Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий», чтобы переключаться между тремя слайдами за раз, или используйте ползунки в конце, чтобы переключаться между тремя слайдами за раз.
В связи с разработкой новых сверхмягких материалов для медицинских устройств и биомедицинских применений, всесторонняя характеристика их физических и механических свойств является одновременно важной и сложной задачей. Модифицированная методика наноиндентирования атомно-силовой микроскопии (АСМ) была применена для характеристики чрезвычайно низкого модуля упругости новой контактной линзы из биомиметического силиконового гидрогеля лехфилкон А, покрытой слоем разветвленных полимерных щеточных структур. Этот метод позволяет точно определять точки контакта без влияния вязкостной экструзии при приближении к разветвленным полимерам. Кроме того, он позволяет определять механические характеристики отдельных элементов щетки без влияния пороупругости. Это достигается путем выбора зонда АСМ с конструкцией (размер наконечника, геометрия и жесткость пружины), особенно подходящей для измерения свойств мягких материалов и биологических образцов. Этот метод повышает чувствительность и точность измерений очень мягкого материала лефилькона А, который обладает чрезвычайно низким модулем упругости на поверхности (до 2 кПа) и чрезвычайно высокой упругостью во внутренней (почти 100%) водной среде. Результаты исследования поверхности не только выявили сверхмягкие поверхностные свойства линзы из лефилькона А, но и показали, что модуль упругости разветвленных полимерных щеток сопоставим с модулем упругости кремний-водородной подложки. Этот метод характеризации поверхности может быть применен к другим сверхмягким материалам и медицинским устройствам.
Механические свойства материалов, предназначенных для непосредственного контакта с живыми тканями, часто определяются биологической средой. Идеальное соответствие этих свойств материала помогает достичь желаемых клинических характеристик без неблагоприятных клеточных реакций1,2,3. Для однородных материалов в объеме характеризация механических свойств относительно проста благодаря наличию стандартных процедур и методов испытаний (например, микроиндентирование4,5,6). Однако для сверхмягких материалов, таких как гели, гидрогели, биополимеры, живые клетки и т. д., эти методы испытаний, как правило, неприменимы из-за ограничений разрешения измерений и неоднородности некоторых материалов7. За прошедшие годы традиционные методы индентирования были модифицированы и адаптированы для характеризации широкого спектра мягких материалов, но многие методы по-прежнему имеют серьезные недостатки, ограничивающие их использование8,9,10,11,12,13. Отсутствие специализированных методов испытаний, которые могли бы точно и надежно характеризовать механические свойства сверхмягких материалов и поверхностных слоев, серьезно ограничивает их использование в различных областях применения.
В нашей предыдущей работе мы представили контактную линзу лехфилкон А (КЛ), мягкий гетерогенный материал со всеми свойствами сверхмягкой поверхности, полученными на основе потенциально биомиметических конструкций, вдохновленных поверхностью роговицы глаза. Этот биоматериал был разработан путем прививки разветвленного, сшитого полимерного слоя поли(2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина (МФХ)) (ПМФХ) на силиконовый гидрогель (SiHy) 15, разработанный для медицинских устройств. Этот процесс прививки создает на поверхности слой, состоящий из очень мягкой и высокоэластичной разветвленной полимерной щеточной структуры. Наша предыдущая работа подтвердила, что биомиметическая структура лехфилкон А КЛ обеспечивает превосходные поверхностные свойства, такие как улучшенное смачивание и предотвращение загрязнения, повышенная смазывающая способность и снижение адгезии клеток и бактерий15,16. Кроме того, использование и разработка этого биомиметического материала также предполагает дальнейшее расширение его применения в других биомедицинских устройствах. Поэтому крайне важно охарактеризовать поверхностные свойства этого сверхмягкого материала и понять его механическое взаимодействие с глазом, чтобы создать всеобъемлющую базу знаний для поддержки будущих разработок и применений. Большинство коммерчески доступных контактных линз из SiHy состоят из однородной смеси гидрофильных и гидрофобных полимеров, образующих однородную структуру материала17. Было проведено несколько исследований их механических свойств с использованием традиционных методов испытаний на сжатие, растяжение и микроиндентирование18,19,20,21. Однако новая биомиметическая конструкция контактных линз из леффилкона А делает их уникальным гетерогенным материалом, в котором механические свойства разветвленных полимерных щеточных структур значительно отличаются от свойств базовой подложки SiHy. Поэтому очень сложно точно количественно оценить эти свойства с помощью традиционных методов и методов индентирования. Перспективный метод использует метод наноиндентирования, реализованный в атомно-силовой микроскопии (АСМ), метод, который применялся для определения механических свойств мягких вязкоупругих материалов, таких как биологические клетки и ткани, а также мягкие полимеры22,23,24,25,26,27,28,29,30. В методе наноиндентирования АСМ фундаментальные принципы наноиндентирования сочетаются с последними достижениями в технологии АСМ, что обеспечивает повышенную чувствительность измерений и возможность тестирования широкого спектра сверхмягких материалов31,32,33,34,35,36. Кроме того, технология предлагает другие важные преимущества благодаря использованию различных геометрических форм индентора и зонда, а также возможности тестирования в различных жидких средах.
