Obrigado por visitar o Nature.com. Você está usando uma versão de navegador com suporte limitado a CSS. Para uma melhor experiência, recomendamos que você use um navegador atualizado (ou desative o Modo de Compatibilidade no Internet Explorer). Além disso, para garantir suporte contínuo, exibimos o site sem estilos e JavaScript.
Exibe um carrossel com três slides por vez. Use os botões Anterior e Próximo para navegar entre os três slides ou use os botões deslizantes no final para navegar entre eles.
Com o desenvolvimento de novos materiais ultramacios para dispositivos médicos e aplicações biomédicas, a caracterização abrangente de suas propriedades físicas e mecânicas é importante e desafiadora. Uma técnica modificada de nanoindentação por microscopia de força atômica (AFM) foi aplicada para caracterizar o módulo de elasticidade superficial extremamente baixo da nova lente de contato de hidrogel de silicone biomimético lehfilcon A, revestida com uma camada de estruturas de escova de polímero ramificado. Este método permite a determinação precisa dos pontos de contato sem os efeitos da extrusão viscosa ao se aproximar de polímeros ramificados. Além disso, possibilita a determinação das características mecânicas de elementos individuais da escova sem o efeito da poroelasticidade. Isso é alcançado pela seleção de uma ponta de AFM com um design (tamanho da ponta, geometria e constante elástica) particularmente adequado para medir as propriedades de materiais macios e amostras biológicas. Este método melhora a sensibilidade e a precisão para a medição acurada do material ultramacio lehfilcon A, que possui um módulo de elasticidade superficial extremamente baixo (até 2 kPa) e uma elasticidade extremamente alta no ambiente aquoso interno (quase 100%). Os resultados do estudo de superfície não apenas revelaram as propriedades ultramacias da lente de lehfilcon A, mas também mostraram que o módulo das escovas de polímero ramificadas era comparável ao do substrato de silício-hidrogênio. Essa técnica de caracterização de superfície pode ser aplicada a outros materiais ultramacios e dispositivos médicos.
As propriedades mecânicas de materiais projetados para contato direto com tecido vivo são frequentemente determinadas pelo ambiente biológico. A perfeita correspondência entre essas propriedades do material ajuda a alcançar as características clínicas desejadas sem causar respostas celulares adversas^1,2,3. Para materiais homogêneos em massa, a caracterização das propriedades mecânicas é relativamente fácil devido à disponibilidade de procedimentos e métodos de teste padrão (por exemplo, microindentação^4,5,6). No entanto, para materiais ultramacios, como géis, hidrogéis, biopolímeros, células vivas, etc., esses métodos de teste geralmente não são aplicáveis ​​devido às limitações de resolução de medição e à heterogeneidade de alguns materiais⁷. Ao longo dos anos, os métodos tradicionais de indentação foram modificados e adaptados para caracterizar uma ampla gama de materiais macios, mas muitos métodos ainda apresentam sérias deficiências que limitam seu uso^{8,9,10,11,12,13}. A falta de métodos de teste especializados que possam caracterizar com precisão e confiabilidade as propriedades mecânicas de materiais supermacios e camadas superficiais limita severamente seu uso em diversas aplicações.
Em nosso trabalho anterior, apresentamos a lente de contato lehfilcon A (LC), um material heterogêneo macio com todas as propriedades de superfície ultramacias derivadas de designs potencialmente biomiméticos inspirados na superfície da córnea do olho. Este biomaterial foi desenvolvido por meio do enxerto de uma camada de polímero ramificado e reticulado de poli(2-metacriloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) em um hidrogel de silicone (SiHy) 15 projetado para dispositivos médicos. Esse processo de enxerto cria uma camada na superfície composta por uma estrutura de escova polimérica ramificada muito macia e altamente elástica. Nosso trabalho anterior confirmou que a estrutura biomimética da LC lehfilcon A proporciona propriedades de superfície superiores, como melhor molhabilidade e prevenção de incrustações, maior lubrificação e menor adesão celular e bacteriana15,16. Além disso, o uso e o desenvolvimento deste material biomimético também sugerem uma maior expansão para outros dispositivos biomédicos. Portanto, é crucial caracterizar as propriedades da superfície desse material ultramacio e compreender sua interação mecânica com o olho para criar uma base de conhecimento abrangente que apoie desenvolvimentos e aplicações futuras. A maioria das lentes de contato de silicone hidrogel (SiHy) disponíveis comercialmente é composta por uma mistura homogênea de polímeros hidrofílicos e hidrofóbicos que formam uma estrutura uniforme do material¹⁷. Diversos estudos foram conduzidos para investigar suas propriedades mecânicas utilizando métodos tradicionais de teste de compressão, tração e microindentação^18,19,20,21. No entanto, o design biomimético inovador da lente de contato de lehfilcon A a torna um material heterogêneo único, no qual as propriedades mecânicas das estruturas de polímero ramificado diferem significativamente daquelas do substrato base de SiHy. Portanto, é muito difícil quantificar com precisão essas propriedades utilizando métodos convencionais e de indentação. Um método promissor utiliza o teste de nanoindentação implementado na microscopia de força atômica (AFM), um método que tem sido usado para determinar as propriedades mecânicas de materiais viscoelásticos macios, como células e tecidos biológicos, bem como polímeros macios^22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. Na nanoindentação por AFM, os fundamentos dos testes de nanoindentação são combinados com os mais recentes avanços na tecnologia AFM para proporcionar maior sensibilidade de medição e testes de uma ampla gama de materiais inerentemente supermacios31,32,33,34,35,36. Além disso, a tecnologia oferece outras vantagens importantes por meio do uso de diferentes geometrias de indentador e ponta e a possibilidade de testes em diversos meios líquidos.
