Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om continue ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Geeft een carrousel van drie dia's tegelijk weer. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Met de ontwikkeling van nieuwe ultrazachte materialen voor medische apparatuur en biomedische toepassingen is de uitgebreide karakterisering van hun fysische en mechanische eigenschappen zowel belangrijk als uitdagend. Een gemodificeerde atoomkrachtmicroscopie (AFM) nano-indentatietechniek werd toegepast om de extreem lage oppervlaktemodulus van de nieuwe biomimetische siliconenhydrogel contactlens lehfilcon A te karakteriseren, gecoat met een laag vertakte polymeerborstelstructuren. Deze methode maakt een nauwkeurige bepaling van contactpunten mogelijk zonder de effecten van viskeuze extrusie bij het naderen van vertakte polymeren. Bovendien maakt het het mogelijk om de mechanische eigenschappen van individuele borstelelementen te bepalen zonder het effect van poroelasticiteit. Dit wordt bereikt door een AFM-sonde te selecteren met een ontwerp (puntgrootte, geometrie en veerconstante) dat bijzonder geschikt is voor het meten van de eigenschappen van zachte materialen en biologische monsters. Deze methode verbetert de gevoeligheid en nauwkeurigheid voor nauwkeurige metingen van het zeer zachte materiaal lehfilcon A, dat een extreem lage elasticiteitsmodulus op het oppervlak (tot 2 kPa) en een extreem hoge elasticiteit in de interne (bijna 100%) waterige omgeving heeft. De resultaten van de oppervlaktestudie onthulden niet alleen de ultrazachte oppervlakte-eigenschappen van de lehfilcon A-lens, maar toonden ook aan dat de modulus van de vertakte polymeerborstels vergelijkbaar was met die van het silicium-waterstofsubstraat. Deze oppervlaktekarakteriseringstechniek kan worden toegepast op andere ultrazachte materialen en medische hulpmiddelen.
De mechanische eigenschappen van materialen die ontworpen zijn voor direct contact met levend weefsel, worden vaak bepaald door de biologische omgeving. De perfecte match van deze materiaaleigenschappen helpt om de gewenste klinische kenmerken van het materiaal te bereiken zonder nadelige cellulaire reacties te veroorzaken1,2,3. Voor homogene bulkmaterialen is de karakterisering van mechanische eigenschappen relatief eenvoudig dankzij de beschikbaarheid van standaardprocedures en testmethoden (bijv. micro-indentatie4,5,6). Voor ultrazachte materialen zoals gels, hydrogels, biopolymeren, levende cellen, enz. zijn deze testmethoden echter over het algemeen niet toepasbaar vanwege beperkingen in de meetresolutie en de inhomogeniteit van sommige materialen7. In de loop der jaren zijn traditionele indentatiemethoden aangepast om een ​​breed scala aan zachte materialen te karakteriseren, maar veel methoden kampen nog steeds met ernstige tekortkomingen die hun gebruik beperken8,9,10,11,12,13. Het gebrek aan gespecialiseerde testmethoden die de mechanische eigenschappen van superzachte materialen en oppervlaktelagen nauwkeurig en betrouwbaar kunnen karakteriseren, beperkt hun gebruik in verschillende toepassingen ernstig.
In ons eerdere werk introduceerden we de lehfilcon A (CL) contactlens, een zacht heterogeen materiaal met alle ultrazachte oppervlakte-eigenschappen die zijn afgeleid van potentieel biomimetische ontwerpen, geïnspireerd op het oppervlak van het hoornvlies van het oog. Dit biomateriaal werd ontwikkeld door een vertakte, vernet polymeerlaag van poly(2-methacryloyloxyethylfosforylcholine (MPC)) (PMPC) te enten op een siliconenhydrogel (SiHy) 15, ontworpen voor medische hulpmiddelen op basis van. Dit entproces creëert een laag op het oppervlak die bestaat uit een zeer zachte en zeer elastische vertakte polymere borstelstructuur. Ons eerdere werk heeft bevestigd dat de biomimetische structuur van lehfilcon A CL superieure oppervlakte-eigenschappen biedt, zoals verbeterde bevochtiging en preventie van vervuiling, verhoogde smering en verminderde cel- en bacteriële adhesie15,16. Bovendien suggereert het gebruik en de ontwikkeling van dit biomimetisch materiaal ook verdere uitbreiding naar andere biomedische hulpmiddelen. Daarom is het cruciaal om de oppervlakte-eigenschappen van dit ultrazachte materiaal te karakteriseren en de mechanische interactie met het oog te begrijpen om een ​​uitgebreide kennisbasis te creëren ter ondersteuning van toekomstige ontwikkelingen en toepassingen. De meeste commercieel verkrijgbare SiHy-contactlenzen bestaan ​​uit een homogeen mengsel van hydrofiele en hydrofobe polymeren die een uniforme materiaalstructuur vormen17. Er zijn verschillende studies uitgevoerd om hun mechanische eigenschappen te onderzoeken met behulp van traditionele druk-, trek- en micro-indrukkingstestmethoden18,19,20,21. Het nieuwe biomimetische ontwerp van lehfilcon A CL maakt het echter tot een uniek heterogeen materiaal waarin de mechanische eigenschappen van de vertakte polymeerborstelstructuren aanzienlijk verschillen van die van het SiHy-basissubstraat. Daarom is het zeer moeilijk om deze eigenschappen nauwkeurig te kwantificeren met behulp van conventionele en indrukkingsmethoden. Een veelbelovende methode maakt gebruik van de nano-indentatietestmethode die is geïmplementeerd in atoomkrachtmicroscopie (AFM). Deze methode is gebruikt om de mechanische eigenschappen van zachte visco-elastische materialen zoals biologische cellen en weefsels, evenals zachte polymeren te bepalen. Bij AFM-nano-indentatie worden de basisprincipes van nano-indentatietesten gecombineerd met de nieuwste ontwikkelingen in AFM-technologie. Dit zorgt voor een verhoogde meetgevoeligheid en maakt het testen van een breed scala aan inherent superzachte materialen mogelijk. Daarnaast biedt de technologie andere belangrijke voordelen door het gebruik van verschillende geometrieën, indenter en probe en de mogelijkheid om in verschillende vloeibare media te testen.