Наноиндентирование с помощью АСМ условно можно разделить на три основных компонента: (1) оборудование (датчики, детекторы, зонды и т. д.); (2) параметры измерения (такие как сила, перемещение, скорость, размер наклона и т. д.); (3) обработка данных (коррекция базовой линии, оценка точки касания, подгонка данных, моделирование и т. д.). Существенной проблемой этого метода является то, что в литературе существует ряд исследований, использующих наноиндентирование с помощью АСМ, которые сообщают о совершенно разных количественных результатах для одного и того же типа образца/клетки/материала37,38,39,40,41. Например, Лекка и др. изучали и сравнивали влияние геометрии зонда АСМ на измеренный модуль Юнга образцов механически однородного гидрогеля и гетерогенных клеток. Они сообщают, что значения модуля сильно зависят от выбора кантилевера и формы наконечника, при этом наибольшее значение наблюдается для зонда пирамидальной формы, а наименьшее – для сферического зонда42. Аналогично, Сельхубер-Ункель и др. Было показано, как скорость индентора, размер индентора и толщина образцов полиакриламида (ПААМ) влияют на модуль Юнга, измеренный методом наноиндентирования ACM43. Другим осложняющим фактором является отсутствие стандартных материалов для испытаний с чрезвычайно низким модулем упругости и бесплатных процедур испытаний. Это значительно затрудняет получение точных и достоверных результатов. Однако этот метод очень полезен для относительных измерений и сравнительной оценки между аналогичными типами образцов, например, при использовании наноиндентирования АСМ для различения нормальных клеток от раковых клеток 44, 45.
При исследовании мягких материалов методом наноиндентирования с помощью АСМ общее эмпирическое правило заключается в использовании зонда с низкой жесткостью пружины (k), которая точно соответствует модулю образца, и полусферическим/круглым наконечником, чтобы первый зонд не прокалывал поверхность образца при первом контакте с мягким материалом. Также важно, чтобы сигнал отклонения, генерируемый зондом, был достаточно сильным, чтобы его можно было обнаружить с помощью лазерной детекторной системы24,34,46,47. В случае ультрамягких гетерогенных клеток, тканей и гелей еще одной проблемой является преодоление силы адгезии между зондом и поверхностью образца для обеспечения воспроизводимых и надежных измерений48,49,50. До недавнего времени большая часть работ по наноиндентированию с помощью АСМ была сосредоточена на изучении механического поведения биологических клеток, тканей, гелей, гидрогелей и биомолекул с использованием относительно больших сферических зондов, обычно называемых коллоидными зондами (КП). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Эти наконечники имеют радиус от 1 до 50 мкм и обычно изготавливаются из боросиликатного стекла, полиметилметакрилата (ПММА), полистирола (ПС), диоксида кремния (SiO2) и алмазоподобного углерода (DLC). Хотя наноиндентирование CP-AFM часто является предпочтительным методом для характеризации мягких образцов, оно имеет свои проблемы и ограничения. Использование больших сферических наконечников микронного размера увеличивает общую площадь контакта наконечника с образцом и приводит к значительной потере пространственного разрешения. Для мягких, неоднородных образцов, где механические свойства локальных элементов могут значительно отличаться от средних значений на большей площади, индентирование CP может скрыть любую неоднородность свойств в локальном масштабе52. Коллоидные зонды обычно изготавливаются путем прикрепления коллоидных сфер микронного размера к кантилеверам без наконечников с помощью эпоксидных клеев. Сам производственный процесс сопряжен со множеством проблем и может привести к несоответствиям в процессе калибровки зонда. Кроме того, размер и масса коллоидных частиц напрямую влияют на основные параметры калибровки кантилевера, такие как резонансная частота, жесткость пружины и чувствительность к отклонению56,57,58. Таким образом, обычно используемые методы для обычных зондов АСМ, такие как температурная калибровка, могут не обеспечивать точную калибровку для CP, и для выполнения этих коррекций могут потребоваться другие методы57, 59, 60, 61. Типичные эксперименты по индентации CP используют кантилевер с большими отклонениями для изучения свойств мягких образцов, что создает еще одну проблему при калибровке нелинейного поведения кантилевера при относительно больших отклонениях62,63,64. Современные методы индентации коллоидных зондов обычно учитывают геометрию кантилевера, используемого для калибровки зонда, но игнорируют влияние коллоидных частиц, что создает дополнительную неопределенность в точности метода38,61. Аналогично, модули упругости, рассчитанные методом подгонки контактной модели, напрямую зависят от геометрии индентационного зонда, а несоответствие характеристик наконечника и поверхности образца может привести к неточностям27, 65, 66, 67, 68. В некоторых недавних работах Спенсера и др. освещаются факторы, которые следует учитывать при характеризации мягких полимерных щеток с использованием метода наноиндентирования CP-AFM. Они сообщили, что удержание вязкой жидкости в полимерных щетках в зависимости от скорости приводит к увеличению нагрузки на головку и, следовательно, к различным измерениям свойств, зависящих от скорости30,69,70,71.