A nanoindentação por AFM pode ser dividida, de forma geral, em três componentes principais: (1) equipamentos (sensores, detectores, pontas, etc.); (2) parâmetros de medição (como força, deslocamento, velocidade, amplitude da rampa, etc.); (3) processamento de dados (correção da linha de base, estimativa do ponto de contato, ajuste de dados, modelagem, etc.). Um problema significativo com esse método é que diversos estudos na literatura, utilizando nanoindentação por AFM, relatam resultados quantitativos muito diferentes para o mesmo tipo de amostra/célula/material37,38,39,40,41. Por exemplo, Lekka et al. estudaram e compararam a influência da geometria da ponta de AFM no módulo de Young medido em amostras de hidrogel mecanicamente homogêneo e células heterogêneas. Eles relataram que os valores do módulo são altamente dependentes da seleção do cantilever e do formato da ponta, com o maior valor para uma ponta em formato de pirâmide e o menor valor, de 42, para uma ponta esférica. Da mesma forma, Selhuber-Unkel et al. Foi demonstrado como a velocidade do indentador, o tamanho do indentador e a espessura das amostras de poliacrilamida (PAAM) afetam o módulo de Young medido por nanoindentação ACM43. Outro fator complicador é a falta de materiais de teste padronizados com módulo extremamente baixo e de procedimentos de teste livres. Isso torna muito difícil obter resultados precisos com confiança. No entanto, o método é muito útil para medições relativas e avaliações comparativas entre tipos de amostras semelhantes, por exemplo, usando nanoindentação AFM para distinguir células normais de células cancerígenas 44, 45 .
Ao testar materiais macios com nanoindentação por AFM, uma regra geral é usar uma ponta com uma constante de mola (k) baixa, que corresponda de perto ao módulo da amostra, e uma ponta hemisférica/redondada, de modo que a primeira ponta não perfure a superfície da amostra no primeiro contato com materiais macios. Também é importante que o sinal de deflexão gerado pela ponta seja forte o suficiente para ser detectado pelo sistema detector a laser24,34,46,47. No caso de células, tecidos e géis heterogêneos ultramacios, outro desafio é superar a força de adesão entre a ponta e a superfície da amostra para garantir medições reprodutíveis e confiáveis48,49,50. Até recentemente, a maioria dos trabalhos em nanoindentação por AFM se concentrava no estudo do comportamento mecânico de células biológicas, tecidos, géis, hidrogéis e biomoléculas usando pontas esféricas relativamente grandes, comumente chamadas de pontas coloidais (CPs). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Essas pontas têm um raio de 1 a 50 µm e são comumente feitas de vidro borossilicato, polimetilmetacrilato (PMMA), poliestireno (PS), dióxido de silício (SiO2) e carbono tipo diamante (DLC). Embora a nanoindentação CP-AFM seja frequentemente a primeira escolha para a caracterização de amostras macias, ela apresenta seus próprios problemas e limitações. O uso de pontas esféricas grandes, de tamanho micrométrico, aumenta a área de contato total da ponta com a amostra e resulta em uma perda significativa de resolução espacial. Para espécimes macios e não homogêneos, onde as propriedades mecânicas de elementos locais podem diferir significativamente da média em uma área mais ampla, a indentação CP pode ocultar qualquer não homogeneidade nas propriedades em escala local52. As sondas coloidais são tipicamente feitas fixando esferas coloidais de tamanho micrométrico a cantilevers sem ponta usando adesivos epóxi. O próprio processo de fabricação é repleto de problemas e pode levar a inconsistências no processo de calibração da sonda. Além disso, o tamanho e a massa das partículas coloidais afetam diretamente os principais parâmetros de calibração do cantilever, como frequência de ressonância, rigidez da mola e sensibilidade à deflexão56,57,58. Assim, métodos comumente usados ​​para sondas AFM convencionais, como a calibração por temperatura, podem não fornecer uma calibração precisa para CP, sendo necessários outros métodos para realizar essas correções57, 59, 60, 61. Experimentos típicos de indentação com sonda coloidal utilizam cantilever com grandes desvios para estudar as propriedades de amostras macias, o que cria outro problema ao calibrar o comportamento não linear do cantilever em desvios relativamente grandes62,63,64. Os métodos modernos de indentação com sonda coloidal geralmente levam em consideração a geometria do cantilever usado para calibrar a sonda, mas ignoram a influência das partículas coloidais, o que cria incerteza adicional na precisão do método38,61. De forma semelhante, os módulos elásticos calculados pelo ajuste do modelo de contato dependem diretamente da geometria da ponta de indentação, e a incompatibilidade entre as características da ponta e da superfície da amostra pode levar a imprecisões27, 65, 66, 67, 68. Alguns trabalhos recentes de Spencer et al. destacam os fatores que devem ser levados em consideração ao caracterizar escovas de polímero macias usando o método de nanoindentação CP-AFM. Eles relataram que a retenção de um fluido viscoso em escovas de polímero em função da velocidade resulta em um aumento na carga da cabeça e, portanto, em diferentes medições de propriedades dependentes da velocidade30, 69, 70, 71.
