Terima kasih kerana melayari Nature.com. Anda menggunakan versi pelayar dengan sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Memaparkan karusel tiga slaid sekaligus. Gunakan butang Sebelumnya dan Seterusnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa atau gunakan butang gelangsar di hujungnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa.
Dengan pembangunan bahan ultra lembut baharu untuk peranti perubatan dan aplikasi bioperubatan, pencirian komprehensif sifat fizikal dan mekanikalnya adalah penting dan mencabar. Teknik nanoindentasi mikroskopi daya atom (AFM) yang diubah suai telah digunakan untuk mencirikan modulus permukaan yang sangat rendah bagi kanta lekap hidrogel silikon biomimetik lehfilcon A baharu yang disalut dengan lapisan struktur berus polimer bercabang. Kaedah ini membolehkan penentuan titik sentuhan yang tepat tanpa kesan penyemperitan likat apabila menghampiri polimer bercabang. Di samping itu, ia membolehkan penentuan ciri mekanikal elemen berus individu tanpa kesan keliangan. Ini dicapai dengan memilih prob AFM dengan reka bentuk (saiz hujung, geometri dan kadar spring) yang amat sesuai untuk mengukur sifat bahan lembut dan sampel biologi. Kaedah ini meningkatkan kepekaan dan ketepatan untuk pengukuran tepat bahan yang sangat lembut lehfilcon A, yang mempunyai modulus keanjalan yang sangat rendah pada luas permukaan (sehingga 2 kPa) dan keanjalan yang sangat tinggi dalam persekitaran akueus dalaman (hampir 100%). Keputusan kajian permukaan bukan sahaja mendedahkan sifat permukaan ultra-lembut kanta lehfilcon A, tetapi juga menunjukkan bahawa modulus berus polimer bercabang adalah setanding dengan substrat silikon-hidrogen. Teknik pencirian permukaan ini boleh digunakan pada bahan ultra-lembut dan peranti perubatan yang lain.
Sifat mekanikal bahan yang direka untuk sentuhan langsung dengan tisu hidup selalunya ditentukan oleh persekitaran biologi. Padanan sempurna sifat bahan ini membantu mencapai ciri klinikal bahan yang diingini tanpa menyebabkan tindak balas selular yang buruk1,2,3. Bagi bahan homogen pukal, pencirian sifat mekanikal agak mudah kerana terdapatnya prosedur standard dan kaedah ujian (contohnya, mikrolekukan4,5,6). Walau bagaimanapun, untuk bahan ultra lembut seperti gel, hidrogel, biopolimer, sel hidup, dan sebagainya, kaedah ujian ini secara amnya tidak boleh digunakan disebabkan oleh batasan resolusi pengukuran dan ketidakhomogenan sesetengah bahan7. Selama bertahun-tahun, kaedah lekukan tradisional telah diubah suai dan disesuaikan untuk mencirikan pelbagai jenis bahan lembut, tetapi banyak kaedah masih mengalami kekurangan serius yang mengehadkan penggunaannya8,9,10,11,12,13. Kekurangan kaedah ujian khusus yang boleh mencirikan sifat mekanikal bahan super lembut dan lapisan permukaan dengan tepat dan andal mengehadkan penggunaannya dalam pelbagai aplikasi.