В данном исследовании мы охарактеризовали поверхностный модуль ультрамягкого высокоэластичного материала лехфилкона А CL с помощью модифицированного метода наноиндентирования с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ). Учитывая свойства и новую структуру этого материала, диапазон чувствительности традиционного метода индентирования явно недостаточен для определения модуля этого чрезвычайно мягкого материала, поэтому необходимо использовать метод наноиндентирования с АСМ с более высокой и более низкой чувствительностью. После обзора недостатков и проблем существующих методов наноиндентирования с использованием коллоидных зондов АСМ мы показываем, почему мы выбрали меньший, специально разработанный зонд АСМ для устранения чувствительности, фонового шума, точечного контакта, измерения модуля скорости мягких гетерогенных материалов, таких как зависимость от удержания жидкости, и точной количественной оценки. Кроме того, мы смогли точно измерить форму и размеры наконечника индентирования, что позволило нам использовать модель соответствия конус-сфера для определения модуля упругости без оценки площади контакта наконечника с материалом. В данной работе количественно оцениваются два неявных предположения: полностью упругие свойства материала и модуль упругости, не зависящий от глубины вдавливания. Используя этот метод, мы сначала протестировали сверхмягкие эталоны с известным модулем упругости для количественной оценки метода, а затем использовали его для характеристики поверхностей двух различных материалов контактных линз. Ожидается, что этот метод характеризации поверхностей методом наноиндентирования с помощью АСМ с повышенной чувствительностью будет применим к широкому спектру биомиметических гетерогенных сверхмягких материалов с потенциальным использованием в медицинских устройствах и биомедицинских приложениях.
Для экспериментов по наноиндентированию были выбраны контактные линзы Lehfilcon A (Alcon, Форт-Уорт, Техас, США) и их силиконовые гидрогелевые подложки. В эксперименте использовалось специально разработанное крепление для линз. Для установки линзы для тестирования ее аккуратно помещали на куполообразную подставку, следя за тем, чтобы внутрь не попадали пузырьки воздуха, а затем фиксировали краями. Отверстие в креплении в верхней части держателя линзы обеспечивает доступ к оптическому центру линзы для экспериментов по наноиндентированию, удерживая при этом жидкость на месте. Это обеспечивает полное увлажнение линз. В качестве тестового раствора использовали 500 мкл раствора для упаковки контактных линз. Для проверки количественных результатов были приготовлены коммерчески доступные неактивированные полиакриламидные (ПААМ) гидрогели из композиции полиакриламид-со-метилен-бисакриламид (чашки Петри Petrisoft 100 мм, Matrigen, Ирвайн, Калифорния, США) с известным модулем упругости 1 кПа. Нанесите 4-5 капель (приблизительно 125 мкл) фосфатно-буферного солевого раствора (PBS от Corning Life Sciences, Тьюксбери, Массачусетс, США) и 1 каплю раствора для контактных линз OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Во, Техас, США) на границу раздела гидрогель-зонд АСМ.
Образцы Lehfilcon A CL и подложек SiHy визуализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа с полевой эмиссией FEI Quanta 250 (FEG SEM), оснащенного детектором сканирующего просвечивающего электронного микроскопа (STEM). Для подготовки образцов линзы сначала промывали водой и разрезали на клиновидные кусочки. Для достижения дифференциального контраста между гидрофильными и гидрофобными компонентами образцов использовали 0,10%-ный стабилизированный раствор RuO4 в качестве красителя, в который образцы погружали на 30 минут. Окрашивание Lehfilcon A CL красителем RuO4 важно не только для улучшения дифференциального контраста, но и помогает сохранить структуру разветвленных полимерных щеток в их первоначальном виде, что делает их видимыми на изображениях STEM. Затем образцы промывали и обезвоживали в серии смесей этанола и воды с возрастающей концентрацией этанола. Затем образцы были залиты эпоксидной смолой EMBed 812/Araldite, которая отверждалась в течение ночи при 70°C. Полученные в результате полимеризации смолы блоки образцов были разрезаны с помощью ультрамикротома, а полученные тонкие срезы визуализировались с помощью STEM-детектора в режиме низкого вакуума при ускоряющем напряжении 30 кВ. Та же система SEM использовалась для детальной характеристики зонда PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Санта-Барбара, Калифорния, США). Изображения зонда AFM были получены в типичном режиме высокого вакуума с ускоряющим напряжением 30 кВ. Изображения получали под разными углами и при разных увеличениях, чтобы зафиксировать все детали формы и размера кончика зонда AFM. Все интересующие размеры кончика на изображениях измерялись в цифровом виде.
Для визуализации и наноиндентирования образцов лехфилкона А CL, подложки SiHy и гидрогеля PAAm использовался атомно-силовой микроскоп Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Санта-Барбара, Калифорния, США) в режиме «PeakForce QNM in Fluid». Для экспериментов по визуализации использовался зонд PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) с номинальным радиусом наконечника 1 нм, позволяющий получать изображения высокого разрешения образца со скоростью сканирования 0,50 Гц. Все изображения были получены в водном растворе.