Neste estudo, caracterizamos o módulo de superfície do material ultramacio e altamente elástico lehfilcon A CL utilizando um método de nanoindentação AFM modificado. Dadas as propriedades e a nova estrutura deste material, a faixa de sensibilidade do método de indentação tradicional é claramente insuficiente para caracterizar o módulo deste material extremamente macio, sendo necessário, portanto, utilizar um método de nanoindentação AFM com maior sensibilidade e menor nível de sensibilidade. Após analisar as limitações e os problemas das técnicas existentes de nanoindentação com sonda AFM coloidal, demonstramos por que optamos por uma sonda AFM menor e projetada sob medida para eliminar a sensibilidade, o ruído de fundo, a necessidade de precisão no ponto de contato, a medição do módulo de velocidade de materiais macios e heterogêneos, como a dependência da retenção de fluidos, e a quantificação precisa. Além disso, conseguimos medir com precisão a forma e as dimensões da ponta de indentação, permitindo-nos utilizar o modelo de ajuste cone-esfera para determinar o módulo de elasticidade sem avaliar a área de contato da ponta com o material. As duas premissas implícitas quantificadas neste trabalho são as propriedades totalmente elásticas do material e o módulo independente da profundidade de indentação. Utilizando este método, testamos inicialmente padrões ultramacios com módulo conhecido para quantificar o método e, em seguida, o utilizamos para caracterizar as superfícies de dois materiais diferentes para lentes de contato. Espera-se que este método de caracterização de superfícies por nanoindentação AFM com maior sensibilidade seja aplicável a uma ampla gama de materiais ultramacios heterogêneos biomiméticos com potencial uso em dispositivos médicos e aplicações biomédicas.
Lentes de contato Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EUA) e seus substratos de hidrogel de silicone foram escolhidos para experimentos de nanoindentação. Um suporte de lente especialmente projetado foi utilizado no experimento. Para instalar a lente para teste, ela foi cuidadosamente colocada no suporte em formato de cúpula, certificando-se de que nenhuma bolha de ar entrasse, e então fixada pelas bordas. Um orifício na parte superior do suporte da lente permite o acesso ao centro óptico da lente para os experimentos de nanoindentação, mantendo o líquido no lugar. Isso mantém as lentes totalmente hidratadas. 500 μl de solução para lentes de contato foram utilizados como solução de teste. Para verificar os resultados quantitativos, hidrogéis de poliacrilamida (PAAM) não ativados, disponíveis comercialmente, foram preparados a partir de uma composição de poliacrilamida-co-metileno-bisacrilamida (placas de Petri Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EUA), com um módulo de elasticidade conhecido de 1 kPa. Utilize 4 a 5 gotas (aproximadamente 125 µl) de solução salina tamponada com fosfato (PBS da Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EUA) e 1 gota de solução para lentes de contato OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EUA) na interface hidrogel-ponta do AFM.
Amostras de Lehfilcon A CL e substratos de SiHy foram visualizadas utilizando um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (MEV-FEG) FEI Quanta 250 equipado com um detector de microscopia eletrônica de transmissão por varredura (METV). Para preparar as amostras, as lentes foram lavadas com água e cortadas em cunhas em formato de fatia de pizza. Para obter um contraste diferencial entre os componentes hidrofílicos e hidrofóbicos das amostras, utilizou-se uma solução estabilizada de RuO4 a 0,10% como corante, na qual as amostras foram imersas por 30 minutos. A coloração do Lehfilcon A CL com RuO4 é importante não apenas para obter um melhor contraste diferencial, mas também para preservar a estrutura das escovas poliméricas ramificadas em sua forma original, que ficam visíveis nas imagens de METV. Em seguida, as amostras foram lavadas e desidratadas em uma série de misturas de etanol/água com concentrações crescentes de etanol. Posteriormente, as amostras foram revestidas com resina epóxi EMBed 812/Araldite, que foi curada durante a noite a 70 °C. Blocos de amostra obtidos por polimerização de resina foram cortados com um ultramicrótomo, e as seções finas resultantes foram visualizadas com um detector STEM em modo de baixo vácuo com uma tensão de aceleração de 30 kV. O mesmo sistema SEM foi utilizado para a caracterização detalhada da ponta AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA). Imagens SEM da ponta AFM foram obtidas em um modo típico de alto vácuo com uma tensão de aceleração de 30 kV. Imagens foram adquiridas em diferentes ângulos e ampliações para registrar todos os detalhes da forma e tamanho da ponta da ponta AFM. Todas as dimensões da ponta de interesse nas imagens foram medidas digitalmente.