AFM-nano-indentatie kan voorwaardelijk worden onderverdeeld in drie hoofdcomponenten: (1) apparatuur (sensoren, detectoren, probes, enz.); (2) meetparameters (zoals kracht, verplaatsing, snelheid, hellinggrootte, enz.); (3) gegevensverwerking (basislijncorrectie, schatting van het aanraakpunt, gegevensaanpassing, modellering, enz.). Een belangrijk probleem met deze methode is dat verschillende studies in de literatuur die AFM-nano-indentatie gebruiken, zeer verschillende kwantitatieve resultaten rapporteren voor hetzelfde type monster/cel/materiaal37,38,39,40,41. Bijvoorbeeld, Lekka et al. De invloed van de geometrie van de AFM-probe op de gemeten Young-modulus van monsters van mechanisch homogene hydrogel en heterogene cellen werd bestudeerd en vergeleken. Zij rapporteren dat moduluswaarden sterk afhankelijk zijn van de cantileverselectie en de puntvorm, met de hoogste waarde voor een piramidevormige probe en de laagste waarde van 42 voor een bolvormige probe. Evenzo, Selhuber-Unkel et al. Er is aangetoond hoe de indentersnelheid, indentergrootte en -dikte van polyacrylamide (PAAM)-monsters de Young's modulus beïnvloeden, gemeten met ACM43-nano-indentatie. Een andere complicerende factor is het gebrek aan standaard testmaterialen met extreem lage modulus en vrije testprocedures. Dit maakt het zeer moeilijk om nauwkeurige resultaten met vertrouwen te verkrijgen. De methode is echter zeer nuttig voor relatieve metingen en vergelijkende evaluaties tussen vergelijkbare monstertypen, bijvoorbeeld met behulp van AFM-nano-indentatie om normale cellen van kankercellen te onderscheiden 44, 45 .
Bij het testen van zachte materialen met AFM-nano-indentatie is een algemene vuistregel het gebruik van een probe met een lage veerconstante (k) die nauw aansluit bij de modulus van het monster en een halfronde/ronde punt, zodat de eerste probe bij het eerste contact met zachte materialen niet door het monsteroppervlak heen prikt. Het is ook belangrijk dat het door de probe gegenereerde afbuigingssignaal sterk genoeg is om door het laserdetectiesysteem te worden gedetecteerd24,34,46,47. In het geval van ultrazachte heterogene cellen, weefsels en gels is een andere uitdaging het overwinnen van de adhesieve kracht tussen de probe en het monsteroppervlak om reproduceerbare en betrouwbare metingen te garanderen48,49,50. Tot voor kort richtte het meeste werk op het gebied van AFM-nano-indentatie zich op de studie van het mechanische gedrag van biologische cellen, weefsels, gels, hydrogels en biomoleculen met behulp van relatief grote bolvormige probes, algemeen bekend als colloïdale probes (CP's). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Deze tips hebben een straal van 1 tot 50 µm en worden meestal gemaakt van borosilicaatglas, polymethylmethacrylaat (PMMA), polystyreen (PS), siliciumdioxide (SiO2) en diamantachtige koolstof (DLC). Hoewel CP-AFM nano-indentatie vaak de eerste keuze is voor de karakterisering van zachte monsters, heeft het zijn eigen problemen en beperkingen. Het gebruik van grote, micron-formaat bolvormige tips vergroot het totale contactoppervlak van de tip met het monster en resulteert in een aanzienlijk verlies aan ruimtelijke resolutie. Voor zachte, inhomogene monsters, waarbij de mechanische eigenschappen van lokale elementen aanzienlijk kunnen verschillen van het gemiddelde over een groter gebied, kan CP-indentatie elke inhomogeniteit in eigenschappen op lokale schaal verbergen52. Colloïdale probes worden meestal gemaakt door micron-formaat colloïdale bollen te bevestigen aan tiploze cantilevers met behulp van epoxylijmen. Het productieproces zelf kent veel problemen en kan leiden tot inconsistenties in het kalibratieproces van de sonde. Bovendien beïnvloeden de grootte en massa van colloïdale deeltjes direct de belangrijkste kalibratieparameters van de cantilever, zoals resonantiefrequentie, veerstijfheid en afbuigingsgevoeligheid56,57,58. Veelgebruikte methoden voor conventionele AFM-sondes, zoals temperatuurkalibratie, bieden daarom mogelijk geen nauwkeurige kalibratie voor CP, en andere methoden kunnen nodig zijn om deze correcties uit te voeren57, 59, 60, 61. Typische CP-indrukkingsexperimenten gebruiken cantilevers met grote afwijkingen om de eigenschappen van zachte monsters te bestuderen, wat een ander probleem creëert bij het kalibreren van het niet-lineaire gedrag van de cantilever bij relatief grote afwijkingen62,63,64. Moderne indrukkingsmethoden voor colloïdale sondes houden doorgaans rekening met de geometrie van de cantilever die wordt gebruikt om de sonde te kalibreren, maar negeren de invloed van colloïdale deeltjes, wat extra onzekerheid in de nauwkeurigheid van de methode creëert38,61. Evenzo zijn de elastische moduli, berekend door middel van contactmodelfitting, direct afhankelijk van de geometrie van de indrukkingssonde, en kan een mismatch tussen de punt en de oppervlakte-eigenschappen van het monster tot onnauwkeurigheden leiden27, 65, 66, 67, 68. Recent werk van Spencer et al. belicht de factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het karakteriseren van zachte polymeerborstels met behulp van de CP-AFM nano-indrukkingsmethode. Zij rapporteerden dat de retentie van een viskeuze vloeistof in polymeerborstels als functie van de snelheid resulteert in een toename van de kopbelasting en dus in verschillende metingen van snelheidsafhankelijke eigenschappen30,69,70,71.