Эксперименты по наноиндентированию с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) проводились с использованием зонда PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Зонд АСМ имеет кремниевый наконечник на нитридном кантилевере толщиной 345 нм, длиной 54 мкм и шириной 4,5 мкм с резонансной частотой 45 кГц. Он специально разработан для характеризации и проведения количественных наномеханических измерений на мягких биологических образцах. Датчики калибруются индивидуально на заводе с предварительно откалиброванными настройками пружины. Коэффициенты жесткости пружин зондов, использованных в этом исследовании, находились в диапазоне 0,05–0,1 Н/м. Для точного определения формы и размера наконечника зонд был детально охарактеризован с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). На рис. 1а показана сканирующая электронная микрофотография зонда PFQNM-LC-A-CAL с высоким разрешением и низким увеличением, дающая целостное представление о конструкции зонда. На рис. На рисунке 1b показано увеличенное изображение верхней части наконечника зонда, предоставляющее информацию о его форме и размере. На самом конце игла представляет собой полусферу диаметром около 140 нм (рис. 1c). Ниже этого конца наконечник сужается в коническую форму, достигая измеренной длины приблизительно 500 нм. За пределами области сужения наконечник имеет цилиндрическую форму и заканчивается общей длиной 1,18 мкм. Это основная функциональная часть наконечника зонда. Кроме того, для тестирования в качестве коллоидного зонда использовался большой сферический полистироловый (ПС) зонд (Novascan Technologies, Inc., Бун, Айова, США) с диаметром наконечника 45 мкм и жесткостью пружины 2 Н/м. Для сравнения использовался зонд PFQNM-LC-A-CAL 140 нм.
Сообщалось, что во время наноиндентирования жидкость может задерживаться между зондом АСМ и полимерной щеточной структурой, оказывая восходящую силу на зонд АСМ до того, как он фактически коснется поверхности69. Этот эффект вязкого выдавливания, вызванный удержанием жидкости, может изменить кажущуюся точку контакта, тем самым влияя на измерения модуля поверхности. Для изучения влияния геометрии зонда и скорости индентирования на удержание жидкости были построены кривые силы индентирования для образцов контактных линз Lehfilcon A с использованием зонда диаметром 140 нм при постоянных скоростях смещения 1 мкм/с и 2 мкм/с. Диаметр зонда 45 мкм, фиксированная сила 6 нН, достигаемая при 1 мкм/с. Эксперименты с зондом диаметром 140 нм проводились при скорости индентирования 1 мкм/с и заданной силе 300 пН, выбранной для создания контактного давления в физиологическом диапазоне (1–8 кПа) верхнего века. Давление 72. Мягкие готовые образцы гидрогеля ПАА под давлением 1 кПа были протестированы на силу вдавливания 50 пН со скоростью 1 мкм/с с использованием зонда диаметром 140 нм.
Поскольку длина конической части наконечника зонда PFQNM-LC-A-CAL составляет приблизительно 500 нм, для любой глубины вдавливания < 500 нм можно с уверенностью предположить, что геометрия зонда во время вдавливания будет оставаться неизменной, сохраняя свою конусообразную форму. Кроме того, предполагается, что поверхность исследуемого материала будет демонстрировать обратимый упругий отклик, что также будет подтверждено в следующих разделах. Поэтому, в зависимости от формы и размера наконечника, для обработки наших экспериментов по наноиндентированию с помощью АСМ (NanoScope) мы выбрали модель аппроксимации конус-сфера, разработанную Бриско, Себастьяном и Адамсом, которая доступна в программном обеспечении производителя. Программное обеспечение для анализа данных разделения, Bruker) 73. Модель описывает зависимость силы от смещения F(δ) для конуса со сферическим дефектом вершины. На рис. На рисунке 2 показана геометрия контакта при взаимодействии жесткого конуса со сферическим наконечником, где R — радиус сферического наконечника, a — радиус контакта, b — радиус контакта на конце сферического наконечника, δ — радиус контакта, глубина вдавливания, θ — половинный угол конуса. Изображение этого зонда, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), четко показывает, что сферический наконечник диаметром 140 нм тангенциально переходит в конус, поэтому здесь b определяется только через R, т.е. b = R cos θ. Программное обеспечение, предоставленное производителем, обеспечивает соотношение конус-сфера для расчета значений модуля Юнга (E) из данных о силе разделения, предполагая, что a > b. Соотношение:
где F — сила вдавливания, E — модуль Юнга, ν — коэффициент Пуассона. Радиус контакта a можно оценить, используя следующую формулу:
Схема геометрии контакта жесткого конуса со сферическим наконечником, вдавленного в материал контактной линзы Lefilcon с поверхностным слоем из разветвленных полимерных щеток.
Если a ≤ b, соотношение сводится к уравнению для обычного сферического индентора;
Мы полагаем, что взаимодействие вдавливающего зонда с разветвленной структурой полимерной щетки ПМПК приведет к тому, что радиус контакта a будет больше сферического радиуса контакта b. Поэтому для всех количественных измерений модуля упругости, проведенных в данном исследовании, мы использовали зависимость, полученную для случая a > b.