Um microscópio de força atômica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA) com o modo “PeakForce QNM em Fluido” foi utilizado para visualizar e nanoindentar amostras de lehfilcon A CL, substrato de SiHy e hidrogel de PAAm. Para os experimentos de imagem, uma sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) com raio de ponta nominal de 1 nm foi utilizada para capturar imagens de alta resolução da amostra a uma taxa de varredura de 0,50 Hz. Todas as imagens foram obtidas em solução aquosa.
Experimentos de nanoindentação por AFM foram realizados utilizando uma sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). A sonda AFM possui uma ponta de silício em um cantilever de nitreto com 345 nm de espessura, 54 µm de comprimento e 4,5 µm de largura, com uma frequência de ressonância de 45 kHz. Ela foi projetada especificamente para caracterizar e realizar medições nanomecânicas quantitativas em amostras biológicas macias. Os sensores são calibrados individualmente na fábrica com configurações de mola pré-calibradas. As constantes de mola das sondas utilizadas neste estudo estavam na faixa de 0,05–0,1 N/m. Para determinar com precisão a forma e o tamanho da ponta, a sonda foi caracterizada detalhadamente por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). A Figura 1a mostra uma micrografia eletrônica de varredura de alta resolução e baixa magnificação da sonda PFQNM-LC-A-CAL, fornecendo uma visão geral do projeto da sonda. A Figura 1b mostra uma vista ampliada da parte superior da ponta da sonda, fornecendo informações sobre a forma e o tamanho da ponta. Na extremidade, a agulha apresenta-se como um hemisfério com cerca de 140 nm de diâmetro (Fig. 1c). Abaixo dessa região, a ponta afunila-se em um formato cônico, atingindo um comprimento medido de aproximadamente 500 nm. Fora da região de afunilamento, a ponta é cilíndrica e termina com um comprimento total de 1,18 µm. Essa é a principal parte funcional da ponta da sonda. Além disso, uma grande sonda esférica de poliestireno (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EUA) com diâmetro da ponta de 45 µm e constante de mola de 2 N/m também foi utilizada para testes como sonda coloidal, com a sonda PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm para comparação.
Foi relatado que o líquido pode ficar retido entre a ponta do AFM e a estrutura da escova de polímero durante a nanoindentação, exercendo uma força ascendente sobre a ponta do AFM antes mesmo de ela tocar a superfície⁶⁹. Esse efeito de extrusão viscosa devido à retenção de fluido pode alterar o ponto de contato aparente, afetando, assim, as medições do módulo de superfície. Para estudar o efeito da geometria da ponta e da velocidade de indentação na retenção de fluido, curvas de força de indentação foram plotadas para amostras de lentes de contato de lehfilcon A usando uma ponta de 140 nm de diâmetro a taxas de deslocamento constantes de 1 µm/s e 2 µm/s. Experimentos com uma ponta de 140 nm de diâmetro foram realizados a uma velocidade de indentação de 1 µm/s e uma força definida de 300 pN, escolhida para criar uma pressão de contato dentro da faixa fisiológica (1–8 kPa) da pálpebra superior. Pressão 72. Amostras macias e prontas de hidrogel PAA com uma pressão de 1 kPa foram testadas para uma força de indentação de 50 pN a uma velocidade de 1 μm/s usando uma sonda com um diâmetro de 140 nm.
Como o comprimento da parte cônica da ponta da sonda PFQNM-LC-A-CAL é de aproximadamente 500 nm, para qualquer profundidade de indentação < 500 nm, pode-se assumir com segurança que a geometria da sonda durante a indentação permanecerá fiel ao seu formato cônico. Além disso, assume-se que a superfície do material em teste apresentará uma resposta elástica reversível, o que também será confirmado nas seções seguintes. Portanto, dependendo da forma e do tamanho da ponta, escolhemos o modelo de ajuste cone-esfera desenvolvido por Briscoe, Sebastian e Adams, disponível no software do fornecedor, para processar nossos experimentos de nanoindentação por AFM (NanoScope). Software de análise de dados de separação, Bruker) 73. O modelo descreve a relação força-deslocamento F(δ) para um cone com um defeito esférico no ápice. Na fig. A Figura 2 mostra a geometria de contato durante a interação de um cone rígido com uma ponta esférica, onde R é o raio da ponta esférica, a é o raio de contato, b é o raio de contato na extremidade da ponta esférica, δ é a profundidade de indentação e θ é o semiângulo do cone. A imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) desta sonda mostra claramente que a ponta esférica de 140 nm de diâmetro se funde tangencialmente a um cone, portanto, aqui b é definido apenas em função de R, ou seja, b = R cos θ. O software fornecido pelo fabricante oferece uma relação cone-esfera para calcular os valores do módulo de Young (E) a partir dos dados de separação de forças, assumindo a > b. Relação:
onde F é a força de indentação, E é o módulo de Young e ν é a razão de Poisson. O raio de contato a pode ser estimado usando:
Esquema da geometria de contato de um cone rígido com ponta esférica pressionado contra o material de uma lente de contato Lefilcon com uma camada superficial de escovas de polímero ramificadas.
Se a ≤ b, a relação se reduz à equação para um indentador esférico convencional;
Acreditamos que a interação da ponta de indentação com a estrutura ramificada da escova de polímero PMPC fará com que o raio de contato a seja maior que o raio de contato esférico b. Portanto, para todas as medições quantitativas do módulo de elasticidade realizadas neste estudo, utilizamos a dependência obtida para o caso a > b.
