, Массачусетс, США) и 1 каплю раствора для контактных линз OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Во, Техас, США) на поверхность контакта гидрогеля АСМ-зонда.
Образцы субстратов Lehfilcon A CL и SiHy визуализировали с помощью системы FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM), оснащенной детектором Scanning Transmission Electron Microscope (STEM). Для подготовки образцов линзы сначала промывали водой и разрезали на клинья в форме пирога. Для достижения дифференциального контраста между гидрофильными и гидрофобными компонентами образцов в качестве красителя использовали 0,10% стабилизированный раствор RuO4, в который образцы погружали на 30 минут. Окрашивание lehfilcon A CL RuO4 важно не только для достижения улучшенного дифференциального контраста, но и помогает сохранить структуру разветвленных полимерных щеток в их первоначальном виде, которые затем видны на STEM-изображениях. Затем линзы промывали и дегидратировали в серии смесей этанола/воды с возрастающей концентрацией этанола. Образцы затем были отлиты с использованием эпоксидной смолы EMBed 812/Araldite, которая отверждалась в течение ночи при 70 °C. Образцы, полученные путем полимеризации смолы, были нарезаны на ультрамикротоме, и полученные тонкие срезы были визуализированы с помощью STEM-детектора в режиме низкого вакуума при ускоряющем напряжении 30 кВ. Та же система SEM использовалась для детальной характеристики зонда АСМ PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Санта-Барбара, Калифорния, США). Изображения SEM зонда АСМ были получены в типичном режиме высокого вакуума с ускоряющим напряжением 30 кВ. Получите изображения под разными углами и увеличениями, чтобы зафиксировать все детали формы и размера острия зонда АСМ. Все интересующие размеры острия на изображениях были измерены в цифровом виде.
Для визуализации и наноиндентирования образцов lehfilcon A CL, SiHy-подложки и гидрогеля PAAm использовался атомно-силовой микроскоп Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Санта-Барбара, Калифорния, США) с режимом «PeakForce QNM in Fluid». Для получения изображений высокого разрешения использовался зонд PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) с номинальным радиусом закругления острия 1 нм (Bruker) с частотой сканирования 0,50 Гц. Все изображения были получены в водном растворе.
Эксперименты по наноиндентированию АСМ проводились с использованием зонда PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Зонд АСМ имеет кремниевый наконечник на нитридном кантилевере толщиной 345 нм, длиной 54 мкм и шириной 4,5 мкм с резонансной частотой 45 кГц. Он специально разработан для характеристики и проведения количественных наномеханических измерений на мягких биологических образцах. Датчики индивидуально калибруются на заводе с предварительно откалиброванными настройками пружин. Жесткость пружин зондов, используемых в данном исследовании, находилась в диапазоне 0,05–0,1 Н/м. Для точного определения формы и размера наконечника зонд был подробно охарактеризован с помощью СЭМ. На рис. На рисунке 1а показана сканирующая электронная микрофотография зонда PFQNM-LC-A-CAL с высоким разрешением и малым увеличением, дающая целостное представление о конструкции зонда. На рис. На рисунке 1b показано увеличенное изображение верхней части кончика зонда, дающее информацию о форме и размере кончика. На самом конце игла представляет собой полусферу диаметром около 140 нм (рис. 1c). Ниже кончик сужается в коническую форму, достигая измеренной длины приблизительно 500 нм. За пределами области сужения кончик имеет цилиндрическую форму и заканчивается общей длиной кончика 1,18 мкм. Это основная функциональная часть кончика зонда. Кроме того, для тестирования в качестве коллоидного зонда также использовался большой сферический зонд из полистирола (PS) (Novascan Technologies, Inc., Бун, Айова, США) с диаметром кончика 45 мкм и жесткостью пружины 2 Н/м. с зондом PFQNM-LC-A-CAL 140 нм для сравнения.