Dalam kajian kami sebelum ini, kami memperkenalkan kanta lekap lehfilcon A (CL), bahan heterogen lembut dengan semua sifat permukaan ultra lembut yang diperoleh daripada reka bentuk biomimetik yang berpotensi diilhamkan oleh permukaan kornea mata. Biobahan ini dibangunkan dengan mencantumkan lapisan polimer bercabang dan bersilang poli(2-metakriloyloksietilfosforilkolina (MPC)) (PMPC) ke atas hidrogel silikon (SiHy) 15 yang direka untuk peranti perubatan berdasarkan. Proses cantuman ini menghasilkan lapisan pada permukaan yang terdiri daripada struktur berus polimer bercabang yang sangat lembut dan sangat elastik. Kajian kami sebelum ini telah mengesahkan bahawa struktur biomimetik lehfilcon A CL memberikan sifat permukaan yang unggul seperti pencegahan pembasahan dan pengotoran yang lebih baik, peningkatan pelinciran, dan pengurangan lekatan sel dan bakteria15,16. Di samping itu, penggunaan dan pembangunan bahan biomimetik ini juga mencadangkan pengembangan selanjutnya kepada peranti bioperubatan lain. Oleh itu, adalah penting untuk mencirikan sifat permukaan bahan ultra lembut ini dan memahami interaksi mekanikalnya dengan mata bagi mewujudkan asas pengetahuan yang komprehensif untuk menyokong perkembangan dan aplikasi masa hadapan. Kebanyakan kanta lekap SiHy yang tersedia secara komersial terdiri daripada campuran homogen polimer hidrofilik dan hidrofobik yang membentuk struktur bahan yang seragam17. Beberapa kajian telah dijalankan untuk mengkaji sifat mekanikalnya menggunakan kaedah ujian mampatan, tegangan dan mikrolekukan tradisional18,19,20,21. Walau bagaimanapun, reka bentuk biomimetik baharu lehfilcon A CL menjadikannya bahan heterogen yang unik di mana sifat mekanikal struktur berus polimer bercabang berbeza dengan ketara daripada substrat asas SiHy. Oleh itu, sangat sukar untuk mengukur sifat-sifat ini dengan tepat menggunakan kaedah konvensional dan lekukan. Kaedah yang menjanjikan menggunakan kaedah ujian nanolekukan yang dilaksanakan dalam mikroskopi daya atom (AFM), kaedah yang telah digunakan untuk menentukan sifat mekanikal bahan viskoelastik lembut seperti sel dan tisu biologi, serta polimer lembut22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. Dalam nanoindentasi AFM, asas-asas pengujian nanoindentasi digabungkan dengan kemajuan terkini dalam teknologi AFM untuk memberikan peningkatan kepekaan pengukuran dan pengujian pelbagai bahan superlembut yang semula jadi31,32,33,34,35,36. Di samping itu, teknologi ini menawarkan kelebihan penting lain melalui penggunaan geometri yang berbeza. indentor dan prob serta kemungkinan pengujian dalam pelbagai media cecair.
Nanoindentasi AFM boleh dibahagikan secara kondisional kepada tiga komponen utama: (1) peralatan (sensor, pengesan, prob, dll.); (2) parameter pengukuran (seperti daya, anjakan, kelajuan, saiz tanjakan, dll.); (3) Pemprosesan data (pembetulan garis dasar, anggaran titik sentuh, pemadanan data, pemodelan, dll.). Satu masalah ketara dengan kaedah ini ialah beberapa kajian dalam literatur yang menggunakan nanoindentasi AFM melaporkan keputusan kuantitatif yang sangat berbeza untuk jenis sampel/sel/bahan yang sama37,38,39,40,41. Contohnya, Lekka et al. Pengaruh geometri prob AFM terhadap modulus Young yang diukur bagi sampel hidrogel homogen mekanikal dan sel heterogen telah dikaji dan dibandingkan. Mereka melaporkan bahawa nilai modulus sangat bergantung pada pemilihan kantilever dan bentuk hujung, dengan nilai tertinggi untuk prob berbentuk piramid dan nilai terendah 42 untuk prob sfera. Begitu juga, Selhuber-Unkel et al. Telah ditunjukkan bagaimana kelajuan indenter, saiz indenter dan ketebalan sampel poliakrilamida (PAAM) mempengaruhi modulus Young yang diukur melalui nanoindentasi ACM43. Faktor lain yang merumitkan ialah kekurangan bahan ujian modulus yang sangat rendah dan prosedur ujian percuma. Ini menjadikannya sangat sukar untuk mendapatkan keputusan yang tepat dengan yakin. Walau bagaimanapun, kaedah ini sangat berguna untuk pengukuran relatif dan penilaian perbandingan antara jenis sampel yang serupa, contohnya menggunakan nanoindentasi AFM untuk membezakan sel normal daripada sel kanser 44, 45.