Os materiais biomiméticos ultramacios estudados neste trabalho foram amplamente imagiados utilizando microscopia eletrônica de transmissão por varredura (STEM) da seção transversal da amostra e microscopia de força atômica (AFM) da superfície. Essa caracterização detalhada da superfície foi realizada como uma extensão de nosso trabalho publicado anteriormente, no qual determinamos que a estrutura de escova polimérica ramificada dinamicamente da superfície da lente de contato lehfilcon A modificada com PMPC exibia propriedades mecânicas semelhantes ao tecido corneano nativo¹⁴. Por esse motivo, nos referimos às superfícies das lentes de contato como materiais biomiméticos¹⁴. As figuras 3a e 3b mostram seções transversais de estruturas de escova polimérica PMPC ramificadas na superfície de um substrato de lente de contato lehfilcon A e de um substrato de SiHy não tratado, respectivamente. As superfícies de ambas as amostras foram posteriormente analisadas utilizando imagens de AFM de alta resolução, que confirmaram os resultados da análise STEM (Fig. 3c e 3d). Em conjunto, essas imagens fornecem um comprimento aproximado da estrutura de escova polimérica ramificada do PMPC de 300–400 nm, o que é crucial para a interpretação das medições de nanoindentação por AFM. Outra observação importante derivada das imagens é que a estrutura superficial geral do material biomimético CL é morfologicamente diferente da do substrato de SiHy. Essa diferença na morfologia da superfície pode se tornar aparente durante a interação mecânica com a ponta de indentação do AFM e, consequentemente, nos valores de módulo medidos.
Imagens STEM de seção transversal de (a) lehfilcon A CL e (b) substrato de SiHy. Barra de escala, 500 nm. Imagens AFM da superfície do substrato de lehfilcon A CL (c) e do substrato base de SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polímeros bioinspirados e estruturas de escova polimérica são inerentemente macios e têm sido amplamente estudados e utilizados em diversas aplicações biomédicas74,75,76,77. Portanto, é importante utilizar o método de nanoindentação por AFM, que permite medir suas propriedades mecânicas com precisão e confiabilidade. Entretanto, as propriedades únicas desses materiais ultramacios, como o módulo de elasticidade extremamente baixo, o alto teor de líquido e a alta elasticidade, muitas vezes dificultam a escolha do material, formato e tamanho adequados da ponta de indentação. Isso é importante para que o indentador não perfure a superfície macia da amostra, o que levaria a erros na determinação do ponto de contato com a superfície e da área de contato.
Para isso, é essencial uma compreensão abrangente da morfologia de materiais biomiméticos ultramacios (lehfilcon A CL). Informações sobre o tamanho e a estrutura das escovas poliméricas ramificadas, obtidas por meio do método de imagem, fornecem a base para a caracterização mecânica da superfície utilizando técnicas de nanoindentação por AFM. Em vez de sondas coloidais esféricas de tamanho micrométrico, optamos pela sonda de nitreto de silício PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) com diâmetro de ponta de 140 nm, especialmente projetada para o mapeamento quantitativo das propriedades mecânicas de amostras biológicas 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. A justificativa para o uso de sondas relativamente pontiagudas em comparação com as sondas coloidais convencionais pode ser explicada pelas características estruturais do material. Comparando o tamanho da ponta da sonda (~140 nm) com as escovas de polímero ramificadas na superfície do CL lehfilcon A, mostradas na Fig. 3a, pode-se concluir que a ponta é grande o suficiente para entrar em contato direto com essas estruturas de escova, o que reduz a probabilidade de a ponta perfurá-las. Para ilustrar esse ponto, a Fig. 4 apresenta uma imagem STEM do CL lehfilcon A e da ponta de indentação da sonda AFM (desenhada em escala).
Esquema mostrando imagem STEM de lehfilcon A CL e uma sonda de indentação ACM (desenhada em escala).
Além disso, o tamanho da ponta de 140 nm é suficientemente pequeno para evitar o risco de quaisquer efeitos de extrusão pegajosa relatados anteriormente para escovas de polímero produzidas pelo método de nanoindentação CP-AFM69,71. Supomos que, devido ao formato cônico-esférico especial e ao tamanho relativamente pequeno desta ponta de AFM (Fig. 1), a natureza da curva de força gerada pela nanoindentação de lehfilcon A CL não dependerá da velocidade de indentação ou da velocidade de carga/descarga. Portanto, não é afetada por efeitos poroelásticos. Para testar essa hipótese, amostras de lehfilcon A CL foram indentadas com uma força máxima fixa usando uma sonda PFQNM-LC-A-CAL, mas em duas velocidades diferentes, e as curvas de força de tração e retração resultantes foram usadas para plotar a força (nN) em função da separação (µm), conforme mostrado na Figura 5a. É evidente que as curvas de força durante o carregamento e descarregamento se sobrepõem completamente, e não há evidências claras de que a força de cisalhamento na profundidade de indentação zero aumente com a velocidade de indentação na figura, sugerindo que os elementos individuais da escova foram caracterizados sem efeito poroelástico. Em contraste, os efeitos de retenção de fluido (extrusão viscosa e efeitos de poroelasticidade) são evidentes para a ponta AFM de 45 µm de diâmetro na mesma velocidade de indentação e são destacados pela histerese entre as curvas de alongamento e retração, como mostrado na Figura 5b. Esses resultados corroboram a hipótese e sugerem que pontas de 140 nm de diâmetro são uma boa escolha para caracterizar tais superfícies macias.