Было сообщено, что жидкость может быть захвачена между зондом АСМ и структурой полимерной щетки во время наноиндентирования, что будет оказывать восходящее усилие на зонд АСМ до того, как он фактически коснется поверхности69. Этот эффект вязкой экструзии из-за удержания жидкости может изменить кажущуюся точку контакта, тем самым влияя на измерения модуля поверхности. Чтобы изучить влияние геометрии зонда и скорости индентирования на удержание жидкости, были построены кривые силы индентирования для образцов lehfilcon A CL с использованием зонда диаметром 140 нм при постоянных скоростях смещения 1 мкм/с и 2 мкм/с. диаметр зонда 45 мкм, фиксированная настройка силы 6 нН, достигнутая при 1 мкм/с. Эксперименты с зондом диаметром 140 нм проводились при скорости индентирования 1 мкм/с и установленном усилии 300 пН, выбранном для создания контактного давления в физиологическом диапазоне (1–8 кПа) верхнего века. давление 72. Мягкие готовые образцы гидрогеля ПАА при давлении 1 кПа испытывали на силу вдавливания 50 пН со скоростью 1 мкм/с с использованием зонда диаметром 140 нм.
Поскольку длина конической части кончика зонда PFQNM-LC-A-CAL составляет приблизительно 500 нм, для любой глубины индентирования < 500 нм можно с уверенностью предположить, что геометрия зонда во время индентирования останется верной его форме конуса. Кроме того, предполагается, что поверхность испытуемого материала будет демонстрировать обратимый упругий отклик, что также будет подтверждено в следующих разделах. Поэтому, в зависимости от формы и размера кончика, мы выбрали модель подгонки конус-сфера, разработанную Бриско, Себастьяном и Адамсом, которая доступна в программном обеспечении поставщика, для обработки наших экспериментов по наноиндентированию АСМ (NanoScope). Программное обеспечение для анализа данных разделения, Bruker) 73. Модель описывает зависимость силы от смещения F(δ) для конуса со сферическим дефектом на вершине. На рис. На рисунке 2 показана геометрия контакта при взаимодействии жесткого конуса со сферическим наконечником, где R — радиус сферического наконечника, a — радиус контакта, b — радиус контакта на конце сферического наконечника, δ — радиус контакта. глубина вдавливания, θ — полуугол конуса. Изображение этого зонда, полученное с помощью СЭМ, четко показывает, что сферический наконечник диаметром 140 нм по касательной переходит в конус, поэтому здесь b определяется только через R, т.е. b = R cos θ. Поставляемое поставщиком программное обеспечение предоставляет соотношение конус-сфера для расчета значений модуля Юнга (E) из данных о силе разделения, предполагая, что a > b. Соотношение:
Где F — сила вдавливания, E — модуль Юнга, ν — коэффициент Пуассона. Радиус контакта a можно оценить по формуле:
Схема контактной геометрии жесткого конуса со сферическим наконечником, запрессованного в материал контактной линзы Lefilcon с поверхностным слоем из разветвленных полимерных щеточек.
Если a ≤ b, то соотношение сводится к уравнению для обычного сферического индентора;
Мы полагаем, что взаимодействие индентирующего зонда с разветвлённой структурой полимерной щётки ПМПК приведёт к тому, что радиус контакта a будет больше радиуса сферического контакта b. Поэтому для всех количественных измерений модуля упругости, проведённых в данной работе, мы использовали зависимость, полученную для случая a > b.
Ультрамягкие биомиметические материалы, изучаемые в данном исследовании, были всесторонне визуализированы с помощью сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (СТЭМ) поперечного сечения образца и атомно-силовой микроскопии (АСМ) поверхности. Эта детальная характеристика поверхности была выполнена в качестве расширения нашей ранее опубликованной работы, в которой мы определили, что динамически разветвленная полимерная щеточная структура модифицированной ПМПК поверхности lehfilcon A CL проявляла схожие механические свойства с нативной тканью роговицы14. По этой причине мы называем поверхности контактных линз биомиметическими материалами14. На рис. 3a, b показаны поперечные сечения разветвленных полимерных щеточных структур ПМПК на поверхности субстрата lehfilcon A CL и необработанного субстрата SiHy, соответственно. Поверхности обоих образцов были дополнительно проанализированы с помощью изображений АСМ высокого разрешения, которые дополнительно подтвердили результаты анализа СТЭМ (рис. 3c, d). В совокупности эти изображения дают приблизительную длину разветвлённой полимерной щётки ПМПК в диапазоне 300–400 нм, что критически важно для интерпретации результатов наноиндентирования с помощью АСМ. Ещё одно важное наблюдение, полученное из этих изображений, заключается в том, что общая структура поверхности биомиметического материала CL морфологически отличается от структуры поверхности материала подложки SiHy. Это различие в морфологии поверхности может проявляться в процессе механического взаимодействия с индентирующим зондом АСМ и, следовательно, в измеряемых значениях модуля упругости.