In deze studie hebben we de oppervlaktemodulus van het ultrazachte, zeer elastische materiaal lehfilcon A CL gekarakteriseerd met behulp van een aangepaste AFM-nano-indentatiemethode. Gezien de eigenschappen en de nieuwe structuur van dit materiaal is het gevoeligheidsbereik van de traditionele indentatiemethode duidelijk onvoldoende om de modulus van dit extreem zachte materiaal te karakteriseren. Daarom is het noodzakelijk om een ​​AFM-nano-indentatiemethode met een hogere en lagere gevoeligheid te gebruiken. Na het bekijken van de tekortkomingen en problemen van bestaande colloïdale AFM-probe-nano-indentatietechnieken, laten we zien waarom we hebben gekozen voor een kleinere, op maat ontworpen AFM-probe om gevoeligheid, achtergrondruis, een nauwkeurig contactpunt, het meten van de snelheidsmodulus van zachte heterogene materialen, zoals afhankelijkheid van vochtretentie, en nauwkeurige kwantificering te elimineren. Bovendien waren we in staat om de vorm en afmetingen van de inkepingspunt nauwkeurig te meten, waardoor we het kegel-bolmodel konden gebruiken om de elasticiteitsmodulus te bepalen zonder het contactoppervlak van de punt met het materiaal te beoordelen. De twee impliciete aannames die in dit werk worden gekwantificeerd, zijn de volledig elastische materiaaleigenschappen en de indrukkingsdiepte-onafhankelijke modulus. Met behulp van deze methode hebben we eerst ultrazachte standaarden met een bekende modulus getest om de methode te kwantificeren, en vervolgens deze methode gebruikt om de oppervlakken van twee verschillende contactlensmaterialen te karakteriseren. Deze methode voor het karakteriseren van AFM-nano-indrukkingsoppervlakken met verhoogde gevoeligheid zal naar verwachting toepasbaar zijn op een breed scala aan biomimetische heterogene ultrazachte materialen met potentiële toepassingen in medische apparatuur en biomedische toepassingen.
Lehfilcon A-contactlenzen (Alcon, Fort Worth, Texas, VS) en hun siliconenhydrogelsubstraten werden gekozen voor nano-indentatie-experimenten. Bij het experiment werd een speciaal ontworpen lensvatting gebruikt. Om de lens voor de test te installeren, werd deze voorzichtig op de koepelvormige standaard geplaatst, waarbij ervoor werd gezorgd dat er geen luchtbellen in kwamen, en vervolgens met de randen vastgezet. Een gat in de bevestiging bovenaan de lenshouder biedt toegang tot het optische centrum van de lens voor nano-indentatie-experimenten en houdt de vloeistof op zijn plaats. Dit houdt de lenzen volledig gehydrateerd. 500 μl contactlensverpakkingsoplossing werd gebruikt als testoplossing. Om de kwantitatieve resultaten te verifiëren, werden commercieel verkrijgbare niet-geactiveerde polyacrylamide (PAAM)-hydrogelen bereid uit een polyacrylamide-co-methyleen-bisacrylamide-samenstelling (100 mm Petrisoft Petrischalen, Matrigen, Irvine, CA, VS), met een bekende elasticiteitsmodulus van 1 kPa. Gebruik 4-5 druppels (ongeveer 125 µl) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS van Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, VS) en 1 druppel OPTI-FREE Puremoist contactlensoplossing (Alcon, Vaud, TX, VS). ) op het grensvlak tussen de AFM-hydrogel en de sonde.
Monsters van Lehfilcon A CL- en SiHy-substraten werden gevisualiseerd met behulp van een FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM)-systeem, uitgerust met een Scanning Transmission Electron Microscope (STEM)-detector. Om de monsters voor te bereiden, werden de lenzen eerst met water gewassen en in taartvormige wiggen gesneden. Om een ​​differentieel contrast te bereiken tussen de hydrofiele en hydrofobe componenten van de monsters, werd een 0,10% gestabiliseerde oplossing van RuO4 als kleurstof gebruikt, waarin de monsters 30 minuten werden ondergedompeld. De kleuring met Lehfilcon A CL RuO4 is niet alleen belangrijk voor een verbeterd differentieel contrast, maar helpt ook om de structuur van de vertakte polymeerborstels in hun oorspronkelijke vorm te behouden, die vervolgens zichtbaar zijn op STEM-beelden. Ze werden vervolgens gewassen en gedehydrateerd in een reeks ethanol/watermengsels met toenemende ethanolconcentratie. De monsters werden vervolgens gegoten met EMBed 812/Araldite-epoxy, dat een nacht uithardde bij 70 °C. Monsterblokken verkregen door harspolymerisatie werden gesneden met een ultramicrotoom en de resulterende dunne coupes werden gevisualiseerd met een STEM-detector in laagvacuümmodus met een versnellingsspanning van 30 kV. Hetzelfde SEM-systeem werd gebruikt voor de gedetailleerde karakterisering van de PFQNM-LC-A-CAL AFM-sonde (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, VS). SEM-beelden van de AFM-sonde werden verkregen in een typische hoogvacuümmodus met een versnellingsspanning van 30 kV. Neem beelden op onder verschillende hoeken en vergrotingen om alle details van de vorm en grootte van de AFM-sondepunt vast te leggen. Alle relevante puntafmetingen in de beelden werden digitaal gemeten.
Een Dimension FastScan Bio Icon atoomkrachtmicroscoop (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, VS) met de modus "PeakForce QNM in Fluid" werd gebruikt om lehfilcon A CL, SiHy-substraat en PAAm-hydrogelmonsters te visualiseren en nano-indenteren. Voor beeldvormende experimenten werd een PEAKFORCE-HIRS-FA-sonde (Bruker) met een nominale tipradius van 1 nm gebruikt om hoge-resolutiebeelden van het monster te maken met een scansnelheid van 0,50 Hz. Alle beelden werden gemaakt in waterige oplossing.