Curvas de força de indentação de lehfilcon A CL usando ACM; (a) usando uma sonda com diâmetro de 140 nm em duas taxas de carregamento, demonstrando a ausência de um efeito poroelástico durante a indentação da superfície; (b) usando sondas com diâmetro de 45 µm e 140 nm. As figuras mostram os efeitos da extrusão viscosa e da poroelasticidade para sondas maiores em comparação com sondas menores.
Para caracterizar superfícies ultramacias, os métodos de nanoindentação por AFM exigem a melhor ponta possível para estudar as propriedades do material em questão. Além do formato e tamanho da ponta, a sensibilidade do sistema detector do AFM, a sensibilidade à deflexão da ponta no ambiente de teste e a rigidez da alavanca desempenham um papel importante na determinação da precisão e confiabilidade das medições de nanoindentação. Para o nosso sistema AFM, o limite de detecção do Detector Sensível à Posição (PSD) é de aproximadamente 0,5 mV e baseia-se na taxa de mola pré-calibrada e na sensibilidade à deflexão do fluido calculada para a ponta PFQNM-LC-A-CAL, que corresponde a uma sensibilidade de carga teórica inferior a 0,1 pN. Portanto, este método permite a medição de uma força de indentação mínima ≤ 0,1 pN sem qualquer componente de ruído periférico. No entanto, é praticamente impossível para um sistema AFM reduzir o ruído periférico a esse nível devido a fatores como vibração mecânica e dinâmica de fluidos. Esses fatores limitam a sensibilidade geral do método de nanoindentação AFM e também resultam em um sinal de ruído de fundo de aproximadamente ≤ 10 pN. Para a caracterização da superfície, amostras de lehfilcon A CL e substrato de SiHy foram indentadas em condições totalmente hidratadas usando uma sonda de 140 nm para caracterização por MEV, e as curvas de força resultantes foram sobrepostas entre força (pN) e pressão. O gráfico de separação (µm) é mostrado na Figura 6a. Comparada ao substrato base de SiHy, a curva de força do lehfilcon A CL mostra claramente uma fase de transição que começa no ponto de contato com a escova de polímero bifurcada e termina com uma mudança abrupta na inclinação, marcando o contato da ponta com o material subjacente. Essa parte de transição da curva de força destaca o comportamento verdadeiramente elástico da escova de polímero ramificada na superfície, como evidenciado pela curva de compressão que segue de perto a curva de tensão e pelo contraste nas propriedades mecânicas entre a estrutura da escova e o material SiHy volumoso. Ao comparar o lefilcon. A separação do comprimento médio de uma escova de polímero ramificada na imagem STEM do PCS (Fig. 3a) e sua curva de força ao longo da abscissa na Fig. 3a.6a mostra que o método é capaz de detectar a ponta e o polímero ramificado atingindo o topo da superfície. Contato entre as estruturas da escova. Além disso, a sobreposição próxima das curvas de força indica a ausência de efeito de retenção de líquido. Nesse caso, não há absolutamente nenhuma adesão entre a agulha e a superfície da amostra. As seções superiores das curvas de força para as duas amostras se sobrepõem, refletindo a similaridade das propriedades mecânicas dos materiais do substrato.
(a) Curvas de força de nanoindentação AFM para substratos de lehfilcon A CL e substratos de SiHy, (b) curvas de força mostrando a estimativa do ponto de contato usando o método de limiar de ruído de fundo.
Para estudar os detalhes da curva de força, a curva de tensão da amostra de lehfilcon A CL foi replotada na Figura 6b com uma força máxima de 50 pN ao longo do eixo y. Este gráfico fornece informações importantes sobre o ruído de fundo original. O ruído está na faixa de ±10 pN, que é usada para determinar com precisão o ponto de contato e calcular a profundidade de indentação. Como relatado na literatura, a identificação dos pontos de contato é crucial para avaliar com precisão propriedades do material, como o módulo de elasticidade. Uma abordagem que envolve o processamento automático de dados da curva de força demonstrou uma melhor concordância entre o ajuste dos dados e as medições quantitativas para materiais macios. Neste trabalho, nossa escolha de pontos de contato é relativamente simples e objetiva, mas tem suas limitações. Nossa abordagem conservadora para determinar o ponto de contato pode resultar em valores de módulo ligeiramente superestimados para profundidades de indentação menores (< 100 nm). O uso de detecção de pontos de contato baseada em algoritmos e processamento automático de dados poderia ser uma continuação deste trabalho no futuro para aprimorar ainda mais nosso método. Assim, para um ruído de fundo intrínseco da ordem de ±10 pN, definimos o ponto de contato como o primeiro ponto de dados no eixo x da Figura 6b com um valor ≥10 pN. Em seguida, de acordo com o limiar de ruído de 10 pN, uma linha vertical em torno de 0,27 µm marca o ponto de contato com a superfície, após o qual a curva de estiramento continua até que o substrato atinja a profundidade de indentação de aproximadamente 270 nm. Curiosamente, com base no tamanho das características da escova de polímero ramificada (300–400 nm) medidas usando o método de imagem, a profundidade de indentação da amostra de CL lehfilcon A observada usando o método do limiar de ruído de fundo é de cerca de 270 nm, o que é muito próximo do tamanho medido com STEM. Esses resultados confirmam ainda mais a compatibilidade e a aplicabilidade da forma e do tamanho da ponta da sonda AFM para a indentação dessa estrutura de escova de polímero ramificada muito macia e altamente elástica. Esses dados também fornecem fortes evidências que corroboram nosso método de usar o ruído de fundo como um limiar para identificar pontos de contato. Portanto, quaisquer resultados quantitativos obtidos por meio de modelagem matemática e ajuste da curva de força devem ser relativamente precisos.
