Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Folosiți o versiune de browser cu suport CSS limitat. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). În plus, pentru a asigura suport continuu, afișăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Afișează un carusel cu trei diapozitive simultan. Folosește butoanele Anterior și Următor pentru a parcurge trei diapozitive simultan sau folosește butoanele cursorului de la final pentru a parcurge trei diapozitive simultan.
Odată cu dezvoltarea de noi materiale ultra-moi pentru dispozitive medicale și aplicații biomedicale, caracterizarea completă a proprietăților lor fizice și mecanice este atât importantă, cât și dificilă. O tehnică de nanoindentare prin microscopie cu forță atomică modificată (AFM) a fost aplicată pentru a caracteriza modulul de suprafață extrem de scăzut al noii lentile de contact biomimetice din silicon hidrogel lehfilcon A, acoperite cu un strat de structuri de perie polimerice ramificate. Această metodă permite determinarea precisă a punctelor de contact fără efectele extrudării vâscoase la apropierea de polimeri ramificați. În plus, face posibilă determinarea caracteristicilor mecanice ale elementelor individuale de perie fără efectul poroelasticității. Acest lucru se realizează prin selectarea unei sonde AFM cu un design (dimensiunea vârfului, geometria și rata arcului) care este deosebit de potrivit pentru măsurarea proprietăților materialelor moi și ale probelor biologice. Această metodă îmbunătățește sensibilitatea și precizia pentru măsurarea exactă a materialului foarte moale lehfilcon A, care are un modul de elasticitate extrem de scăzut pe suprafață (până la 2 kPa) și o elasticitate extrem de ridicată în mediul apos intern (aproape 100%). Rezultatele studiului de suprafață nu numai că au relevat proprietățile ultra-moi ale suprafeței lentilei lehfilcon A, dar au arătat și că modulul periilor polimerice ramificate a fost comparabil cu cel al substratului de siliciu-hidrogen. Această tehnică de caracterizare a suprafeței poate fi aplicată și altor materiale ultra-moi și dispozitive medicale.
Proprietățile mecanice ale materialelor concepute pentru contactul direct cu țesutul viu sunt adesea determinate de mediul biologic. Potrivirea perfectă a acestor proprietăți ale materialului ajută la obținerea caracteristicilor clinice dorite ale materialului fără a provoca răspunsuri celulare adverse1,2,3. Pentru materialele omogene în vrac, caracterizarea proprietăților mecanice este relativ ușoară datorită disponibilității procedurilor și metodelor de testare standard (de exemplu, microindentare4,5,6). Cu toate acestea, pentru materialele ultra-moi, cum ar fi gelurile, hidrogelurile, biopolimerii, celulele vii etc., aceste metode de testare nu sunt în general aplicabile din cauza limitărilor de rezoluție a măsurătorilor și a neomogenității unor materiale7. De-a lungul anilor, metodele tradiționale de indentare au fost modificate și adaptate pentru a caracteriza o gamă largă de materiale moi, dar multe metode încă suferă de deficiențe serioase care le limitează utilizarea8,9,10,11,12,13. Lipsa metodelor de testare specializate care pot caracteriza cu precizie și fiabilitate proprietățile mecanice ale materialelor super-moi și ale straturilor de suprafață limitează sever utilizarea lor în diverse aplicații.
În lucrările noastre anterioare, am introdus lentila de contact lehfilcon A (CL), un material moale eterogen cu toate proprietățile de suprafață ultra-moi, derivate din designuri potențial biomimetice inspirate de suprafața corneei ochiului. Acest biomaterial a fost dezvoltat prin grefarea unui strat polimeric ramificat, reticulat, de poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolină (MPC)) (PMPC) pe un hidrogel siliconic (SiHy) 15 conceput pentru dispozitive medicale bazate pe. Acest proces de grefare creează un strat la suprafață constând dintr-o structură polimerică ramificată, de tip perie, foarte moale și extrem de elastică. Lucrările noastre anterioare au confirmat că structura biomimetică a lehfilcon A CL oferă proprietăți de suprafață superioare, cum ar fi prevenirea îmbunătățită a umidificării și a murdăririi, o lubricitate crescută și o aderență celulară și bacteriană redusă 15,16. În plus, utilizarea și dezvoltarea acestui material biomimetic sugerează, de asemenea, extinderea ulterioară la alte dispozitive biomedicale. Prin urmare, este esențial să se caracterizeze proprietățile de suprafață ale acestui material ultra-moale și să se înțeleagă interacțiunea sa mecanică cu ochiul, pentru a crea o bază de cunoștințe cuprinzătoare care să susțină dezvoltările și aplicațiile viitoare. Majoritatea lentilelor de contact SiHy disponibile comercial sunt compuse dintr-un amestec omogen de polimeri hidrofili și hidrofobi care formează o structură materială uniformă17. Au fost efectuate mai multe studii pentru a investiga proprietățile lor mecanice folosind metode tradiționale de testare la compresie, tracțiune și microindentare18,19,20,21. Cu toate acestea, designul biomimetic inovator al lehfilcon A CL îl face un material eterogen unic, în care proprietățile mecanice ale structurilor de perie polimerice ramificate diferă semnificativ de cele ale substratului de bază SiHy. Prin urmare, este foarte dificil să se cuantifice cu exactitate aceste proprietăți folosind metode convenționale și de indentare. O metodă promițătoare utilizează metoda de testare prin nanoindentare implementată în microscopia cu forță atomică (AFM), o metodă care a fost utilizată pentru a determina proprietățile mecanice ale materialelor vâscoelastice moi, cum ar fi celulele și țesuturile biologice, precum și ale polimerilor moi22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. În nanoindentarea AFM, elementele fundamentale ale testării prin nanoindentare sunt combinate cu cele mai recente progrese în tehnologia AFM pentru a oferi o sensibilitate sporită la măsurare și testarea unei game largi de materiale inerent supermoi31,32,33,34,35,36. În plus, tehnologia oferă alte avantaje importante prin utilizarea unor geometrii diferite, indentator și sondă, precum și prin posibilitatea testării în diverse medii lichide.