AFM-nano-indentatie-experimenten werden uitgevoerd met een PFQNM-LC-A-CAL-sonde (Bruker). De AFM-sonde heeft een siliciumpunt op een nitride cantilever van 345 nm dik, 54 µm lang en 4,5 µm breed met een resonantiefrequentie van 45 kHz. De sonde is specifiek ontworpen voor het karakteriseren en uitvoeren van kwantitatieve nanomechanische metingen op zachte biologische monsters. De sensoren zijn afzonderlijk in de fabriek gekalibreerd met vooraf gekalibreerde veerinstellingen. De veerconstanten van de in deze studie gebruikte sondes lagen in het bereik van 0,05–0,1 N/m. Om de vorm en grootte van de punt nauwkeurig te bepalen, werd de sonde gedetailleerd gekarakteriseerd met behulp van SEM. Op afb. Figuur 1a toont een scanning elektronenmicroscoopfoto met hoge resolutie en lage vergroting van de PFQNM-LC-A-CAL-sonde, die een holistisch beeld geeft van het sondeontwerp. Op afb. Figuur 1b toont een vergroot beeld van de bovenkant van de probepunt, met informatie over de vorm en grootte van de punt. Aan het uiteinde is de naald een halve bol met een diameter van ongeveer 140 nm (Fig. 1c). Daaronder loopt de punt taps toe tot een conische vorm, met een gemeten lengte van ongeveer 500 nm. Buiten het taps toelopende gebied is de punt cilindrisch en eindigt in een totale puntlengte van 1,18 µm. Dit is het belangrijkste functionele onderdeel van de probepunt. Daarnaast werd een grote bolvormige polystyreen (PS) probe (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, VS) met een puntdiameter van 45 µm en een veerconstante van 2 N/m ook gebruikt voor de test als colloïdale probe. Ter vergelijking: de PFQNM-LC-A-CAL 140 nm probe.
Er is gerapporteerd dat vloeistof kan worden opgesloten tussen de AFM-sonde en de polymeerborstelstructuur tijdens nano-indentatie, wat een opwaartse kracht op de AFM-sonde zal uitoefenen voordat deze daadwerkelijk het oppervlak raakt69. Dit viskeuze extrusie-effect als gevolg van vloeistofretentie kan het schijnbare contactpunt veranderen, waardoor oppervlaktemodulusmetingen worden beïnvloed. Om het effect van de sondegeometrie en indrukkingssnelheid op vloeistofretentie te bestuderen, werden indrukkingskrachtcurven uitgezet voor lehfilcon A CL-monsters met behulp van een sonde met een diameter van 140 nm bij constante verplaatsingssnelheden van 1 µm/s en 2 µm/s. Sondediameter 45 µm, vaste krachtinstelling 6 nN bereikt bij 1 µm/s. Experimenten met een sonde met een diameter van 140 nm werden uitgevoerd bij een indrukkingssnelheid van 1 µm/s en een ingestelde kracht van 300 pN, gekozen om een ​​contactdruk te creëren binnen het fysiologische bereik (1–8 kPa) van het bovenste ooglid. druk 72. Zachte, kant-en-klare monsters van PAA-hydrogel met een druk van 1 kPa werden getest op een indrukkingskracht van 50 pN bij een snelheid van 1 μm/s met behulp van een sonde met een diameter van 140 nm.
Omdat de lengte van het conische deel van de punt van de PFQNM-LC-A-CAL-sonde ongeveer 500 nm bedraagt, kan bij elke indrukkingsdiepte < 500 nm veilig worden aangenomen dat de geometrie van de sonde tijdens de indrukking trouw blijft aan de kegelvorm. Bovendien wordt aangenomen dat het oppervlak van het te testen materiaal een reversibele elastische respons zal vertonen, wat ook in de volgende paragrafen zal worden bevestigd. Afhankelijk van de vorm en grootte van de punt hebben we daarom gekozen voor het kegel-bol-fittingmodel, ontwikkeld door Briscoe, Sebastian en Adams, dat beschikbaar is in de software van de leverancier, om onze AFM-nano-indrukkingsexperimenten te verwerken (NanoScope). Software voor scheidingsdata-analyse, Bruker) 73. Het model beschrijft de kracht-verplaatsingsrelatie F(δ) voor een kegel met een bolvormig apexdefect. Op afb. Figuur 2 toont de contactgeometrie tijdens de interactie van een stijve kegel met een bolvormige punt, waarbij R de straal van de bolvormige punt is, a de contactradius, b de contactradius aan het uiteinde van de bolvormige punt, δ de contactradius. De indrukkingsdiepte, θ de halve hoek van de kegel. De SEM-opname van deze probe laat duidelijk zien dat de bolvormige punt met een diameter van 140 nm tangentieel overgaat in een kegel, dus hier wordt b alleen gedefinieerd door R, d.w.z. b = R cos θ. De door de leverancier geleverde software biedt een kegel-bolrelatie om Young's modulus (E) te berekenen op basis van krachtscheidingsgegevens, ervan uitgaande dat a > b. Relatie:
waarbij F de indrukkingskracht is, E de elasticiteitsmodulus en ν de Poisson-verhouding. De contactradius a kan worden geschat met behulp van:
Schema van de contactgeometrie van een stijve kegel met een bolvormige punt, gedrukt in het materiaal van een Lefilcon-contactlens met een oppervlaktelaag van vertakte polymeerborstels.
Als a ≤ b, dan wordt de relatie gereduceerd tot de vergelijking voor een conventionele bolvormige indringer;
Wij zijn van mening dat de interactie van de inkepingssonde met de vertakte structuur van de PMPC-polymeerborstel ervoor zal zorgen dat de contactradius a groter is dan de sferische contactradius b. Daarom hebben we voor alle kwantitatieve metingen van de elasticiteitsmodulus die in deze studie zijn uitgevoerd, de afhankelijkheid gebruikt die is verkregen voor het geval a > b.