Сверхмягкие биомиметические материалы, исследованные в данном исследовании, были всесторонне изучены с помощью сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM) поперечного сечения образца и атомно-силовой микроскопии (AFM) поверхности. Эта детальная характеристика поверхности была выполнена в рамках нашей ранее опубликованной работы, в которой мы определили, что динамически разветвленная полимерная щеточная структура поверхности контактной линзы лехфилкона А, модифицированной PMPC, обладает механическими свойствами, аналогичными свойствам нативной ткани роговицы¹⁴. По этой причине мы называем поверхности контактных линз биомиметическими материалами¹⁴. На рис. 3a,b показаны поперечные сечения разветвленных полимерных щеточных структур PMPC на поверхности подложки контактной линзы лехфилкона А и необработанной подложки SiHy соответственно. Поверхности обоих образцов были дополнительно проанализированы с помощью изображений AFM высокого разрешения, что дополнительно подтвердило результаты анализа STEM (рис. 3c, d). В совокупности эти изображения дают приблизительную длину разветвленной полимерной щетки PMPC в диапазоне 300–400 нм, что имеет решающее значение для интерпретации результатов наноиндентирования с помощью АСМ. Еще одно важное наблюдение, полученное из изображений, заключается в том, что общая структура поверхности биомиметического материала CL морфологически отличается от структуры подложки SiHy. Это различие в морфологии их поверхности может стать очевидным во время их механического взаимодействия с зондом АСМ и, следовательно, в измеренных значениях модуля упругости.
Изображения поперечного сечения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (STEM), (a) леффилкона A CL и (b) подложки SiHy. Масштабная линейка, 500 нм. Изображения поверхности подложки леффилкона A CL (c) и базовой подложки SiHy (d) (3 мкм × 3 мкм), полученные с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM) (3 мкм × 3 мкм).
Биоинспирированные полимеры и полимерные щеточные структуры по своей природе мягкие и широко изучаются и используются в различных биомедицинских приложениях74,75,76,77. Поэтому важно использовать метод наноиндентирования с помощью АСМ, который позволяет точно и надежно измерять их механические свойства. Но в то же время уникальные свойства этих сверхмягких материалов, такие как чрезвычайно низкий модуль упругости, высокое содержание жидкости и высокая эластичность, часто затрудняют выбор правильного материала, формы и размера индентирующего зонда. Это важно, чтобы индентор не прокалывал мягкую поверхность образца, что может привести к ошибкам в определении точки контакта с поверхностью и площади контакта.
Для этого необходимо всестороннее понимание морфологии ультрамягких биомиметических материалов (лефилькон А CL). Информация о размере и структуре разветвленных полимерных щеток, полученная с помощью метода визуализации, служит основой для механической характеристики поверхности с использованием методов наноиндентирования АСМ. Вместо сферических коллоидных зондов микронного размера мы выбрали зонд из нитрида кремния PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) с диаметром наконечника 140 нм, специально разработанный для количественного картирования механических свойств биологических образцов 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Обоснование использования относительно острых зондов по сравнению с обычными коллоидными зондами можно объяснить структурными особенностями материала. Сравнивая размер кончика зонда (~140 нм) с разветвленными полимерными щетками на поверхности CL лехфилкона А, показанными на рис. 3а, можно заключить, что кончик достаточно велик, чтобы вступать в прямой контакт с этими щеточными структурами, что снижает вероятность их прокалывания. Для иллюстрации этого момента на рис. 4 представлено изображение CL лехфилкона А, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (STEM), и вдавливающий наконечник зонда АСМ (в масштабе).
Схема, показывающая изображение лехфилкона А CL, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии (STEM), и зонд для индентации ACM (в масштабе).
Кроме того, размер наконечника 140 нм достаточно мал, чтобы избежать риска возникновения каких-либо эффектов липкого выдавливания, ранее описанных для полимерных щеток, полученных методом наноиндентирования CP-AFM69,71. Мы предполагаем, что благодаря особой конусообразно-сферической форме и относительно небольшому размеру этого наконечника AFM (рис. 1), характер кривой силы, генерируемой при наноиндентировании лехфилкона А CL, не будет зависеть от скорости индентирования или скорости нагружения/разгрузки. Следовательно, на нее не влияют пороупругие эффекты. Для проверки этой гипотезы образцы лехфилкона А CL были подвергнуты индентированию при фиксированной максимальной силе с использованием зонда PFQNM-LC-A-CAL, но при двух разных скоростях, и полученные кривые силы растяжения и отвода были использованы для построения графика зависимости силы (нН) от расстояния (мкм), как показано на рисунке 5a. Очевидно, что кривые силы при нагрузке и разгрузке полностью совпадают, и нет явных доказательств того, что сила сдвига при нулевой глубине вдавливания увеличивается со скоростью вдавливания на рисунке, что предполагает, что отдельные элементы щетки были охарактеризованы без учета пороупругого эффекта. Напротив, эффекты удержания жидкости (вязкостная экструзия и эффекты пороупругости) очевидны для зонда АСМ диаметром 45 мкм при той же скорости вдавливания и подчеркиваются гистерезисом между кривыми растяжения и отвода, как показано на рисунке 5b. Эти результаты подтверждают гипотезу и предполагают, что зонды диаметром 140 нм являются хорошим выбором для характеристики таких мягких поверхностей.
Кривые силы вдавливания лефилкона А CL с использованием ACM; (a) с использованием зонда диаметром 140 нм при двух скоростях нагружения, демонстрирующие отсутствие пороупругого эффекта во время вдавливания поверхности; (b) с использованием зондов диаметром 45 мкм и 140 нм. На рисунках показаны эффекты вязкой экструзии и пороупругости для больших зондов по сравнению с меньшими зондами.