Nanoindentarea AFM poate fi împărțită condiționat în trei componente principale: (1) echipamente (senzori, detectori, sonde etc.); (2) parametri de măsurare (cum ar fi forța, deplasarea, viteza, dimensiunea rampei etc.); (3) Prelucrarea datelor (corecția liniei de bază, estimarea punctului de atingere, ajustarea datelor, modelarea etc.). O problemă semnificativă a acestei metode este faptul că mai multe studii din literatura de specialitate care utilizează nanoindentarea AFM raportează rezultate cantitative foarte diferite pentru același tip de probă/celulă/material37,38,39,40,41. De exemplu, Lekka și colab. au studiat și comparat influența geometriei sondei AFM asupra modulului Young măsurat al probelor de hidrogel omogen mecanic și celule eterogene. Aceștia raportează că valorile modulului depind în mare măsură de selecția consolei și de forma vârfului, cea mai mare valoare fiind pentru o sondă în formă de piramidă și cea mai mică valoare fiind de 42 pentru o sondă sferică. În mod similar, Selhuber-Unkel și colab. S-a demonstrat cum viteza indentatorului, dimensiunea indentatorului și grosimea probelor de poliacrilamidă (PAAM) afectează modulul Young măsurat prin nanoindentare ACM43. Un alt factor complicator este lipsa materialelor standard de testare cu modul extrem de scăzut și a procedurilor de testare gratuite. Acest lucru face foarte dificilă obținerea unor rezultate precise cu încredere. Cu toate acestea, metoda este foarte utilă pentru măsurători relative și evaluări comparative între tipuri de probe similare, de exemplu, utilizând nanoindentarea AFM pentru a distinge celulele normale de celulele canceroase 44, 45.
Atunci când se testează materiale moi cu nanoindentare AFM, o regulă generală este utilizarea unei sonde cu o constantă elastică (k) scăzută, care se potrivește îndeaproape cu modulul probei și un vârf emisferic/rotund, astfel încât prima sondă să nu străpungă suprafețele probei la primul contact cu materialele moi. De asemenea, este important ca semnalul de deviere generat de sondă să fie suficient de puternic pentru a fi detectat de sistemul detectorului laser24,34,46,47. În cazul celulelor, țesuturilor și gelurilor eterogene ultra-moi, o altă provocare este de a depăși forța adezivă dintre sondă și suprafața probei pentru a asigura măsurători reproductibile și fiabile48,49,50. Până de curând, majoritatea lucrărilor privind nanoindentarea AFM s-au concentrat pe studiul comportamentului mecanic al celulelor biologice, țesuturilor, gelurilor, hidrogelurilor și biomoleculelor utilizând sonde sferice relativ mari, denumite în mod obișnuit sonde coloidale (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Aceste vârfuri au o rază de la 1 la 50 µm și sunt fabricate în mod obișnuit din sticlă borosilicată, polimetacrilat de metil (PMMA), polistiren (PS), dioxid de siliciu (SiO2) și carbon asemănător diamantului (DLC). Deși nanoindentarea CP-AFM este adesea prima alegere pentru caracterizarea probelor moi, aceasta are propriile probleme și limitări. Utilizarea vârfurilor sferice mari, de dimensiuni micronice, crește suprafața totală de contact a vârfului cu proba și are ca rezultat o pierdere semnificativă a rezoluției spațiale. Pentru specimenele moi, neomogene, unde proprietățile mecanice ale elementelor locale pot diferi semnificativ de medie pe o suprafață mai largă, indentarea CP poate ascunde orice neomogenitate a proprietăților la scară locală52. Sondele coloidale sunt de obicei fabricate prin atașarea unor sfere coloidale de dimensiuni micronice la console fără vârf folosind adezivi epoxidici. Procesul de fabricație în sine este plin de numeroase probleme și poate duce la inconsecvențe în procesul de calibrare a sondei. În plus, dimensiunea și masa particulelor coloidale afectează direct principalii parametri de calibrare ai consolei, cum ar fi frecvența de rezonanță, rigiditatea arcului și sensibilitatea la deflexie56,57,58. Astfel, metodele utilizate în mod obișnuit pentru sondele AFM convenționale, cum ar fi calibrarea temperaturii, pot să nu ofere o calibrare precisă pentru CP, iar alte metode pot fi necesare pentru a efectua aceste corecții57, 59, 60, 61. Experimentele tipice de indentare CP utilizează console cu deviații mari pentru a studia proprietățile probelor moi, ceea ce creează o altă problemă la calibrarea comportamentului neliniar al consolei la deviații relativ mari62,63,64. Metodele moderne de indentare a sondelor coloidale iau de obicei în considerare geometria consolei utilizate pentru calibrarea sondei, dar ignoră influența particulelor coloidale, ceea ce creează o incertitudine suplimentară în acuratețea metodei38,61. În mod similar, modulii de elasticitate calculați prin ajustarea modelului de contact depind direct de geometria sondei de indentare, iar nepotrivirea dintre caracteristicile vârfului și cele ale suprafeței probei poate duce la inexactități27, 65, 66, 67, 68. Câteva lucrări recente ale lui Spencer și colab. evidențiază factorii care ar trebui luați în considerare la caracterizarea periilor polimerice moi folosind metoda de nanoindentare CP-AFM. Aceștia au raportat că retenția unui fluid vâscos în periile polimerice în funcție de viteză are ca rezultat o creștere a încărcării capului și, prin urmare, măsurători diferite ale proprietăților dependente de viteză30,69,70,71.