De ultrazachte biomimetische materialen die in deze studie werden bestudeerd, werden uitgebreid in beeld gebracht met behulp van scanning transmissie-elektronenmicroscopie (STEM) van de monsterdoorsnede en atoomkrachtmicroscopie (AFM) van het oppervlak. Deze gedetailleerde oppervlaktekarakterisering werd uitgevoerd als een uitbreiding van ons eerder gepubliceerde werk, waarin we vaststelden dat de dynamisch vertakte polymere borstelstructuur van het PMPC-gemodificeerde lehfilcon A CL-oppervlak vergelijkbare mechanische eigenschappen vertoonde als natuurlijk hoornvliesweefsel 14 . Om deze reden verwijzen we naar contactlensoppervlakken als biomimetische materialen 14 . Op fig. 3a,b worden dwarsdoorsneden getoond van vertakte PMPC-polymeerborstelstructuren op het oppervlak van respectievelijk een lehfilcon A CL-substraat en een onbehandeld SiHy-substraat. De oppervlakken van beide monsters werden verder geanalyseerd met behulp van hoge-resolutie AFM-beelden, die de resultaten van de STEM-analyse verder bevestigden (Fig. 3c, d). Samengevat geven deze beelden een geschatte lengte van de vertakte polymeerborstelstructuur van PMPC bij 300–400 nm, wat cruciaal is voor de interpretatie van AFM-nano-indentatiemetingen. Een andere belangrijke observatie die uit de beelden naar voren komt, is dat de algehele oppervlaktestructuur van het CL-biomimetisch materiaal morfologisch verschilt van die van het SiHy-substraatmateriaal. Dit verschil in oppervlaktemorfologie kan zichtbaar worden tijdens hun mechanische interactie met de indenterende AFM-sonde en vervolgens in de gemeten moduluswaarden.
STEM-dwarsdoorsnedebeelden van (a) lehfilcon A CL en (b) SiHy-substraat. Schaalbalk, 500 nm. AFM-beelden van het oppervlak van het lehfilcon A CL-substraat (c) en het basis SiHy-substraat (d) (3 µm × 3 µm).
Biogeïnspireerde polymeren en polymeerborstelstructuren zijn van nature zacht en zijn uitgebreid bestudeerd en gebruikt in diverse biomedische toepassingen. 74, 75, 76, 77. Daarom is het belangrijk om de AFM-nano-indentatiemethode te gebruiken, die hun mechanische eigenschappen nauwkeurig en betrouwbaar kan meten. Tegelijkertijd maken de unieke eigenschappen van deze ultrazachte materialen, zoals een extreem lage elasticiteitsmodulus, een hoog vloeistofgehalte en een hoge elasticiteit, het vaak moeilijk om het juiste materiaal, de juiste vorm en de juiste maat van de indringingssonde te kiezen. Dit is belangrijk om te voorkomen dat de indringer het zachte oppervlak van het monster doorboort, wat zou leiden tot fouten bij het bepalen van het contactpunt met het oppervlak en het contactoppervlak.
Hiervoor is een grondig begrip van de morfologie van ultrazachte biomimetische materialen (lehfilcon A CL) essentieel. Informatie over de grootte en structuur van de vertakte polymeerborstels, verkregen met de beeldvormingsmethode, vormt de basis voor de mechanische karakterisering van het oppervlak met behulp van AFM-nano-indentatietechnieken. In plaats van microngrote bolvormige colloïdale probes kozen we voor de PFQNM-LC-A-CAL siliciumnitrideprobe (Bruker) met een puntdiameter van 140 nm, speciaal ontworpen voor kwantitatieve kartering van de mechanische eigenschappen van biologische monsters 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. De reden voor het gebruik van relatief scherpe probes in vergelijking met conventionele colloïdale probes kan worden verklaard door de structurele kenmerken van het materiaal. Een vergelijking van de grootte van de probepunt (~140 nm) met de vertakte polymeerborstels op het oppervlak van CL lehfilcon A, weergegeven in Fig. 3a, laat zien dat de punt groot genoeg is om direct in contact te komen met deze borstelstructuren, waardoor de kans kleiner is dat de punt erdoorheen prikt. Ter illustratie is in Fig. 4 een STEM-afbeelding van de CL lehfilcon A en de inspringende punt van de AFM-probe (op schaal getekend).
Schematische weergave van STEM-afbeelding van lehfilcon A CL en een ACM-indrukkingssonde (op schaal getekend).
Bovendien is de tipgrootte van 140 nm klein genoeg om het risico op plakkerige extrusie-effecten, zoals eerder gerapporteerd voor polymeerborstels geproduceerd met de CP-AFM nano-indentatiemethode, te vermijden69,71. We nemen aan dat vanwege de speciale kegelvormige vorm en de relatief kleine omvang van deze AFM-tip (Fig. 1), de aard van de krachtcurve gegenereerd door lehfilcon A CL nano-indentatie niet afhankelijk is van de indrukkingssnelheid of de laad-/ontlaadsnelheid. Daarom wordt deze niet beïnvloed door poro-elastische effecten. Om deze hypothese te testen, werden lehfilcon A CL-monsters ingedeukt met een vaste maximale kracht met behulp van een PFQNM-LC-A-CAL-sonde, maar met twee verschillende snelheden. De resulterende trek- en intrekkrachtcurves werden gebruikt om de kracht (nN) in scheiding (µm) weer te geven, zoals weergegeven in Figuur 5a. Het is duidelijk dat de krachtcurven tijdens het laden en lossen volledig overlappen, en er is geen duidelijk bewijs dat de krachtafschuiving bij een indrukkingsdiepte van nul toeneemt met de indrukkingssnelheid in de afbeelding. Dit suggereert dat de individuele borstelelementen werden gekarakteriseerd zonder een poroelastisch effect. Daarentegen zijn vloeistofretentie-effecten (viskeuze extrusie- en poroelasticiteitseffecten) duidelijk zichtbaar voor de AFM-sonde met een diameter van 45 µm bij dezelfde indrukkingssnelheid en worden ze benadrukt door de hysterese tussen de rek- en intrekcurven, zoals weergegeven in afbeelding 5b. Deze resultaten ondersteunen de hypothese en suggereren dat sondes met een diameter van 140 nm een ​​goede keuze zijn voor het karakteriseren van dergelijke zachte oppervlakken.
lehfilcon A CL-indrukkingskrachtcurven met behulp van ACM; (a) met behulp van een sonde met een diameter van 140 nm bij twee laadsnelheden, waarmee de afwezigheid van een poro-elastisch effect tijdens oppervlakte-indrukking wordt aangetoond; (b) met behulp van sondes met een diameter van 45 µm en 140 nm. s tonen de effecten van viskeuze extrusie en poro-elasticiteit voor grote sondes in vergelijking met kleinere sondes.