As medições quantitativas por métodos de nanoindentação AFM dependem completamente dos modelos matemáticos utilizados para a seleção e análise subsequente dos dados. Portanto, é importante considerar todos os fatores relacionados à escolha do indentador, às propriedades do material e à mecânica de sua interação antes de escolher um modelo específico. Neste caso, a geometria da ponta foi cuidadosamente caracterizada utilizando micrografias SEM (Fig. 1) e, com base nos resultados, a sonda de nanoindentação AFM de 140 nm de diâmetro com ponta cônica rígida e geometria esférica é uma boa escolha para caracterizar amostras de lehfilcon A CL79. Outro fator importante que precisa ser cuidadosamente avaliado é a elasticidade do material polimérico testado. Embora os dados iniciais da nanoindentação (Figs. 5a e 6a) mostrem claramente as características da sobreposição das curvas de tensão e compressão, ou seja, a recuperação elástica completa do material, é extremamente importante confirmar a natureza puramente elástica dos contatos. Para isso, foram realizadas duas indentações sucessivas no mesmo local da superfície da amostra de lehfilcon A CL a uma taxa de indentação de 1 µm/s em condições de hidratação completa. Os dados da curva de força resultantes são mostrados na figura 7 e, como esperado, as curvas de expansão e compressão das duas impressões são quase idênticas, destacando a alta elasticidade da estrutura de escova polimérica ramificada.
Duas curvas de força de indentação no mesmo local da superfície da lente de contato de lehfilcon A indicam a elasticidade ideal da superfície da lente.
Com base nas informações obtidas a partir de imagens de MEV e MET da ponta da sonda e da superfície de lehfilcon A CL, respectivamente, o modelo cone-esfera representa matematicamente a interação entre a ponta da sonda AFM e o material polimérico macio em teste. Além disso, para esse modelo cone-esfera, as premissas fundamentais sobre as propriedades elásticas do material impresso são válidas para esse novo material biomimético e são utilizadas para quantificar o módulo de elasticidade.
Após uma avaliação abrangente do método de nanoindentação por AFM e seus componentes, incluindo as propriedades da ponta de indentação (forma, tamanho e rigidez da mola), sensibilidade (ruído de fundo e estimativa do ponto de contato) e modelos de ajuste de dados (medições quantitativas do módulo), o método foi utilizado para caracterizar amostras ultramacias disponíveis comercialmente e verificar os resultados quantitativos. Um hidrogel comercial de poliacrilamida (PAAM) com módulo de elasticidade de 1 kPa foi testado em condições hidratadas utilizando uma ponta de 140 nm. Detalhes sobre os testes e cálculos do módulo são fornecidos nas Informações Suplementares. Os resultados mostraram que o módulo médio medido foi de 0,92 kPa, e o %RSD e o desvio percentual (%) em relação ao módulo conhecido foram inferiores a 10%. Esses resultados confirmam a precisão e a reprodutibilidade do método de nanoindentação por AFM utilizado neste trabalho para medir os módulos de materiais ultramacios. As superfícies das amostras de lehfilcon A CL e do substrato base de SiHy foram caracterizadas utilizando o mesmo método de nanoindentação AFM para estudar o módulo de contato aparente da superfície ultramacia em função da profundidade de indentação. Curvas de separação da força de indentação foram geradas para três amostras de cada tipo (n = 3; uma indentação por amostra) com uma força de 300 pN, velocidade de 1 µm/s e hidratação completa. A curva de separação da força de indentação foi aproximada utilizando um modelo de cone-esfera. Para obter o módulo dependente da profundidade de indentação, uma porção de 40 nm de largura da curva de força foi definida a cada incremento de 20 nm a partir do ponto de contato, e os valores do módulo foram medidos em cada etapa da curva de força. Spin Cy et al. Uma abordagem semelhante foi utilizada para caracterizar o gradiente de módulo de escovas de polímero de poli(metacrilato de laurila) (P12MA) utilizando nanoindentação com sonda AFM coloidal, e os resultados são consistentes com os dados obtidos utilizando o modelo de contato de Hertz. Esta abordagem fornece um gráfico do módulo de contato aparente (kPa) versus a profundidade de indentação (nm), como mostrado na Figura 8, que ilustra o gradiente de módulo de contato aparente/profundidade. O módulo de elasticidade calculado da amostra de CL lehfilcon A está na faixa de 2–3 kPa nos primeiros 100 nm da amostra, além dos quais começa a aumentar com a profundidade. Por outro lado, ao testar o substrato base de SiHy sem um filme semelhante a uma escova na superfície, a profundidade máxima de indentação atingida com uma força de 300 pN é inferior a 50 nm, e o valor do módulo obtido a partir dos dados é de cerca de 400 kPa, o que é comparável aos valores do módulo de Young para materiais maciços.