Для характеризации ультрамягких поверхностей методы наноиндентирования с помощью АСМ (атомно-силовой микроскопии) должны иметь оптимальный зонд для изучения свойств исследуемого материала. Помимо формы и размера наконечника, важную роль в определении точности и надежности измерений наноиндентирования играют чувствительность детекторной системы АСМ, чувствительность к отклонению наконечника в тестовой среде и жесткость кантилевера. Для нашей системы АСМ предел обнаружения позиционно-чувствительного детектора (PSD) составляет приблизительно 0,5 мВ и основан на предварительно откалиброванной жесткости пружины и рассчитанной чувствительности зонда PFQNM-LC-A-CAL к отклонению жидкости, что соответствует теоретической чувствительности к нагрузке. Он составляет менее 0,1 пН. Таким образом, этот метод позволяет измерять минимальную силу вдавливания ≤ 0,1 пН без каких-либо периферийных шумовых составляющих. Однако для системы АСМ практически невозможно снизить периферийный шум до этого уровня из-за таких факторов, как механическая вибрация и гидродинамика. Эти факторы ограничивают общую чувствительность метода наноиндентирования АСМ, а также приводят к фоновому шуму приблизительно ≤ 10 пН. Для характеризации поверхности образцы лефилкона А CL и подложки SiHy были подвергнуты индентированию в полностью гидратированных условиях с использованием зонда 140 нм для характеризации СЭМ, а полученные кривые силы были наложены друг на друга между силой (пН) и давлением. График разделения (мкм) показан на рисунке 6а. По сравнению с базовой подложкой SiHy, кривая силы лефилкона А CL четко показывает переходную фазу, начинающуюся в точке контакта с разветвленной полимерной щеткой и заканчивающуюся резким изменением наклона, указывающим на контакт наконечника с нижележащим материалом. Эта переходная часть кривой силы подчеркивает истинно упругое поведение разветвленной полимерной щетки на поверхности, о чем свидетельствует кривая сжатия, точно следующая за кривой растяжения, и контраст механических свойств между структурой щетки и объемным материалом SiHy. При сравнении лефилкона. Разделение средней длины разветвленной полимерной щетки на STEM-изображении PCS (рис. 3a) и ее силовой кривой вдоль оси абсцисс на рис. 3a. 6a показывает, что метод позволяет обнаружить кончик и разветвленного полимера, достигающего самой вершины поверхности. Контакт между структурами щетки. Кроме того, близкое совпадение силовых кривых указывает на отсутствие эффекта удержания жидкости. В этом случае абсолютно отсутствует адгезия между иглой и поверхностью образца. Верхние участки силовых кривых для двух образцов совпадают, отражая сходство механических свойств материалов подложки.
(a) Кривые силы наноиндентирования, полученные с помощью АСМ, для подложек из леффилкона А и SiHy, (b) кривые силы, показывающие оценку точки контакта с использованием метода порогового значения фонового шума.
Для изучения более тонких деталей кривой силы, кривая растяжения образца лехфилкона А CL перестроена на рис. 6b с максимальной силой 50 пН вдоль оси y. Этот график предоставляет важную информацию об исходном фоновом шуме. Шум находится в диапазоне ±10 пН, что используется для точного определения точки контакта и расчета глубины вдавливания. Как сообщается в литературе, идентификация точек контакта имеет решающее значение для точной оценки свойств материала, таких как модуль упругости85. Подход, включающий автоматическую обработку данных кривой силы, показал улучшенное соответствие между аппроксимацией данных и количественными измерениями для мягких материалов86. В данной работе наш выбор точек контакта относительно прост и объективен, но имеет свои ограничения. Наш консервативный подход к определению точки контакта может привести к незначительному завышению значений модуля упругости для меньших глубин вдавливания (< 100 нм). Использование алгоритмического обнаружения точек контакта и автоматической обработки данных может стать продолжением этой работы в будущем для дальнейшего улучшения нашего метода. Таким образом, при собственном фоновом шуме порядка ±10 пН мы определяем точку контакта как первую точку данных на оси x на рисунке 6b со значением ≥10 пН. Затем, в соответствии с порогом шума 10 пН, вертикальная линия на уровне ~0,27 мкм отмечает точку контакта с поверхностью, после чего кривая растяжения продолжается до тех пор, пока подложка не достигнет глубины вдавливания ~270 нм. Интересно, что, исходя из размера разветвленных полимерных щеток (300–400 нм), измеренного с помощью метода визуализации, глубина вдавливания образца CL lehfilcon A, наблюдаемая с использованием метода порога фонового шума, составляет около 270 нм, что очень близко к размеру измерения с помощью STEM. Эти результаты дополнительно подтверждают совместимость и применимость формы и размера наконечника зонда АСМ для вдавливания этой очень мягкой и высокоэластичной разветвленной полимерной щеточной структуры. Эти данные также убедительно подтверждают наш метод использования фонового шума в качестве порогового значения для точного определения точек контакта. Таким образом, любые количественные результаты, полученные с помощью математического моделирования и аппроксимации кривых силы, должны быть относительно точными.