Om ultrazachte oppervlakken te karakteriseren, moeten AFM-nano-indentatiemethoden de beste probe hebben om de eigenschappen van het te bestuderen materiaal te bestuderen. Naast de vorm en grootte van de punt spelen de gevoeligheid van het AFM-detectorsysteem, de gevoeligheid voor puntafbuiging in de testomgeving en de cantilever-stijfheid een belangrijke rol bij het bepalen van de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van nano-indentatiemetingen. Voor ons AFM-systeem bedraagt ​​de detectielimiet van de Position Sensitive Detector (PSD) ongeveer 0,5 mV. Deze is gebaseerd op de vooraf gekalibreerde veerconstante en de berekende vloeistofafbuigingsgevoeligheid van de PFQNM-LC-A-CAL-probe, wat overeenkomt met de theoretische belastingsgevoeligheid. is minder dan 0,1 pN. Daarom maakt deze methode het meten van een minimale indrukkingskracht ≤ 0,1 pN mogelijk zonder enige perifere ruiscomponent. Het is echter vrijwel onmogelijk voor een AFM-systeem om perifere ruis tot dit niveau te reduceren vanwege factoren zoals mechanische trillingen en vloeistofdynamica. Deze factoren beperken de algehele gevoeligheid van de AFM nano-indentatiemethode en resulteren ook in een achtergrondruissignaal van ongeveer ≤ 10 pN. Voor oppervlaktekarakterisering werden lehfilcon A CL- en SiHy-substraatmonsters ingedeukt onder volledig gehydrateerde omstandigheden met behulp van een 140 nm-sonde voor SEM-karakterisering, en de resulterende krachtcurven werden gesuperponeerd tussen kracht (pN) en druk. De scheidingsgrafiek (µm) is weergegeven in Figuur 6a. Vergeleken met het SiHy-basissubstraat toont de lehfilcon A CL-krachtcurve duidelijk een overgangsfase die begint bij het contactpunt met de gevorkte polymeerborstel en eindigt met een scherpe verandering in helling die het contact van de punt met het onderliggende materiaal markeert. Dit overgangsgedeelte van de krachtcurve benadrukt het werkelijk elastische gedrag van de vertakte polymeerborstel op het oppervlak, zoals blijkt uit de compressiecurve die de spanningscurve nauw volgt en het contrast in mechanische eigenschappen tussen de borstelstructuur en het volumineuze SiHy-materiaal. Bij vergelijking van lefilcon. De scheiding van de gemiddelde lengte van een vertakte polymeerborstel in de STEM-afbeelding van het PCS (Fig. 3a) en de bijbehorende krachtcurve langs de abscis in Fig. 3a.6a laat zien dat de methode in staat is om de punt en het vertakte polymeer te detecteren dat de bovenkant van het oppervlak bereikt. Contact tussen borstelstructuren. Bovendien wijst een nauwe overlapping van de krachtcurves erop dat er geen vloeistofretentie-effect is. In dit geval is er absoluut geen hechting tussen de naald en het oppervlak van het monster. De bovenste delen van de krachtcurves van de twee monsters overlappen elkaar, wat de gelijkenis van de mechanische eigenschappen van de substraatmaterialen weerspiegelt.
(a) AFM nano-indentatiekrachtcurven voor lehfilcon A CL-substraten en SiHy-substraten, (b) krachtcurven die de schatting van het contactpunt laten zien met behulp van de achtergrondruisdrempelmethode.
Om de fijnere details van de krachtcurve te bestuderen, is de trekcurve van het lehfilcon A CL-monster opnieuw uitgezet in Fig. 6b met een maximale kracht van 50 pN langs de y-as. Deze grafiek geeft belangrijke informatie over de oorspronkelijke achtergrondruis. De ruis ligt in het bereik van ±10 pN, wat wordt gebruikt om het contactpunt nauwkeurig te bepalen en de indrukkingsdiepte te berekenen. Zoals in de literatuur wordt vermeld, is de identificatie van contactpunten cruciaal voor een nauwkeurige beoordeling van materiaaleigenschappen zoals modulus85. Een aanpak met automatische verwerking van krachtcurvegegevens heeft een verbeterde fit aangetoond tussen datafitting en kwantitatieve metingen voor zachte materialen86. In dit werk is onze keuze van contactpunten relatief eenvoudig en objectief, maar deze heeft zijn beperkingen. Onze conservatieve benadering voor het bepalen van het contactpunt kan resulteren in licht overschatte moduluswaarden voor kleinere indrukkingsdieptes (< 100 nm). Het gebruik van algoritmegebaseerde contactpuntdetectie en geautomatiseerde gegevensverwerking zou in de toekomst een voortzetting van dit werk kunnen zijn om onze methode verder te verbeteren. Nederlands Dus, voor intrinsieke achtergrondruis in de orde van ±10 pN, definiëren we het contactpunt als het eerste datapunt op de x-as in Figuur 6b met een waarde van ≥10 pN. Vervolgens markeert, in overeenstemming met de ruisdrempel van 10 pN, een verticale lijn op het niveau van ~0,27 µm het contactpunt met het oppervlak, waarna de rekcurve doorgaat totdat het substraat de indrukkingsdiepte van ~270 nm bereikt. Interessant is dat, gebaseerd op de grootte van de vertakte polymeerborstelkenmerken (300–400 nm) gemeten met de beeldvormingsmethode, de indrukkingsdiepte van het CL lehfilcon A-monster waargenomen met de achtergrondruisdrempelmethode ongeveer 270 nm is, wat zeer dicht bij de meetgrootte met STEM ligt. Deze resultaten bevestigen verder de compatibiliteit en toepasbaarheid van de vorm en grootte van de AFM-sondepunt voor indrukking van deze zeer zachte en zeer elastische vertakte polymeerborstelstructuur. Deze gegevens leveren ook sterk bewijs voor onze methode om achtergrondruis te gebruiken als drempelwaarde voor het bepalen van contactpunten. Kwantitatieve resultaten verkregen uit wiskundige modellering en krachtcurve-aanpassing zouden dus relatief nauwkeurig moeten zijn.