Поперечные срезы, полученные с помощью СТЭМ, на подложке lehfilcon A CL (a) и подложке SiHy (b). Масштабная линейка: 500 нм. АСМ-изображения поверхности подложки lehfilcon A CL (c) и базовой подложки SiHy (d) (3 мкм × 3 мкм).
Биоинспирированные полимеры и полимерные щеточные структуры по своей природе мягкие и широко изучались и использовались в различных биомедицинских приложениях74,75,76,77. Поэтому важно использовать метод наноиндентирования АСМ, который позволяет точно и надежно измерять их механические свойства. Но в то же время уникальные свойства этих сверхмягких материалов, такие как чрезвычайно низкий модуль упругости, высокое содержание жидкости и высокая эластичность, часто затрудняют выбор правильного материала, формы и размера индентора. Это важно, чтобы индентор не прокалывал мягкую поверхность образца, что привело бы к ошибкам в определении точки контакта с поверхностью и площади контакта.
Для этого необходимо всестороннее понимание морфологии ультрамягких биомиметических материалов (lehfilcon A CL). Информация о размере и структуре разветвленных полимерных щеток, полученная с помощью метода визуализации, служит основой для механической характеристики поверхности с использованием методов наноиндентирования АСМ. Вместо сферических коллоидных зондов микронного размера мы выбрали зонд из нитрида кремния PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) с диаметром кончика 140 нм, специально разработанный для количественного картирования механических свойств биологических образцов 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 Обоснование использования относительно острых зондов по сравнению с традиционными коллоидными зондами можно объяснить структурными особенностями материала. Сравнивая размер кончика зонда (~140 нм) с разветвлёнными полимерными щётками на поверхности CL lehfilcon A, показанными на рис. 3а, можно сделать вывод, что кончик достаточно большой, чтобы непосредственно контактировать с этими щёточными структурами, что снижает вероятность их прокалывания. Для иллюстрации этого момента на рис. 4 представлено СТЭМ-изображение CL lehfilcon A и индентирующего кончика АСМ-зонда (в масштабе).
Схематическое изображение, показывающее STEM-изображение lehfilcon A CL и инденторного зонда ACM (выполнено в масштабе).
Кроме того, размер наконечника 140 нм достаточно мал, чтобы избежать риска возникновения любого из эффектов липкой экструзии, ранее описанных для полимерных щеток, полученных методом наноиндентирования CP-AFM69,71. Мы предполагаем, что из-за особой конусно-сферической формы и относительно малого размера этого наконечника АСМ (рис. 1) характер силовой кривой, генерируемой наноиндентированием lehfilcon A CL, не будет зависеть от скорости индентирования или скорости нагрузки/разгрузки. Следовательно, на него не влияют пороупругие эффекты. Для проверки этой гипотезы образцы lehfilcon A CL были индентированы с фиксированной максимальной силой с использованием зонда PFQNM-LC-A-CAL, но с двумя разными скоростями, и полученные кривые силы растяжения и отвода были использованы для построения графика силы (нН) при разделении (мкм), показанного на рисунке 5а. Очевидно, что кривые силы при нагрузке и разгрузке полностью перекрываются, и нет явных доказательств того, что сдвиг силы при нулевой глубине индентирования увеличивается с ростом скорости индентирования на рисунке, что позволяет предположить, что отдельные элементы щётки были охарактеризованы без эффекта пороупругости. Напротив, эффекты удержания жидкости (эффекты вязкой экструзии и пороупругости) очевидны для зонда АСМ диаметром 45 мкм при той же скорости индентирования и подчёркиваются гистерезисом между кривыми растяжения и отвода, как показано на рисунке 5b. Эти результаты подтверждают гипотезу и позволяют предположить, что зонды диаметром 140 нм являются хорошим выбором для исследования таких мягких поверхностей.