În acest studiu, am caracterizat modulul de suprafață al materialului ultra-moale, extrem de elastic, lehfilcon A CL, utilizând o metodă de nanoindentare AFM modificată. Având în vedere proprietățile și noua structură a acestui material, intervalul de sensibilitate al metodei tradiționale de indentare este în mod clar insuficient pentru a caracteriza modulul acestui material extrem de moale, așadar este necesară utilizarea unei metode de nanoindentare AFM cu o sensibilitate mai mare și un nivel de sensibilitate mai scăzut. După analizarea deficiențelor și problemelor tehnicilor existente de nanoindentare cu sonde AFM coloidale, arătăm de ce am ales o sondă AFM mai mică, proiectată la comandă, pentru a elimina sensibilitatea, zgomotul de fond, a identifica punctul de contact precis, a măsura modulul de viteză al materialelor eterogene moi, cum ar fi dependența de retenția de fluide, și a realiza o cuantificare precisă. În plus, am reușit să măsurăm cu precizie forma și dimensiunile vârfului de indentare, permițându-ne să folosim modelul de ajustare con-sferă pentru a determina modulul de elasticitate fără a evalua aria de contact a vârfului cu materialul. Cele două ipoteze implicite care sunt cuantificate în această lucrare sunt proprietățile materialului complet elastic și modulul independent de adâncimea de indentare. Folosind această metodă, am testat mai întâi standarde ultra-moi cu un modul cunoscut pentru a cuantifica metoda, apoi am folosit-o pentru a caracteriza suprafețele a două materiale diferite pentru lentile de contact. Se așteaptă ca această metodă de caracterizare a suprafețelor de nanoindentare AFM cu sensibilitate crescută să fie aplicabilă unei game largi de materiale ultra-moi eterogene biomimetice, cu utilizare potențială în dispozitive medicale și aplicații biomedicale.
Lentilele de contact Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, SUA) și substraturile lor de silicon hidrogel au fost alese pentru experimentele de nanoindentare. În experiment s-a utilizat o montură de lentilă special concepută. Pentru a instala lentila în vederea testării, aceasta a fost plasată cu grijă pe suportul în formă de cupolă, asigurându-se că nu pătrund bule de aer în interior, apoi fixată cu marginile. O gaură în dispozitivul de fixare din partea superioară a suportului lentilei oferă acces la centrul optic al lentilei pentru experimentele de nanoindentare, menținând în același timp lichidul la locul său. Acest lucru menține lentilele complet hidratate. 500 μl de soluție de ambalare a lentilelor de contact au fost utilizați ca soluție de testare. Pentru a verifica rezultatele cantitative, s-au preparat hidrogeluri de poliacrilamidă neactivată (PAAM) disponibile comercial dintr-o compoziție de poliacrilamidă-co-metilen-bisacrilamidă (vase Petri Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, SUA), un modul de elasticitate cunoscut de 1 kPa. Utilizați 4-5 picături (aproximativ 125 µl) de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS de la Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, SUA) și 1 picătură de soluție pentru lentile de contact OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, SUA) la interfața hidrogel AFM-sonda.
Probele de substraturi Lehfilcon A CL și SiHy au fost vizualizate utilizând un sistem de microscop electronic cu emisie de câmp FEI Quanta 250 (FEG SEM) echipat cu un detector de microscop electronic cu transmisie de scanare (STEM). Pentru a prepara probele, lentilele au fost mai întâi spălate cu apă și tăiate în pene de formă circulară. Pentru a obține un contrast diferențial între componentele hidrofile și hidrofobe ale probelor, s-a utilizat ca și colorant o soluție stabilizată de RuO4 0,10%, în care probele au fost imersate timp de 30 de minute. Colorația cu lehfilcon A CL RuO4 este importantă nu numai pentru a obține un contrast diferențial îmbunătățit, ci și pentru a ajuta la păstrarea structurii periilor polimerice ramificate în forma lor originală, care sunt apoi vizibile pe imaginile STEM. Acestea au fost apoi spălate și deshidratate într-o serie de amestecuri etanol/apă cu o concentrație crescătoare de etanol. Probele au fost apoi turnate cu epoxid EMBed 812/Araldite, care s-a întărit peste noapte la 70°C. Blocurile de probă obținute prin polimerizarea rășinii au fost tăiate cu un ultramicrotom, iar secțiunile subțiri rezultate au fost vizualizate cu un detector STEM în mod de vid scăzut la o tensiune de accelerare de 30 kV. Același sistem SEM a fost utilizat pentru caracterizarea detaliată a sondei AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, SUA). Imaginile SEM ale sondei AFM au fost obținute într-un mod tipic de vid înalt, cu o tensiune de accelerare de 30 kV. Achiziționați imagini la diferite unghiuri și măriri pentru a înregistra toate detaliile formei și dimensiunii vârfului sondei AFM. Toate dimensiunile vârfului de interes în imagini au fost măsurate digital.