Kwantitatieve metingen met AFM-nano-indentatiemethoden zijn volledig afhankelijk van de wiskundige modellen die worden gebruikt voor de dataselectie en de daaropvolgende analyse. Daarom is het belangrijk om alle factoren met betrekking tot de keuze van het indringlichaam, de materiaaleigenschappen en de mechanica van hun interactie te overwegen voordat een bepaald model wordt gekozen. In dit geval werd de puntgeometrie zorgvuldig gekarakteriseerd met behulp van SEM-micrografieën (Fig. 1). Op basis van de resultaten is de AFM-nano-indenting-probe met een diameter van 140 nm, een harde kegel en een bolvormige puntgeometrie, een goede keuze voor het karakteriseren van lehfilcon A CL79-monsters. Een andere belangrijke factor die zorgvuldig moet worden geëvalueerd, is de elasticiteit van het te testen polymeermateriaal. Hoewel de initiële nano-indentatiegegevens (Fig. 5a en 6a) de kenmerken van de overlapping van de trek- en drukcurven, d.w.z. het volledige elastische herstel van het materiaal, duidelijk schetsen, is het uiterst belangrijk om de puur elastische aard van de contacten te bevestigen. Hiertoe werden twee opeenvolgende indrukkingen uitgevoerd op dezelfde locatie op het oppervlak van het lehfilcon A CL-monster met een indrukkingssnelheid van 1 µm/s onder volledige hydratatie. De resulterende krachtcurvegegevens worden weergegeven in figuur 7 en, zoals verwacht, zijn de expansie- en compressiecurves van de twee afdrukken vrijwel identiek, wat de hoge elasticiteit van de vertakte polymeerborstelstructuur benadrukt.
Twee indrukkingskrachtcurven op dezelfde plaats op het oppervlak van lehfilcon A CL geven de ideale elasticiteit van het lensoppervlak aan.
Gebaseerd op informatie verkregen uit SEM- en STEM-beelden van respectievelijk de probepunt en het lehfilcon A CL-oppervlak, is het kegelbolmodel een redelijke wiskundige weergave van de interactie tussen de AFM-probepunt en het te testen zachte polymeermateriaal. Bovendien gelden voor dit kegelbolmodel de fundamentele aannames over de elastische eigenschappen van het geïmprinte materiaal voor dit nieuwe biomimetisch materiaal en worden deze gebruikt om de elasticiteitsmodulus te kwantificeren.
Na een uitgebreide evaluatie van de AFM-nano-indentatiemethode en de componenten ervan, waaronder de eigenschappen van de indentatieprobe (vorm, grootte en veerstijfheid), gevoeligheid (achtergrondruis en schatting van het contactpunt) en datafittingmodellen (kwantitatieve modulusmetingen), werd de methode gebruikt. Het karakteriseren van commercieel verkrijgbare ultrazachte monsters om kwantitatieve resultaten te verifiëren. Een commerciële polyacrylamide (PAAM)-hydrogel met een elasticiteitsmodulus van 1 kPa werd getest onder gehydrateerde omstandigheden met een 140 nm-probe. Details over de moduletests en -berekeningen zijn te vinden in de aanvullende informatie. De resultaten toonden aan dat de gemiddelde gemeten modulus 0,92 kPa bedroeg en dat de %RSD en de procentuele (%) afwijking van de bekende modulus minder dan 10% bedroegen. Deze resultaten bevestigen de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de AFM-nano-indentatiemethode die in dit werk is gebruikt om de moduli van ultrazachte materialen te meten. De oppervlakken van de lehfilcon A CL-monsters en het SiHy-basissubstraat werden verder gekarakteriseerd met behulp van dezelfde AFM-nano-indentatiemethode om de schijnbare contactmodulus van het ultrazachte oppervlak te bestuderen als functie van de indrukkingsdiepte. Er werden curven gegenereerd voor de scheiding van de indrukkingskracht voor drie specimens van elk type (n = 3; één indrukking per specimen) bij een kracht van 300 pN, een snelheid van 1 µm/s en volledige hydratatie. De curve voor de verdeling van de indrukkingskracht werd benaderd met behulp van een kegel-bolmodel. Om de modulus afhankelijk van de indrukkingsdiepte te verkrijgen, werd een 40 nm breed deel van de krachtcurve ingesteld bij elke stap van 20 nm vanaf het contactpunt, en werden de moduluswaarden gemeten bij elke stap van de krachtcurve. Spin Cy et al. Een vergelijkbare aanpak is gebruikt om de modulusgradiënt van poly(laurylmethacrylaat) (P12MA) polymeerborstels te karakteriseren met behulp van colloïdale AFM-sonde nano-indrukking, en deze zijn consistent met gegevens die zijn gebruikt met het Hertz-contactmodel. Deze aanpak levert een grafiek op van de schijnbare contactmodulus (kPa) versus de indrukkingsdiepte (nm), zoals weergegeven in Figuur 8, die de schijnbare contactmodulus/dieptegradiënt illustreert. De berekende elastische modulus van het CL lehfilcon A-monster ligt in het bereik van 2–3 kPa binnen de bovenste 100 nm van het monster, waarboven deze begint toe te nemen met de diepte. Aan de andere kant, bij het testen van het SiHy-basissubstraat zonder een borstelachtige film op het oppervlak, is de maximale indrukkingsdiepte bereikt bij een kracht van 300 pN minder dan 50 nm, en de moduluswaarde verkregen uit de gegevens is ongeveer 400 kPa, wat vergelijkbaar is met de waarden van de Young-modulus voor bulkmaterialen.