Кривые силы вдавливания lehfilcon A CL с использованием ACM; (a) с использованием зонда диаметром 140 нм при двух скоростях нагрузки, демонстрирующие отсутствие пороупругого эффекта во время поверхностного индентирования; (b) с использованием зондов диаметром 45 мкм и 140 нм. s показывают эффекты вязкой экструзии и пороупругости для больших зондов по сравнению с меньшими зондами.
Для характеристики ультрамягких поверхностей методы наноиндентирования АСМ должны иметь наилучший зонд для изучения свойств исследуемого материала. Помимо формы и размера зонда, чувствительность системы детектора АСМ, чувствительность к отклонению зонда в испытательной среде и жесткость кантилевера играют важную роль в определении точности и надежности наноиндентирования. измерений. Для нашей системы АСМ предел обнаружения позиционно-чувствительного детектора (PSD) составляет приблизительно 0,5 мВ и основан на предварительно калиброванной жесткости пружины и расчетной чувствительности к отклонению жидкости зонда PFQNM-LC-A-CAL, что соответствует теоретической чувствительности к нагрузке. составляет менее 0,1 пН. Следовательно, этот метод позволяет измерять минимальную силу индентирования ≤ 0,1 пН без какой-либо периферийной шумовой составляющей. Однако для системы АСМ практически невозможно снизить периферийный шум до этого уровня из-за таких факторов, как механическая вибрация и гидродинамика. Эти факторы ограничивают общую чувствительность метода наноиндентирования АСМ, а также приводят к фоновому шумовому сигналу приблизительно ≤ 10 пН. Для характеристики поверхности образцы подложки lehfilcon A CL и SiHy были индентированы в полностью гидратированных условиях с использованием зонда 140 нм для характеристики СЭМ, и полученные силовые кривые были наложены между силой (пН) и давлением. График разделения (мкм) показан на рисунке 6а. По сравнению с базовой подложкой SiHy, силовая кривая lehfilcon A CL четко показывает переходную фазу, начинающуюся в точке контакта с разветвленной полимерной щеткой и заканчивающуюся резким изменением наклона, отмечающим контакт кончика с нижележащим материалом. Эта переходная часть силовой кривой подчеркивает истинно упругое поведение разветвленной полимерной щетки на поверхности, о чем свидетельствует кривая сжатия, близко следующая за кривой растяжения, и контраст в механических свойствах между структурой щетки и объемным материалом SiHy. При сравнении lefilcon. Разделение средней длины разветвлённой полимерной щётки на СТЭМ-изображении PCS (рис. 3а) и её силовой кривой по оси абсцисс на рис. 3а. 6а показывает, что метод позволяет обнаружить кончик и разветвлённый полимер, достигающий самой верхней части поверхности. Контакт между структурами щётки. Кроме того, близкое перекрытие силовых кривых указывает на отсутствие эффекта удержания жидкости. В данном случае адгезия между иглой и поверхностью образца полностью отсутствует. Верхние участки силовых кривых для двух образцов перекрываются, что отражает сходство механических свойств материалов подложки.
(a) Кривые силы наноиндентирования АСМ для подложек lehfilcon A CL и подложек SiHy, (b) кривые силы, показывающие оценку точки контакта с использованием метода порогового значения фонового шума.