Módulo de contato aparente (kPa) versus profundidade de indentação (nm) para substratos de lehfilcon A CL e SiHy usando o método de nanoindentação AFM com geometria cone-esfera para medir o módulo.
A superfície mais externa da nova estrutura biomimética de escova polimérica ramificada exibe um módulo de elasticidade extremamente baixo (2–3 kPa). Isso corresponde à extremidade livre da escova polimérica bifurcada, conforme mostrado na imagem STEM. Embora haja alguma evidência de um gradiente de módulo na borda externa da camada limite (CL), o substrato principal de alto módulo é mais influente. No entanto, os 100 nm superiores da superfície correspondem a menos de 20% do comprimento total da escova polimérica ramificada, portanto, é razoável assumir que os valores medidos do módulo nessa faixa de profundidade de indentação sejam relativamente precisos e não dependam fortemente do efeito do objeto subjacente.
Devido ao design biomimético único das lentes de contato de lefilcon A, que consistem em estruturas ramificadas de polímero PMPC enxertadas na superfície de substratos de SiHy, é muito difícil caracterizar com precisão as propriedades mecânicas de suas estruturas superficiais usando métodos de medição tradicionais. Aqui, apresentamos um método avançado de nanoindentação por AFM para caracterizar com precisão materiais ultramacios, como o lefilcon A, com alto teor de água e elasticidade extremamente alta. Este método baseia-se no uso de uma sonda de AFM cuja ponta e geometria são cuidadosamente escolhidas para corresponder às dimensões estruturais das características da superfície ultramacia a serem impressas. Essa combinação de dimensões entre a sonda e a estrutura proporciona maior sensibilidade, permitindo-nos medir o baixo módulo e as propriedades elásticas inerentes dos elementos de polímero ramificado, independentemente dos efeitos poroelásticos. Os resultados mostraram que as estruturas ramificadas de polímero PMPC, características da superfície da lente, apresentaram um módulo de elasticidade extremamente baixo (até 2 kPa) e elasticidade muito alta (próxima a 100%) quando testadas em meio aquoso. Os resultados da nanoindentação por AFM também nos permitiram caracterizar o gradiente aparente de módulo de contato/profundidade (30 kPa/200 nm) da superfície da lente biomimética. Esse gradiente pode ser devido à diferença de módulo entre as escovas de polímero ramificadas e o substrato de SiHy, ou à estrutura/densidade de ramificação das escovas de polímero, ou uma combinação de ambos. No entanto, são necessários estudos mais aprofundados para compreender completamente a relação entre estrutura e propriedades, especialmente o efeito da ramificação das escovas nas propriedades mecânicas. Medições semelhantes podem auxiliar na caracterização das propriedades mecânicas da superfície de outros materiais ultramacios e dispositivos médicos.
Os conjuntos de dados gerados e/ou analisados ​​durante o presente estudo estão disponíveis mediante solicitação razoável aos respectivos autores.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. e Haugen, HJ Reações biológicas às propriedades físicas e químicas das superfícies de biomateriais. Sociedade Química. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM e Liu, X. Melhoria de biomateriais derivados de humanos para engenharia de tecidos. programação. polímero. a ciência. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Design, implementação clínica e resposta imune de biomateriais em medicina regenerativa. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK e Farr GM Um método aprimorado para determinar dureza e módulo elástico usando experimentos de indentação com medições de carga e deslocamento. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Origens históricas do teste de dureza por indentação. alma mater. a ciência. tecnologias. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Medidas de dureza por indentação em macro, micro e nanoescala: uma revisão crítica. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD e Clapperich, SM Erros de detecção de superfície levam à superestimação do módulo na nanoindentação de materiais macios. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR e Yahya M.Yu. Avaliação do método de nanoindentação para determinar as características mecânicas de nanocompósitos heterogêneos usando métodos experimentais e computacionais. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, e Owart, TS Caracterização mecânica de géis viscoelásticos macios por indentação e análise inversa de elementos finitos baseada em otimização. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J e Chaneler D. Otimização da determinação da viscoelasticidade usando sistemas de medição compatíveis. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. e Pellillo, E. Nanoindentação de superfícies poliméricas. J. Physics. D. Aplicação para física. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. e Van Vliet KJ. Caracterização das propriedades mecânicas viscoelásticas de polímeros altamente elásticos e tecidos biológicos usando indentação por choque. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Avaliação do módulo de elasticidade e trabalho de adesão de materiais macios usando o método Borodich-Galanov (BG) estendido e indentação profunda. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Morfologia em nanoescala e propriedades mecânicas de superfícies poliméricas biomiméticas de lentes de contato de hidrogel de silicone. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).