Schijnbare contactmodulus (kPa) versus indrukkingsdiepte (nm) voor lehfilcon A CL- en SiHy-substraten met behulp van de AFM-nanoindentatiemethode met kegel-bolgeometrie om de modulus te meten.
Het bovenste oppervlak van de nieuwe biomimetische vertakte polymeerborstelstructuur vertoont een extreem lage elasticiteitsmodulus (2–3 kPa). Dit komt overeen met het vrijhangende uiteinde van de gevorkte polymeerborstel, zoals weergegeven in de STEM-afbeelding. Hoewel er enig bewijs is voor een modulusgradiënt aan de buitenrand van de CL, is het belangrijkste substraat met hoge modulus van grotere invloed. De bovenste 100 nm van het oppervlak bevindt zich echter binnen 20% van de totale lengte van de vertakte polymeerborstel, dus het is redelijk om aan te nemen dat de gemeten waarden van de modulus in dit indrukkingsdieptebereik relatief nauwkeurig zijn en niet sterk afhankelijk zijn van het effect van het onderste object.
Vanwege het unieke biomimetische ontwerp van lehfilcon A-contactlenzen, bestaande uit vertakte PMPC-polymeerborstelstructuren geënt op het oppervlak van SiHy-substraten, is het zeer moeilijk om de mechanische eigenschappen van hun oppervlaktestructuren betrouwbaar te karakteriseren met behulp van traditionele meetmethoden. Hier presenteren we een geavanceerde AFM-nano-indentatiemethode voor het nauwkeurig karakteriseren van ultrazachte materialen zoals lefilcon A met een hoog watergehalte en extreem hoge elasticiteit. Deze methode is gebaseerd op het gebruik van een AFM-probe waarvan de puntgrootte en -geometrie zorgvuldig zijn gekozen om te passen bij de structurele afmetingen van de te printen ultrazachte oppervlaktekenmerken. Deze combinatie van afmetingen tussen probe en structuur zorgt voor een verhoogde gevoeligheid, waardoor we de lage modulus en inherente elastische eigenschappen van vertakte polymeerborstelelementen kunnen meten, ongeacht poroelastische effecten. De resultaten toonden aan dat de unieke vertakte PMPC-polymeerborstels, kenmerkend voor het lensoppervlak, een extreem lage elasticiteitsmodulus (tot 2 kPa) en een zeer hoge elasticiteit (bijna 100%) hadden bij tests in een waterige omgeving. De resultaten van AFM-nano-indentatie stelden ons ook in staat om de schijnbare contactmodulus/dieptegradiënt (30 kPa/200 nm) van het biomimetische lensoppervlak te karakteriseren. Deze gradiënt kan te wijten zijn aan het modulusverschil tussen de vertakte polymeerborstels en het SiHy-substraat, of aan de vertakte structuur/dichtheid van de polymeerborstels, of aan een combinatie daarvan. Verdere diepgaande studies zijn echter nodig om de relatie tussen structuur en eigenschappen volledig te begrijpen, met name het effect van borstelvertakking op mechanische eigenschappen. Vergelijkbare metingen kunnen helpen bij het karakteriseren van de mechanische eigenschappen van het oppervlak van andere ultrazachte materialen en medische hulpmiddelen.
Datasets die tijdens het huidige onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de respectievelijke auteurs.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. en Haugen, HJ. Biologische reacties op de fysische en chemische eigenschappen van oppervlakken van biomaterialen. Chemical. Society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM en Liu, X. Verbetering van van mensen afkomstige biomaterialen voor weefseltechnologie. Programmeren. Polymeer. De wetenschap. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Ontwerp, klinische implementatie en immuunrespons van biomaterialen in de regeneratieve geneeskunde. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK en Farr GM Een verbeterde methode voor het bepalen van hardheid en elasticiteitsmodulus met behulp van indrukkingsexperimenten met belasting- en verplaatsingsmetingen. J. Alma mater. opslagtank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historische oorsprong van indrukkingshardheidstesten. alma mater. de wetenschap. technologieën. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Indrukkingshardheidsmetingen op macro-, micro- en nanoschaal: een kritische evaluatie. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD en Clapperich, SM. Oppervlaktedetectiefouten leiden tot modulusoverschatting bij nano-indentatie van zachte materialen. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR en Yahya M.Yu. Evaluatie van de nano-indentatiemethode voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van heterogene nanocomposieten met behulp van experimentele en computationele methoden. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, en Owart, TS Mechanische karakterisering van zachte visco-elastische gels door middel van inkeping en optimalisatie-gebaseerde inverse eindige elementenanalyse. J. Mecha. Gedrag. Biomedische Wetenschappen. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J en Chaneler D. Optimalisatie van visco-elasticiteitsbepaling met behulp van compatibele meetsystemen. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. en Pellillo, E. Nano-indentatie van polymere oppervlakken. J. Fysica. D. Solliciteer voor natuurkunde. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. en Van Vliet KJ Karakterisering van visco-elastische mechanische eigenschappen van zeer elastische polymeren en biologische weefsels met behulp van schokindrukking. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluatie van de elasticiteitsmodulus en hechtingswerk van zachte materialen met behulp van de uitgebreide Borodich-Galanov (BG)-methode en diepe indrukking. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Nanoschaalmorfologie en mechanische eigenschappen van biomimetische polymere oppervlakken van siliconenhydrogel contactlenzen. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).