Чтобы изучить более тонкие детали силовой кривой, кривая растяжения образца lehfilcon A CL повторно построена на рис. 6b с максимальной силой 50 пН по оси y. Этот график предоставляет важную информацию об исходном фоновом шуме. Шум находится в диапазоне ±10 пН, что используется для точного определения точки контакта и расчета глубины вдавливания. Как сообщается в литературе, идентификация точек контакта имеет решающее значение для точной оценки свойств материала, таких как модуль85. Подход, включающий автоматическую обработку данных силовой кривой, показал улучшенное соответствие между подгонкой данных и количественными измерениями для мягких материалов86. В этой работе наш выбор точек контакта относительно прост и объективен, но он имеет свои ограничения. Наш консервативный подход к определению точки контакта может привести к слегка завышенным значениям модуля для меньших глубин вдавливания (<100 нм). Использование алгоритмического обнаружения точек касания и автоматизированной обработки данных может стать продолжением этой работы в будущем для дальнейшего совершенствования нашего метода. Таким образом, для собственного фонового шума порядка ±10 пН мы определяем точку контакта как первую точку данных на оси x на рисунке 6b со значением ≥10 пН. Затем, в соответствии с порогом шума 10 пН, вертикальная линия на уровне ~0,27 мкм отмечает точку контакта с поверхностью, после чего кривая растяжения продолжается до тех пор, пока подложка не достигнет глубины отпечатка ~270 нм. Интересно, что на основе размера разветвленных полимерных щеточных элементов (300–400 нм), измеренного с помощью метода визуализации, глубина отпечатка образца CL lehfilcon A, наблюдаемая с помощью метода порога фонового шума, составляет около 270 нм, что очень близко к размеру измерения с помощью СТЭМ. Эти результаты дополнительно подтверждают совместимость и применимость формы и размера наконечника АСМ-зонда для индентирования этой очень мягкой и высокоэластичной разветвлённой полимерной щёточной структуры. Эти данные также убедительно подтверждают эффективность нашего метода использования фонового шума в качестве порогового значения для определения точек контакта. Таким образом, любые количественные результаты, полученные с помощью математического моделирования и аппроксимации силовой кривой, должны быть относительно точными.
Количественные измерения методами наноиндентирования АСМ полностью зависят от математических моделей, используемых для отбора данных и последующего анализа. Поэтому важно учитывать все факторы, связанные с выбором индентора, свойствами материала и механикой их взаимодействия, прежде чем выбрать конкретную модель. В данном случае геометрия наконечника была тщательно охарактеризована с помощью микрофотографий, полученных с помощью СЭМ (рис. 1), и, основываясь на результатах, АСМ-наноиндентирующий зонд диаметром 140 нм с жестким конусом и сферической геометрией наконечника является хорошим выбором для характеристики образцов lehfilcon A CL79. Другим важным фактором, требующим тщательной оценки, является эластичность испытываемого полимерного материала. Хотя исходные данные наноиндентирования (рис. 5а и 6а) отчетливо выявляют особенности перекрытия кривых растяжения и сжатия, т.е. полное упругое восстановление материала, крайне важно подтвердить чисто упругий характер контактов. С этой целью были выполнены два последовательных индентирования в одном и том же месте на поверхности образца lehfilcon A CL со скоростью индентирования 1 мкм/с в условиях полной гидратации. Полученные данные силовой кривой представлены на рис. 7, и, как и ожидалось, кривые расширения и сжатия двух отпечатков практически идентичны, что свидетельствует о высокой эластичности разветвлённой структуры полимерной щётки.
Две кривые силы вдавливания в одном и том же месте на поверхности lehfilcon A CL указывают на идеальную эластичность поверхности линзы.
На основе информации, полученной с помощью СЭМ и СТЭМ-изображений кончика зонда и поверхности lehfilcon A CL соответственно, модель «конус-сфера» является разумным математическим представлением взаимодействия между кончиком зонда АСМ и тестируемым мягким полимерным материалом. Кроме того, для этой модели «конус-сфера» фундаментальные предположения об упругих свойствах импринтированного материала остаются верными для этого нового биомиметического материала и используются для количественной оценки модуля упругости.