Pentru vizualizarea și nanoindentarea probelor de lehfilcon A CL, substrat SiHy și hidrogel PAAm s-a utilizat un microscop cu forță atomică Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, SUA) cu modul „PeakForce QNM in Fluid”. Pentru experimentele de imagistică, s-a utilizat o sondă PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) cu o rază nominală a vârfului de 1 nm pentru a captura imagini de înaltă rezoluție ale probei la o rată de scanare de 0,50 Hz. Toate imaginile au fost realizate în soluție apoasă.
Experimentele de nanoindentare AFM au fost efectuate utilizând o sondă PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Sonda AFM are un vârf de siliciu pe o consolă de nitrură cu grosimea de 345 nm, lungimea de 54 µm și lățimea de 4,5 µm, cu o frecvență de rezonanță de 45 kHz. Este special concepută pentru a caracteriza și a efectua măsurători nanomecanice cantitative pe probe biologice moi. Senzorii sunt calibrați individual din fabrică, cu setări de arc pre-calibrate. Constantele de arc ale sondelor utilizate în acest studiu au fost cuprinse între 0,05 și 0,1 N/m. Pentru a determina cu precizie forma și dimensiunea vârfului, sonda a fost caracterizată în detaliu folosind SEM. În fig. Figura 1a prezintă o micrografie electronică cu scanare de înaltă rezoluție și mărire mică a sondei PFQNM-LC-A-CAL, oferind o imagine holistică a designului sondei. În fig. 1b este prezentată o vedere mărită a părții superioare a vârfului sondei, oferind informații despre forma și dimensiunea vârfului. La capătul extrem, acul este o emisferă cu diametrul de aproximativ 140 nm (Fig. 1c). Sub aceasta, vârful se subțiază într-o formă conică, atingând o lungime măsurată de aproximativ 500 nm. În afara regiunii de conicitate, vârful este cilindric și se termină cu o lungime totală de 1,18 µm. Aceasta este principala parte funcțională a vârfului sondei. În plus, pentru testarea ca sondă coloidală a fost utilizată și o sondă sferică mare din polistiren (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, SUA) cu un diametru al vârfului de 45 µm și o constantă a elasticității de 2 N/m, cu o sondă PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm, pentru comparație.
S-a raportat că lichidul poate fi prins între sonda AFM și structura periei polimerice în timpul nanoindentării, ceea ce va exercita o forță ascendentă asupra sondei AFM înainte ca aceasta să atingă efectiv suprafața69. Acest efect de extrudare vâscoasă datorat retenției de fluide poate modifica punctul aparent de contact, afectând astfel măsurătorile modulului de suprafață. Pentru a studia efectul geometriei sondei și al vitezei de indentare asupra retenției de fluide, au fost trasate curbe ale forței de indentare pentru probele lehfilcon A CL utilizând o sondă cu diametrul de 140 nm la rate de deplasare constante de 1 µm/s și 2 µm/s. Diametrul sondei de 45 µm, setarea forței fixe de 6 nN atinsă la 1 µm/s. Experimentele cu o sondă cu diametrul de 140 nm au fost efectuate la o viteză de indentare de 1 µm/s și o forță setată de 300 pN, aleasă pentru a crea o presiune de contact în intervalul fiziologic (1-8 kPa) al pleoapei superioare. presiunea 72. Probe moi gata preparate de hidrogel PAA cu o presiune de 1 kPa au fost testate pentru o forță de indentare de 50 pN la o viteză de 1 μm/s utilizând o sondă cu un diametru de 140 nm.
Întrucât lungimea părții conice a vârfului sondei PFQNM-LC-A-CAL este de aproximativ 500 nm, pentru orice adâncime de indentare < 500 nm se poate presupune în siguranță că geometria sondei în timpul indentării va rămâne fidelă formei sale conice. În plus, se presupune că suprafața materialului testat va prezenta un răspuns elastic reversibil, ceea ce va fi confirmat și în secțiunile următoare. Prin urmare, în funcție de forma și dimensiunea vârfului, am ales modelul de montare con-sferă dezvoltat de Briscoe, Sebastian și Adams, disponibil în software-ul furnizorului, pentru a procesa experimentele noastre de nanoindentare AFM (NanoScope). Software de analiză a datelor de separare, Bruker) 73. Modelul descrie relația forță-deplasare F(δ) pentru un con cu un defect sferic la vârf. În fig. Figura 2 prezintă geometria contactului în timpul interacțiunii unui con rigid cu un vârf sferic, unde R este raza vârfului sferic, a este raza de contact, b este raza de contact la capătul vârfului sferic, δ este adâncimea de indentare, θ este semiunghiul conului. Imaginea SEM a acestei sonde arată clar că vârful sferic cu diametrul de 140 nm se îmbină tangențial cu un con, deci aici b este definit doar prin R, adică b = R cos θ. Software-ul furnizat de furnizor oferă o relație con-sferă pentru a calcula valorile modulului lui Young (E) din datele de separare a forței, presupunând că a > b. Relația:
unde F este forța de indentare, E este modulul lui Young, ν este raportul lui Poisson. Raza de contact a poate fi estimată folosind:
Schema geometriei de contact a unui con rigid cu vârf sferic presat în materialul unei lentile de contact Lefilcon cu un strat superficial de perii polimerice ramificate.
Dacă a ≤ b, relația se reduce la ecuația pentru un indentator sferic convențional;
Considerăm că interacțiunea sondei de indentare cu structura ramificată a periei polimerice PMPC va face ca raza de contact a să fie mai mare decât raza de contact sferică b. Prin urmare, pentru toate măsurătorile cantitative ale modulului de elasticitate efectuate în acest studiu, am utilizat dependența obținută pentru cazul a > b.