Количественные измерения с помощью методов наноиндентирования АСМ полностью зависят от математических моделей, используемых для отбора данных и последующего анализа. Поэтому перед выбором конкретной модели важно учитывать все факторы, связанные с выбором индентора, свойствами материала и механикой их взаимодействия. В данном случае геометрия наконечника была тщательно охарактеризована с помощью микрофотографий СЭМ (рис. 1), и на основе полученных результатов зонд для наноиндентирования АСМ диаметром 140 нм с жестким конусом и сферическим наконечником является хорошим выбором для характеристики образцов лехфилкона А CL79. Еще одним важным фактором, который необходимо тщательно оценить, является эластичность исследуемого полимерного материала. Хотя исходные данные наноиндентирования (рис. 5а и 6а) четко показывают особенности перекрытия кривых растяжения и сжатия, то есть полное упругое восстановление материала, крайне важно подтвердить чисто упругий характер контактов. С этой целью были проведены два последовательных вдавливания в одном и том же месте на поверхности образца лехфилкона А CL со скоростью вдавливания 1 мкм/с в условиях полного увлажнения. Полученные данные кривой зависимости силы от деформации показаны на рис. 7, и, как и ожидалось, кривые расширения и сжатия двух образцов практически идентичны, что подчеркивает высокую эластичность разветвленной полимерной щеточной структуры.
Две кривые зависимости силы вдавливания от силы вдавливания, полученные в одном и том же месте на поверхности контактной линзы из лефилькона А, указывают на идеальную эластичность поверхности линзы.
На основе информации, полученной из изображений зонда и поверхности лефилкона А, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), соответственно, конусно-сферическая модель представляет собой разумное математическое описание взаимодействия между зондом АСМ и исследуемым мягким полимерным материалом. Кроме того, для этой конусно-сферической модели сохраняются основные предположения об упругих свойствах импринтированного материала, что позволяет количественно оценить модуль упругости.
После всесторонней оценки метода наноиндентирования с помощью АСМ и его компонентов, включая свойства зонда для индентирования (форма, размер и жесткость пружины), чувствительность (фоновый шум и оценка точки контакта) и модели подгонки данных (количественные измерения модуля упругости), метод был использован для характеристики коммерчески доступных ультрамягких образцов с целью проверки количественных результатов. Коммерческий гидрогель полиакриламида (ПААМ) с модулем упругости 1 кПа был протестирован в гидратированном состоянии с использованием зонда диаметром 140 нм. Подробности тестирования модуля и расчетов приведены в дополнительной информации. Результаты показали, что средний измеренный модуль составил 0,92 кПа, а процентное стандартное отклонение (%RSD) и процентное отклонение (%) от известного модуля были менее 10%. Эти результаты подтверждают точность и воспроизводимость метода наноиндентирования с помощью АСМ, использованного в данной работе для измерения модулей упругости ультрамягких материалов. Поверхности образцов лехфилкона А CL и кремнийгидрогенизированной подложки были дополнительно охарактеризованы с использованием того же метода наноиндентирования АСМ для изучения кажущегося контактного модуля ультрамягкой поверхности в зависимости от глубины вдавливания. Кривые распределения силы вдавливания были построены для трех образцов каждого типа (n = 3; одно вдавливание на образец) при силе 300 пН, скорости 1 мкм/с и полной гидратации. Кривая распределения силы вдавливания была аппроксимирована с использованием модели конус-сфера. Для получения модуля, зависящего от глубины вдавливания, участок кривой силы шириной 40 нм был установлен с шагом 20 нм, начиная с точки контакта, и измерены значения модуля на каждом шаге кривой силы. Spin Cy et al. Аналогичный подход использовался для характеристики градиента модуля полимерных щеток из поли(лаурилметакрилата) (P12MA) с помощью коллоидного наноиндентирования с помощью АСМ-зонда, и полученные данные согласуются с данными, полученными с использованием контактной модели Герца. Этот подход позволяет построить график зависимости кажущегося контактного модуля (кПа) от глубины вдавливания (нм), как показано на рисунке 8, который иллюстрирует градиент кажущегося контактного модуля/глубины. Рассчитанный модуль упругости образца CL lehfilcon A находится в диапазоне 2–3 кПа в пределах верхних 100 нм образца, после чего он начинает увеличиваться с глубиной. С другой стороны, при тестировании подложки SiHy без щетинкообразной пленки на поверхности максимальная глубина вдавливания, достигнутая при силе 300 пН, составляет менее 50 нм, а значение модуля, полученное из данных, составляет около 400 кПа, что сопоставимо со значениями модуля Юнга для объемных материалов.
Зависимость кажущегося контактного модуля (кПа) от глубины вдавливания (нм) для подложек из лехфилкона А и SiHy, измеренная методом наноиндентирования с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) с использованием конусно-сферической геометрии.
Верхняя поверхность новой биомиметической разветвленной полимерной щетки демонстрирует чрезвычайно низкий модуль упругости (2–3 кПа). Это соответствует свободному концу разветвленной полимерной щетки, как показано на изображении STEM. Хотя на внешнем крае CL ​​наблюдается некоторый градиент модуля, основной высокомодульный субстрат оказывает большее влияние. Однако верхние 100 нм поверхности находятся в пределах 20% от общей длины разветвленной полимерной щетки, поэтому разумно предположить, что измеренные значения модуля в этом диапазоне глубины вдавливания являются относительно точными и не сильно зависят от влияния нижнего объекта.