После всесторонней оценки метода наноиндентирования АСМ и его компонентов, включая свойства зонда индентирования (форма, размер и жесткость пружины), чувствительность (оценка фонового шума и точки контакта) и модели подгонки данных (количественные измерения модуля), метод был использован. характеризовать коммерчески доступные сверхмягкие образцы для проверки количественных результатов. Коммерческий гидрогель полиакриламида (PAAM) с модулем упругости 1 кПа был испытан в гидратированных условиях с использованием зонда 140 нм. Подробная информация об испытании модуля и расчетах приведена в Дополнительной информации. Результаты показали, что средний измеренный модуль составил 0,92 кПа, а отклонение %RSD и процент (%) от известного модуля составили менее 10%. Эти результаты подтверждают точность и воспроизводимость метода наноиндентирования АСМ, использованного в данной работе для измерения модулей сверхмягких материалов. Поверхности образцов lehfilcon A CL и базовой подложки SiHy были дополнительно охарактеризованы с использованием того же метода наноиндентирования АСМ для изучения кажущегося контактного модуля ультрамягкой поверхности в зависимости от глубины индентирования. Кривые разделения силы индентирования были получены для трех образцов каждого типа (n = 3; одно отпечаток на образец) при силе 300 пН, скорости 1 мкм/с и полной гидратации. Кривая распределения силы индентирования была аппроксимирована с использованием модели конус-сфера. Для получения модуля в зависимости от глубины индентирования, на каждом шаге 20 нм от точки контакта был задан участок силовой кривой шириной 40 нм, и измерялись значения модуля на каждом шаге силовой кривой. Spin Cy et al. Аналогичный подход был использован для характеристики градиента модуля упругости полимерных щеток поли(лаурилметакрилата) (P12MA) с использованием наноиндентирования коллоидного зонда АСМ, и они согласуются с данными, полученными с использованием контактной модели Герца. Этот подход позволяет построить график зависимости кажущегося контактного модуля (кПа) от глубины индентирования (нм), как показано на рисунке 8, который иллюстрирует градиент кажущегося контактного модуля/глубины. Рассчитанный модуль упругости образца CL lehfilcon A находится в диапазоне 2–3 кПа в пределах верхних 100 нм образца, за пределами которого он начинает увеличиваться с глубиной. С другой стороны, при испытании базовой подложки SiHy без щеткообразной пленки на поверхности максимальная глубина индентирования, достигнутая при силе 300 пН, составляет менее 50 нм, а значение модуля, полученное из данных, составляет около 400 кПа, что сопоставимо со значениями модуля Юнга для объемных материалов.
Кажущийся контактный модуль упругости (кПа) в зависимости от глубины индентирования (нм) для подложек lehfilcon A CL и SiHy с использованием метода наноиндентирования АСМ с геометрией конус-сфера для измерения модуля.
Верхняя поверхность новой биомиметической разветвлённой полимерной щётки демонстрирует крайне низкий модуль упругости (2–3 кПа). Это соответствует свободно висящему концу разветвлённой полимерной щётки, как показано на СТЭМ-изображении. Хотя есть некоторые признаки градиента модуля на внешнем крае CL, основной высокомодульный субстрат оказывает большее влияние. Однако верхние 100 нм поверхности находятся в пределах 20% от общей длины разветвлённой полимерной щётки, поэтому разумно предположить, что измеренные значения модуля в этом диапазоне глубины отпечатка относительно точны и не сильно зависят от влияния нижнего объекта.