Materialele biomimetice ultramoi studiate în acest studiu au fost imagistice complete utilizând microscopia electronică de transmisie cu scanare (STEM) a secțiunii transversale a probei și microscopia de forță atomică (AFM) a suprafeței. Această caracterizare detaliată a suprafeței a fost efectuată ca o extensie a lucrării noastre publicate anterior, în care am stabilit că structura polimerică de tip perie ramificată dinamic a suprafeței lehfilcon A CL modificată cu PMPC a prezentat proprietăți mecanice similare cu țesutul cornean nativ 14. Din acest motiv, ne referim la suprafețele lentilelor de contact ca materiale biomimetice 14. În fig. 3a,b sunt prezentate secțiuni transversale ale structurilor polimerice de tip perie PMPC ramificate pe suprafața unui substrat lehfilcon A CL și, respectiv, a unui substrat SiHy netratat. Suprafețele ambelor probe au fost analizate în continuare utilizând imagini AFM de înaltă rezoluție, care au confirmat în continuare rezultatele analizei STEM (Fig. 3c, d). Luate împreună, aceste imagini oferă o lungime aproximativă a structurii polimerice de tip perie ramificată PMPC la 300–400 nm, ceea ce este esențial pentru interpretarea măsurătorilor de nanoindentare AFM. O altă observație cheie derivată din imagini este că structura generală a suprafeței materialului biomimetic CL este diferită din punct de vedere morfologic de cea a materialului substrat SiHy. Această diferență în morfologia suprafeței lor poate deveni evidentă în timpul interacțiunii lor mecanice cu sonda AFM de indentare și, ulterior, în valorile modulului măsurate.
Imagini STEM în secțiune transversală ale (a) substratului lehfilcon A CL și (b) substratului SiHy. Bara de scală, 500 nm. Imagini AFM ale suprafeței substratului lehfilcon A CL (c) și ale substratului de bază SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polimerii bioinspirați și structurile polimerice de tip perie sunt inerent moi și au fost studiate și utilizate pe scară largă în diverse aplicații biomedicale74,75,76,77. Prin urmare, este important să se utilizeze metoda de nanoindentare AFM, care poate măsura cu precizie și fiabilitate proprietățile lor mecanice. Însă, în același timp, proprietățile unice ale acestor materiale ultra-moi, cum ar fi modulul de elasticitate extrem de scăzut, conținutul ridicat de lichid și elasticitatea ridicată, fac adesea dificilă alegerea materialului, formei și dimensiunii potrivite a sondei de indentare. Acest lucru este important pentru ca indentatorul să nu perforeze suprafața moale a probei, ceea ce ar duce la erori în determinarea punctului de contact cu suprafața și a zonei de contact.
Pentru aceasta, este esențială o înțelegere cuprinzătoare a morfologiei materialelor biomimetice ultra-moi (lehfilcon A CL). Informațiile despre dimensiunea și structura periilor polimerice ramificate obținute prin metoda imagistică oferă baza pentru caracterizarea mecanică a suprafeței folosind tehnici de nanoindentare AFM. În loc de sonde coloidale sferice de dimensiuni micronice, am ales sonda de nitrură de siliciu PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) cu un diametru al vârfului de 140 nm, special concepută pentru cartografierea cantitativă a proprietăților mecanice ale probelor biologice 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Rațiunea utilizării unor sonde relativ ascuțite în comparație cu sondele coloidale convenționale poate fi explicată prin caracteristicile structurale ale materialului. Comparând dimensiunea vârfului sondei (~140 nm) cu periile polimerice ramificate de pe suprafața lehfilconului A CL, prezentate în Fig. 3a, se poate concluziona că vârful este suficient de mare pentru a intra în contact direct cu aceste structuri de perie, ceea ce reduce șansa ca vârful să le străpungă. Pentru a ilustra acest punct, în Fig. 4 este o imagine STEM a lehfilconului A CL și a vârfului indentat al sondei AFM (desenat la scară).
Schemă care prezintă imaginea STEM a lehfilcon A CL și a unei sonde de indentare ACM (desenată la scară).
În plus, dimensiunea vârfului de 140 nm este suficient de mică pentru a evita riscul oricăruia dintre efectele de extrudare lipicioasă raportate anterior pentru periile polimerice produse prin metoda de nanoindentare CP-AFM69,71. Presupunem că, datorită formei conice speciale și dimensiunii relativ mici a acestui vârf AFM (Fig. 1), natura curbei de forță generată de nanoindentarea lehfilcon A CL nu va depinde de viteza de indentare sau de viteza de încărcare/descărcare. Prin urmare, aceasta nu este afectată de efectele poroelastice. Pentru a testa această ipoteză, probele de lehfilcon A CL au fost indentate la o forță maximă fixă ​​folosind o sondă PFQNM-LC-A-CAL, dar la două viteze diferite, iar curbele forței de tracțiune și retragere rezultate au fost utilizate pentru a reprezenta grafic forța (nN) la separare (µm), așa cum se arată în Figura 5a. Este clar că curbele de forță în timpul încărcării și descărcării se suprapun complet și nu există dovezi clare că forța de forfecare la adâncimea zero de indentare crește odată cu viteza de indentare în figură, ceea ce sugerează că elementele individuale ale periei au fost caracterizate fără un efect poroelastic. În schimb, efectele de retenție a fluidelor (extrudare vâscoasă și efecte de poroelasticitate) sunt evidente pentru sonda AFM cu diametrul de 45 µm la aceeași viteză de indentare și sunt evidențiate de histerezisul dintre curbele de întindere și retragere, așa cum se arată în Figura 5b. Aceste rezultate susțin ipoteza și sugerează că sondele cu diametrul de 140 nm sunt o alegere bună pentru caracterizarea unor astfel de suprafețe moi.