Semasa menguji bahan lembut dengan nanoindentasi AFM, peraturan umum adalah menggunakan prob dengan pemalar spring rendah (k) yang hampir sepadan dengan modulus sampel dan hujung hemisfera/bulat supaya prob pertama tidak menembusi permukaan sampel pada sentuhan pertama dengan bahan lembut. Adalah juga penting bahawa isyarat pesongan yang dihasilkan oleh prob cukup kuat untuk dikesan oleh sistem pengesan laser24,34,46,47. Dalam kes sel, tisu dan gel heterogen ultra lembut, cabaran lain adalah untuk mengatasi daya pelekat antara prob dan permukaan sampel untuk memastikan pengukuran yang boleh dihasilkan semula dan boleh dipercayai48,49,50. Sehingga baru-baru ini, kebanyakan kerja pada nanoindentasi AFM telah tertumpu pada kajian tingkah laku mekanikal sel, tisu, gel, hidrogel dan biomolekul biologi menggunakan prob sfera yang agak besar, biasanya dirujuk sebagai prob koloid (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Hujung ini mempunyai jejari 1 hingga 50 µm dan biasanya diperbuat daripada kaca borosilikat, polimetil metakrilat (PMMA), polistirena (PS), silikon dioksida (SiO2) dan karbon seperti berlian (DLC). Walaupun nanoindentasi CP-AFM selalunya menjadi pilihan pertama untuk pencirian sampel lembut, ia mempunyai masalah dan batasannya sendiri. Penggunaan hujung sfera bersaiz mikron yang besar meningkatkan jumlah luas sentuhan hujung dengan sampel dan mengakibatkan kehilangan resolusi ruang yang ketara. Untuk spesimen lembut dan tidak homogen, di mana sifat mekanikal unsur tempatan mungkin berbeza dengan ketara daripada purata di kawasan yang lebih luas, indentasi CP boleh menyembunyikan sebarang ketidakhomogenan dalam sifat pada skala tempatan52. Prob koloid biasanya dibuat dengan melekatkan sfera koloid bersaiz mikron pada cantilever tanpa hujung menggunakan pelekat epoksi. Proses pembuatan itu sendiri penuh dengan banyak masalah dan boleh menyebabkan ketidakkonsistenan dalam proses penentukuran prob. Di samping itu, saiz dan jisim zarah koloid secara langsung mempengaruhi parameter penentukuran utama cantilever, seperti frekuensi resonan, kekakuan spring, dan kepekaan pesongan56,57,58. Oleh itu, kaedah yang biasa digunakan untuk prob AFM konvensional, seperti penentukuran suhu, mungkin tidak memberikan penentukuran yang tepat untuk CP, dan kaedah lain mungkin diperlukan untuk melakukan pembetulan ini57, 59, 60, 61. Eksperimen lekukan CP biasa menggunakan sisihan cantilever yang besar untuk mengkaji sifat sampel lembut, yang menimbulkan masalah lain semasa menentukur tingkah laku tak linear cantilever pada sisihan yang agak besar62,63,64. Kaedah lekukan prob koloid moden biasanya mengambil kira geometri cantilever yang digunakan untuk menentukur prob, tetapi mengabaikan pengaruh zarah koloid, yang menimbulkan ketidakpastian tambahan dalam ketepatan kaedah38,61. Begitu juga, moduli elastik yang dikira melalui pemadanan model sentuhan bergantung secara langsung pada geometri prob lekukan, dan ketidakpadanan antara ciri-ciri hujung dan permukaan sampel boleh menyebabkan ketidaktepatan27, 65, 66, 67, 68. Beberapa karya terbaru oleh Spencer et al. Faktor-faktor yang perlu diambil kira semasa mencirikan berus polimer lembut menggunakan kaedah nanoindentasi CP-AFM diserlahkan. Mereka melaporkan bahawa pengekalan cecair likat dalam berus polimer sebagai fungsi kelajuan mengakibatkan peningkatan beban turus dan oleh itu pengukuran sifat yang bergantung kepada kelajuan yang berbeza30,69,70,71.