В связи с уникальной биомиметической конструкцией контактных линз lehfilcon A, состоящих из разветвленных полимерных щеток PMPC, привитых к поверхности SiHy-подложек, крайне сложно достоверно охарактеризовать механические свойства их поверхностных структур традиционными методами измерения. В данной работе мы представляем усовершенствованный метод наноиндентирования с помощью АСМ для точной характеристики ультрамягких материалов, таких как lefilcon A, с высоким содержанием воды и чрезвычайно высокой эластичностью. Этот метод основан на использовании АСМ-зонда, размер и геометрия кончика которого тщательно подобраны в соответствии со структурными размерами ультрамягких поверхностных элементов, подлежащих импринтингу. Такое сочетание размеров зонда и структуры обеспечивает повышенную чувствительность, позволяя нам измерять низкий модуль упругости и собственные упругие свойства разветвленных полимерных щеток, независимо от пороупругих эффектов. Результаты показали, что уникальные разветвленные полимерные щетки PMPC, характерные для поверхности линз, имели чрезвычайно низкий модуль упругости (до 2 кПа) и очень высокую эластичность (почти 100%) при испытаниях в водной среде. Результаты АСМ-наноиндентирования также позволили нам охарактеризовать кажущийся контактный модуль упругости/градиент глубины (30 кПа/200 нм) поверхности биомиметической линзы. Этот градиент может быть обусловлен разницей модулей упругости разветвленных полимерных щеток и SiHy-подложки, разветвленной структурой/плотностью полимерных щеток, или их комбинацией. Однако для полного понимания взаимосвязи между структурой и свойствами, особенно влияния разветвленности щеток на механические свойства, необходимы дальнейшие углубленные исследования. Аналогичные измерения могут помочь охарактеризовать механические свойства поверхности других ультрамягких материалов и медицинских изделий.
Наборы данных, созданные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, могут быть предоставлены соответствующими авторами по обоснованному запросу.
Рахмати, М., Сильва, Э.А., Резеланд, Дж.Э., Хейворд, К. и Хауген, Х.Дж. Биологические реакции на физические и химические свойства поверхностей биоматериалов. Химическое общество. Ред. 49, 5178–5224 (2020).
Чэнь, Ф.М. и Лю, Х. Улучшение биоматериалов человеческого происхождения для тканевой инженерии. программирование. полимер. наука. 53, 86 (2016).
Сэдтлер, К. и др. Разработка, клиническое применение и иммунный ответ биоматериалов в регенеративной медицине. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Оливер В.К. и Фарр Г.М. Усовершенствованный метод определения твердости и модуля упругости с использованием экспериментов по вдавливанию с измерениями нагрузки и смещения. J. Alma mater. Резервуар для хранения. 7, 1564–1583 (2011).
Уолли, С.М. Исторические истоки испытаний на твердость при вдавливании. alma mater. наука. технологии. 28, 1028–1044 (2012).
Бройтман, Э. Измерения твердости при вдавливании в макро-, микро- и наномасштабе: критический обзор. Tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Кауфман, Дж. Д. и Клапперих, С. М. Ошибки определения поверхности приводят к завышению модуля упругости при наноиндентировании мягких материалов. Журнал механики и биомедицинских наук. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Керимзаде А., Колур ССР, Аятоллахи М.Р., Бушроа А.Р. и Яхья М.Ю. Оценка метода наноиндентирования для определения механических характеристик гетерогенных нанокомпозитов с использованием экспериментальных и расчетных методов. наука. Дом 9, 15763 (2019).
Лю, К., ВанЛендингем, М.Р. и Оварт, Т.С. Механическая характеристика мягких вязкоупругих гелей с помощью индентирования и обратного конечно-элементного анализа на основе оптимизации. Журнал механики и поведения. Биомедицинская наука. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Эндрюс Дж. В., Боуэн Дж. и Чанелер Д. Оптимизация определения вязкоупругости с использованием совместимых измерительных систем. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Бриско, Б.Дж., Фиори, Л. и Пеллильо, Э. Наноиндентирование полимерных поверхностей. Журнал физики. D. Применение физики. 31, 2395 (1998).
Мияйлович А.С., Цин Б., Фортунато Д. и Ван Влит К.Дж. Характеристика вязкоупругих механических свойств высокоэластичных полимеров и биологических тканей с использованием ударного индентирования. Журнал биоматериалов. 71, 388–397 (2018).
Перепелкин Н.В., Ковалев А.Е., Горб С.Н., Бородич Ф.М. Оценка модуля упругости и работы адгезии мягких материалов с использованием расширенного метода Бородича-Галанова (БГ) и глубокого индентирования. мех. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Ши, Х. и др. Наномасштабная морфология и механические свойства биомиметических полимерных поверхностей силикон-гидрогелевых контактных линз. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).