Curbele forței de indentare lehfilcon A CL folosind ACM; (a) folosind o sondă cu diametrul de 140 nm la două rate de încărcare, demonstrând absența unui efect poroelastic în timpul indentării suprafeței; (b) folosind sonde cu diametrul de 45 µm și 140 nm. Figurile prezintă efectele extrudării vâscoase și ale poroelasticității pentru sonde mari în comparație cu sondele mai mici.
Pentru a caracteriza suprafețele ultramoi, metodele de nanoindentare AFM trebuie să aibă cea mai bună sondă pentru a studia proprietățile materialului studiat. Pe lângă forma și dimensiunea vârfului, sensibilitatea sistemului detectorului AFM, sensibilitatea la deformarea vârfului în mediul de testare și rigiditatea consolei joacă un rol important în determinarea preciziei și fiabilității măsurătorilor de nanoindentare. Pentru sistemul nostru AFM, limita de detecție a detectorului sensibil la poziție (PSD) este de aproximativ 0,5 mV și se bazează pe rata arcului precalibrată, iar sensibilitatea calculată la deformarea fluidului a sondei PFQNM-LC-A-CAL, care corespunde sensibilității teoretice la sarcină, este mai mică de 0,1 pN. Prin urmare, această metodă permite măsurarea unei forțe minime de indentare ≤ 0,1 pN fără nicio componentă de zgomot periferic. Cu toate acestea, este aproape imposibil ca un sistem AFM să reducă zgomotul periferic la acest nivel din cauza unor factori precum vibrațiile mecanice și dinamica fluidelor. Acești factori limitează sensibilitatea generală a metodei de nanoindentare AFM și, de asemenea, duc la un semnal de zgomot de fond de aproximativ ≤ 10 pN. Pentru caracterizarea suprafeței, probele de lehfilcon A CL și substrat SiHy au fost indentate în condiții complet hidratate folosind o sondă de 140 nm pentru caracterizarea SEM, iar curbele de forță rezultate au fost suprapuse între forță (pN) și presiune. Graficul de separare (µm) este prezentat în Figura 6a. Comparativ cu substratul de bază SiHy, curba de forță lehfilcon A CL arată clar o fază de tranziție care începe în punctul de contact cu peria polimerică bifurcată și se termină cu o schimbare bruscă a pantei, marcând contactul vârfului cu materialul de bază. Această parte de tranziție a curbei de forță evidențiază comportamentul cu adevărat elastic al periei polimerice ramificate la suprafață, după cum reiese din curba de compresie care urmează îndeaproape curba de tensiune și contrastul proprietăților mecanice dintre structura periei și materialul voluminos SiHy. La compararea lefilconului... Separarea lungimii medii a unei perii de polimer ramificat în imaginea STEM a PCS (Fig. 3a) și a curbei sale de forță de-a lungul abscisei din Fig. 3a. 6a arată că metoda este capabilă să detecteze vârful și polimerul ramificat care ajung în partea superioară a suprafeței. Contact între structurile periei. În plus, suprapunerea strânsă a curbelor de forță nu indică niciun efect de retenție a lichidului. În acest caz, nu există absolut nicio aderență între ac și suprafața probei. Secțiunile superioare ale curbelor de forță pentru cele două probe se suprapun, reflectând similaritatea proprietăților mecanice ale materialelor substratului.
(a) Curbe ale forței de nanoindentare AFM pentru substraturi lehfilcon A CL și substraturi SiHy, (b) curbe ale forței care arată estimarea punctului de contact folosind metoda pragului zgomotului de fond.
Pentru a studia detaliile mai fine ale curbei de forță, curba de tensiune a eșantionului lehfilcon A CL este re-reprezentată în Fig. 6b cu o forță maximă de 50 pN de-a lungul axei y. Acest grafic oferă informații importante despre zgomotul de fond original. Zgomotul este în intervalul de ±10 pN, care este utilizat pentru a determina cu precizie punctul de contact și a calcula adâncimea de indentare. Așa cum este raportat în literatura de specialitate, identificarea punctelor de contact este esențială pentru a evalua cu precizie proprietățile materialelor, cum ar fi modulul85. O abordare care implică procesarea automată a datelor curbei de forță a demonstrat o potrivire îmbunătățită între ajustarea datelor și măsurătorile cantitative pentru materiale moi86. În această lucrare, alegerea noastră a punctelor de contact este relativ simplă și obiectivă, dar are limitele sale. Abordarea noastră conservatoare pentru determinarea punctului de contact poate duce la valori ale modulului ușor supraestimate pentru adâncimi de indentare mai mici (< 100 nm). Utilizarea detectării punctelor de contact bazate pe algoritmi și a procesării automate a datelor ar putea fi o continuare a acestei lucrări în viitor pentru a îmbunătăți metoda noastră. Astfel, pentru un zgomot de fond intrinsec de ordinul a ±10 pN, definim punctul de contact ca fiind primul punct de date pe axa x din Figura 6b, cu o valoare de ≥10 pN. Apoi, în conformitate cu pragul de zgomot de 10 pN, o linie verticală la nivelul de ~0,27 µm marchează punctul de contact cu suprafața, după care curba de întindere continuă până când substratul atinge adâncimea de indentare de ~270 nm. Interesant este că, pe baza dimensiunii caracteristicilor periei polimerice ramificate (300–400 nm) măsurate folosind metoda imagistică, adâncimea de indentare a probei CL lehfilcon A observată folosind metoda pragului de zgomot de fond este de aproximativ 270 nm, ceea ce este foarte aproape de dimensiunea măsurată cu STEM. Aceste rezultate confirmă în continuare compatibilitatea și aplicabilitatea formei și dimensiunii vârfului sondei AFM pentru indentarea acestei structuri de perie polimerică ramificată foarte moale și extrem de elastică. Aceste date oferă, de asemenea, dovezi puternice care susțin metoda noastră de utilizare a zgomotului de fond ca prag pentru identificarea punctelor de contact. Astfel, orice rezultate cantitative obținute din modelarea matematică și ajustarea curbei de forță ar trebui să fie relativ precise.