Dalam kajian ini, kami telah mencirikan modulus permukaan bahan ultra-lembut dan sangat elastik lehfilcon A CL menggunakan kaedah nanoindentasi AFM yang diubah suai. Memandangkan sifat dan struktur baharu bahan ini, julat kepekaan kaedah indentasi tradisional jelas tidak mencukupi untuk mencirikan modulus bahan yang sangat lembut ini, jadi perlu menggunakan kaedah nanoindentasi AFM dengan tahap kepekaan yang lebih tinggi dan kepekaan yang lebih rendah. Selepas mengkaji kekurangan dan masalah teknik nanoindentasi prob koloid AFM sedia ada, kami menunjukkan mengapa kami memilih prob AFM yang lebih kecil dan direka khas untuk menghapuskan kepekaan, hingar latar belakang, menentukan titik sentuhan, mengukur modulus halaju bahan heterogen lembut seperti kebergantungan pengekalan cecair dan kuantifikasi yang tepat. Di samping itu, kami dapat mengukur bentuk dan dimensi hujung indentasi dengan tepat, membolehkan kami menggunakan model padanan kon-sfera untuk menentukan modulus keanjalan tanpa menilai luas sentuhan hujung dengan bahan. Dua andaian tersirat yang diukur dalam kerja ini ialah sifat bahan elastik sepenuhnya dan modulus bebas kedalaman indentasi. Dengan menggunakan kaedah ini, kami mula-mula menguji piawaian ultra lembut dengan modulus yang diketahui untuk mengukur kaedah tersebut, dan kemudian menggunakan kaedah ini untuk mencirikan permukaan dua bahan kanta lekap yang berbeza. Kaedah pencirian permukaan nanoindentasi AFM dengan peningkatan kepekaan ini dijangka boleh digunakan untuk pelbagai bahan ultra lembut heterogen biomimetik dengan potensi penggunaan dalam peranti perubatan dan aplikasi bioperubatan.
Kanta lekap Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, Amerika Syarikat) dan substrat hidrogel silikonnya telah dipilih untuk eksperimen nanoindentasi. Pelekap kanta yang direka khas telah digunakan dalam eksperimen ini. Untuk memasang kanta bagi ujian, ia diletakkan dengan teliti pada penyangga berbentuk kubah, memastikan tiada gelembung udara masuk ke dalam, dan kemudian dipasang dengan tepinya. Lubang pada lekapan di bahagian atas pemegang kanta menyediakan akses ke pusat optik kanta untuk eksperimen nanoindentasi sambil mengekalkan cecair di tempatnya. Ini memastikan kanta terhidrat sepenuhnya. 500 μl larutan pembungkusan kanta lekap telah digunakan sebagai larutan ujian. Untuk mengesahkan keputusan kuantitatif, hidrogel poliakrilamida tidak diaktifkan (PAAM) yang tersedia secara komersial telah disediakan daripada komposisi poliakrilamida-ko-metilena-bisakrilamida (piring Petrisoft Petri 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, Amerika Syarikat), modulus elastik 1 kPa yang diketahui. Gunakan 4-5 titis (kira-kira 125 µl) larutan garam penimbal fosfat (PBS dari Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, Amerika Syarikat) dan 1 titis larutan kanta lekap OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, Amerika Syarikat). ) pada antara muka hidrogel-probe AFM.