Из-за уникальной биомиметической конструкции контактных линз из лефилкона А, состоящей из разветвленных полимерных щеток PMPC, привитых к поверхности кремнийгидрохлоридных подложек, надежно охарактеризовать механические свойства их поверхностных структур с помощью традиционных методов измерения крайне сложно. В данной работе представлен усовершенствованный метод наноиндентирования с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) для точной характеристики сверхмягких материалов, таких как лефилкон А, с высоким содержанием воды и чрезвычайно высокой эластичностью. Этот метод основан на использовании зонда АСМ, размер и геометрия наконечника которого тщательно подобраны в соответствии со структурными размерами сверхмягких поверхностных элементов, подлежащих импринтингу. Такое сочетание размеров зонда и структуры обеспечивает повышенную чувствительность, позволяя измерять низкий модуль упругости и присущие разветвленным полимерным щеткам упругие свойства, независимо от пороупругих эффектов. Результаты показали, что уникальные разветвленные полимерные щетки PMPC, характерные для поверхности линзы, обладают чрезвычайно низким модулем упругости (до 2 кПа) и очень высокой эластичностью (почти 100%) при тестировании в водной среде. Результаты наноиндентирования с помощью АСМ также позволили нам охарактеризовать кажущийся градиент контактного модуля/глубины (30 кПа/200 нм) поверхности биомиметической линзы. Этот градиент может быть обусловлен разницей модулей между разветвленными полимерными щетками и подложкой SiHy, или разветвленной структурой/плотностью полимерных щеток, или их комбинацией. Однако для полного понимания взаимосвязи между структурой и свойствами, особенно влияния разветвления щеток на механические свойства, необходимы дальнейшие углубленные исследования. Аналогичные измерения могут помочь охарактеризовать механические свойства поверхности других сверхмягких материалов и медицинских устройств.
Наборы данных, сгенерированные и/или проанализированные в ходе данного исследования, могут быть предоставлены соответствующими авторами по обоснованному запросу.
Рахмати, М., Сильва, Э. А., Резеланд, Дж. Э., Хейворд, К. и Хауген, Х. Дж. Биологические реакции на физические и химические свойства поверхностей биоматериалов. Химическое общество. Изд. 49, 5178–5224 (2020).
Чен, Ф.М. и Лю, С. Улучшение биоматериалов человеческого происхождения для тканевой инженерии. Программирование. Полимер. Наука. 53, 86 (2016).
Садлер, К. и др. Разработка, клиническое применение и иммунный ответ биоматериалов в регенеративной медицине. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Оливер В.К. и Фарр Г.М. Усовершенствованный метод определения твердости и модуля упругости с использованием экспериментов по вдавливанию с измерениями нагрузки и смещения. Журнал резервуаров для хранения Alma mater. 7, 1564–1583 (2011).
Уолли, С.М. Исторические истоки метода измерения твердости методом вдавливания. Альма-матер. Наука. Технологии. 28, 1028–1044 (2012).
Бройтман, Э. Измерения твердости методом индентации на макро-, микро- и наномасштабе: критический обзор. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Кауфман, Дж. Д. и Клапперих, С. М. Ошибки обнаружения поверхности приводят к переоценке модуля упругости при наноиндентировании мягких материалов. Журнал механики. поведения. Биомедицинская наука. Альма-матер. 2, 312–317 (2009).
Каримзаде А., Колур ССР, Аятоллахи М.Р., Бушроа А.Р. и Яхья М.Ю. Оценка метода наноиндентирования для определения механических характеристик гетерогенных нанокомпозитов с использованием экспериментальных и вычислительных методов. Наука. Дом 9, 15763 (2019).
Лю, К., ВанЛендингам, М.Р., и Оварт, Т.С. Механическая характеристика мягких вязкоупругих гелей методом индентации и обратного конечно-элементного анализа на основе оптимизации. Журнал механики, поведения, биомедицинских наук. альма-матер. 2, 355–363 (2009).
Эндрюс Дж. У., Боуэн Дж. и Шанелер Д. Оптимизация определения вязкоупругости с использованием совместимых измерительных систем. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Бриско, Б. Дж., Фиори, Л. и Пеллильо, Э. Наноиндентирование полимерных поверхностей. Журнал физики. Применение в физике. 31, 2395 (1998).
Мияилович А.С., Цин Б., Фортунато Д. и Ван Влиет К.Дж. Характеризация вязкоупругих механических свойств высокоэластичных полимеров и биологических тканей с использованием ударного вдавливания. Журнал биоматериалов. 71, 388–397 (2018).
Перепелкин Н.В., Ковалев А.Е., Горб С.Н., Бородич Ф.М. Оценка модуля упругости и работы адгезии мягких материалов с использованием расширенного метода Бородича-Галанова (БГ) и глубокого вдавливания. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Ши, Х. и др. Наноразмерная морфология и механические свойства биомиметических полимерных поверхностей силиконовых гидрогелевых контактных линз. Лангмюр 37, 13961–13967 (2021).