Măsurătorile cantitative prin metode de nanoindentare AFM depind complet de modelele matematice utilizate pentru selecția datelor și analiza ulterioară. Prin urmare, este important să se ia în considerare toți factorii legați de alegerea indentatorului, proprietățile materialului și mecanica interacțiunii acestora înainte de a alege un anumit model. În acest caz, geometria vârfului a fost caracterizată cu atenție folosind micrografii SEM (Fig. 1), iar pe baza rezultatelor, sonda de nanoindentare AFM cu diametrul de 140 nm, cu con dur și geometrie sferică a vârfului, este o alegere bună pentru caracterizarea probelor de lehfilcon A CL79. Un alt factor important care trebuie evaluat cu atenție este elasticitatea materialului polimeric testat. Deși datele inițiale ale nanoindentației (Fig. 5a și 6a) conturează clar caracteristicile suprapunerii curbelor de tensiune și compresie, adică recuperarea elastică completă a materialului, este extrem de important să se confirme natura pur elastică a contactelor. În acest scop, au fost efectuate două indentări succesive în aceeași locație pe suprafața probei lehfilcon A CL la o rată de indentare de 1 µm/s în condiții de hidratare completă. Datele curbei de forță rezultate sunt prezentate în fig. 7 și, așa cum era de așteptat, curbele de expansiune și compresie ale celor două imprimări sunt aproape identice, evidențiind elasticitatea ridicată a structurii periei polimerice ramificate.
Două curbe ale forței de indentare în aceeași locație pe suprafața lehfilcon A CL indică elasticitatea ideală a suprafeței lentilei.
Pe baza informațiilor obținute din imaginile SEM și STEM ale vârfului sondei, respectiv ale suprafeței lehfilcon A CL, modelul con-sferă este o reprezentare matematică rezonabilă a interacțiunii dintre vârful sondei AFM și materialul polimeric moale testat. În plus, pentru acest model con-sferă, ipotezele fundamentale despre proprietățile elastice ale materialului imprimat sunt valabile pentru acest nou material biomimetic și sunt utilizate pentru a cuantifica modulul de elasticitate.
După o evaluare cuprinzătoare a metodei de nanoindentare AFM și a componentelor acesteia, inclusiv proprietățile sondei de indentare (formă, dimensiune și rigiditate a arcului), sensibilitatea (estimarea zgomotului de fond și a punctului de contact) și modelele de ajustare a datelor (măsurători cantitative ale modulului), metoda a fost utilizată pentru a caracteriza probele ultra-moi disponibile comercial pentru a verifica rezultatele cantitative. Un hidrogel comercial de poliacrilamidă (PAAM) cu un modul de elasticitate de 1 kPa a fost testat în condiții hidratate utilizând o sondă de 140 nm. Detalii despre testarea modulului și calcule sunt furnizate în Informațiile suplimentare. Rezultatele au arătat că modulul mediu măsurat a fost de 0,92 kPa, iar %RSD și abaterea procentuală (%) de la modulul cunoscut au fost mai mici de 10%. Aceste rezultate confirmă acuratețea și reproductibilitatea metodei de nanoindentare AFM utilizată în această lucrare pentru a măsura modulii materialelor ultra-moi. Suprafețele probelor lehfilcon A CL și substratul de bază SiHy au fost caracterizate în continuare utilizând aceeași metodă de nanoindentare AFM pentru a studia modulul de contact aparent al suprafeței ultra-moi în funcție de adâncimea de indentare. Curbele de separare a forței de indentare au fost generate pentru trei specimene din fiecare tip (n = 3; o indentare per specimen) la o forță de 300 pN, o viteză de 1 µm/s și hidratare completă. Curba de partajare a forței de indentare a fost aproximată folosind un model con-sferă. Pentru a obține un modul dependent de adâncimea de indentare, o porțiune a curbei de forță cu lățimea de 40 nm a fost setată la fiecare increment de 20 nm începând de la punctul de contact și s-au măsurat valorile modulului la fiecare pas al curbei de forță. Spin Cy și colab. O abordare similară a fost utilizată pentru a caracteriza gradientul de modul al periilor polimerice de poli(lauril metacrilat) (P12MA) folosind nanoindentația cu sondă coloidală AFM, iar acestea sunt în concordanță cu datele care utilizează modelul de contact Hertz. Această abordare oferă un grafic al modulului de contact aparent (kPa) în funcție de adâncimea de indentare (nm), așa cum se arată în Figura 8, care ilustrează gradientul aparent al modulului de contact/adâncimii. Modulul de elasticitate calculat al probei CL lehfilcon A se situează în intervalul 2-3 kPa în primii 100 nm ai probei, dincolo de care începe să crească odată cu adâncimea. Pe de altă parte, la testarea substratului de bază SiHy fără o peliculă de tip perie la suprafață, adâncimea maximă de indentare obținută la o forță de 300 pN este mai mică de 50 nm, iar valoarea modulului obținută din date este de aproximativ 400 kPa, ceea ce este comparabil cu valorile modulului lui Young pentru materialele vrac.
Modulul aparent de contact (kPa) în funcție de adâncimea de indentare (nm) pentru substraturi lehfilcon A CL și SiHy utilizând metoda de nanoindentare AFM cu geometrie con-sferă pentru măsurarea modulului.
Suprafața superioară a noii structuri de perie polimerică ramificată biomimetică prezintă un modul de elasticitate extrem de scăzut (2-3 kPa). Acesta se va potrivi cu capătul suspendat liber al periei polimerice bifurcate, așa cum se arată în imaginea STEM. Deși există unele dovezi ale unui gradient de modul la marginea exterioară a CL, substratul principal cu modul ridicat este mai influent. Cu toate acestea, primii 100 nm ai suprafeței se află în limita a 20% din lungimea totală a periei polimerice ramificate, așa că este rezonabil să presupunem că valorile măsurate ale modulului în acest interval de adâncime a indentării sunt relativ precise și nu depind puternic de efectul obiectului de jos.
Datorită designului biomimetic unic al lentilelor de contact lehfilcon A, constând din structuri de perie polimerice PMPC ramificate grefate pe suprafața substraturilor SiHy, este foarte dificil să se caracterizeze în mod fiabil proprietățile mecanice ale structurilor lor de suprafață folosind metode tradiționale de măsurare. Aici prezentăm o metodă avansată de nanoindentare AFM pentru caracterizarea precisă a materialelor ultra-moi, cum ar fi lefilcon A, cu conținut ridicat de apă și elasticitate extrem de ridicată. Această metodă se bazează pe utilizarea unei sonde AFM a cărei dimensiune a vârfului și geometrie sunt atent alese pentru a se potrivi dimensiunilor structurale ale caracteristicilor suprafeței ultra-moi care urmează să fie imprimate. Această combinație de dimensiuni între sondă și structură oferă o sensibilitate crescută, permițându-ne să măsurăm modulul scăzut și proprietățile elastice inerente ale elementelor de perie polimerice ramificate, indiferent de efectele poroelastice. Rezultatele au arătat că periile polimerice PMPC ramificate unice, caracteristice suprafeței lentilei, au avut un modul de elasticitate extrem de scăzut (până la 2 kPa) și o elasticitate foarte ridicată (aproape 100%) atunci când au fost testate într-un mediu apos. Rezultatele nanoindentării AFM ne-au permis, de asemenea, să caracterizăm gradientul aparent de modul de contact/adâncime (30 kPa/200 nm) al suprafeței lentilei biomimetice. Acest gradient se poate datora diferenței de modul dintre periile polimerice ramificate și substratul de SiHy sau structurii/densității ramificate a periilor polimerice sau unei combinații a acestora. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare aprofundate pentru a înțelege pe deplin relația dintre structură și proprietăți, în special efectul ramificării periilor asupra proprietăților mecanice. Măsurători similare pot ajuta la caracterizarea proprietăților mecanice ale suprafeței altor materiale ultra-moi și dispozitive medicale.
Seturile de date generate și/sau analizate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorii respectivi, la cerere rezonabilă.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. și Haugen, HJ Reacții biologice la proprietățile fizice și chimice ale suprafețelor biomaterialelor. Societatea Chimică. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM și Liu, X. Îmbunătățirea biomaterialelor derivate din om pentru ingineria tisulară. Programare. Polimer. Știința. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. și colab. Proiectarea, implementarea clinică și răspunsul imun al biomaterialelor în medicina regenerativă. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK și Farr GM O metodă îmbunătățită pentru determinarea durității și a modulului de elasticitate folosind experimente de indentare cu măsurători de sarcină și deplasare. J. Alma mater. Storage Tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM. Originile istorice ale testării durității prin indentare. Alma Mater. Știința. Tehnologiile. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Măsurători ale durității la indentare la scară macro, micro și nanometrică: o analiză critică. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD și Clapperich, SM Erorile de detectare a suprafeței duc la supraestimarea modulului în nanoindentarea materialelor moi. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR și Yahya M.Yu. Evaluarea metodei de nanoindentare pentru determinarea caracteristicilor mecanice ale nanocompozitelor eterogene utilizând metode experimentale și computaționale. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR și Owart, TS Caracterizarea mecanică a gelurilor vâscoelastice moi prin indentare și analiză inversă cu elemente finite bazată pe optimizare. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J și Chaneler D. Optimizarea determinării viscoelasticității folosind sisteme de măsurare compatibile. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. și Pellillo, E. Nanoindentarea suprafețelor polimerice. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. și Van Vliet KJ Caracterizarea proprietăților mecanice vâscoelastice ale polimerilor și țesuturilor biologice cu elasticitate ridicată utilizând indentarea prin șoc. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluarea modulului de elasticitate și a lucrului mecanic de aderență al materialelor moi utilizând metoda Borodich-Galanov (BG) extinsă și indentare profundă. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. și colab. Morfologie la nanoscală și proprietăți mecanice ale suprafețelor polimerice biomimetice ale lentilelor de contact din silicon hidrogel. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).