Sampel substrat Lehfilcon A CL dan SiHy telah divisualisasikan menggunakan sistem Mikroskop Elektron Pengimbasan Pelepasan Medan FEI Quanta 250 (FEG SEM) yang dilengkapi dengan pengesan Mikroskop Elektron Penghantaran Pengimbasan (STEM). Untuk menyediakan sampel, kanta terlebih dahulu dibasuh dengan air dan dipotong menjadi baji berbentuk pai. Untuk mencapai perbezaan kontras antara komponen hidrofilik dan hidrofobik sampel, larutan RuO4 yang distabilkan 0.10% telah digunakan sebagai pewarna, di mana sampel direndam selama 30 minit. Pewarnaan lehfilcon A CL RuO4 adalah penting bukan sahaja untuk mencapai perbezaan kontras yang lebih baik, tetapi juga membantu memelihara struktur berus polimer bercabang dalam bentuk asalnya, yang kemudiannya boleh dilihat pada imej STEM. Ia kemudiannya dibasuh dan dinyahhidratkan dalam satu siri campuran etanol/air dengan kepekatan etanol yang semakin meningkat. Sampel kemudiannya dituang dengan epoksi EMBed 812/Araldite, yang dikeringkan semalaman pada suhu 70°C. Blok sampel yang diperoleh melalui pempolimeran resin dipotong dengan ultramikrotom, dan bahagian nipis yang terhasil divisualisasikan dengan pengesan STEM dalam mod vakum rendah pada voltan pecutan 30 kV. Sistem SEM yang sama telah digunakan untuk pencirian terperinci prob PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). Imej SEM prob AFM diperoleh dalam mod vakum tinggi biasa dengan voltan pecutan 30 kV. Dapatkan imej pada sudut dan pembesaran yang berbeza untuk merekodkan semua butiran bentuk dan saiz hujung prob AFM. Semua dimensi hujung yang diminati dalam imej diukur secara digital.
Mikroskop daya atom Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) dengan mod “PeakForce QNM dalam Bendalir” telah digunakan untuk memvisualisasikan dan nanoindentat sampel lehfilcon A CL, substrat SiHy dan hidrogel PAAm. Untuk eksperimen pengimejan, prob PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) dengan jejari hujung nominal 1 nm telah digunakan untuk menangkap imej resolusi tinggi sampel pada kadar imbasan 0.50 Hz. Semua imej diambil dalam larutan akueus.
Eksperimen nanoindentasi AFM telah dijalankan menggunakan prob PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Prob AFM mempunyai hujung silikon pada kantilever nitrida setebal 345 nm, panjang 54 µm dan lebar 4.5 µm dengan frekuensi resonan 45 kHz. Ia direka khusus untuk mencirikan dan melakukan pengukuran nanomekanikal kuantitatif pada sampel biologi lembut. Sensor dikalibrasi secara individu di kilang dengan tetapan spring pra-dikalibrasi. Pemalar spring prob yang digunakan dalam kajian ini adalah dalam julat 0.05–0.1 N/m. Untuk menentukan bentuk dan saiz hujung dengan tepat, prob dicirikan secara terperinci menggunakan SEM. Pada rajah 1a menunjukkan mikrograf elektron pengimbasan resolusi tinggi dan pembesaran rendah prob PFQNM-LC-A-CAL, memberikan pandangan holistik reka bentuk prob. Pada rajah 1b menunjukkan pandangan yang diperbesarkan pada bahagian atas hujung prob, memberikan maklumat tentang bentuk dan saiz hujung. Pada hujung yang paling hujung, jarum tersebut merupakan hemisfera berdiameter kira-kira 140 nm (Rajah 1c). Di bawahnya, hujungnya meruncing menjadi bentuk kon, mencapai panjang yang diukur kira-kira 500 nm. Di luar kawasan meruncing, hujungnya berbentuk silinder dan berakhir dengan jumlah panjang hujung 1.18 µm. Ini adalah bahagian berfungsi utama hujung prob. Di samping itu, prob polistirena sfera (PS) yang besar (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, Amerika Syarikat) dengan diameter hujung 45 µm dan pemalar pegas 2 N/m juga digunakan untuk ujian sebagai prob koloid. dengan prob PFQNM-LC-A-CAL 140 nm untuk perbandingan.
Telah dilaporkan bahawa cecair boleh terperangkap di antara prob AFM dan struktur berus polimer semasa nanoindentasi, yang akan mengenakan daya ke atas pada prob AFM sebelum ia benar-benar menyentuh permukaan69. Kesan penyemperitan likat ini akibat pengekalan cecair boleh mengubah titik sentuhan ketara, sekali gus mempengaruhi pengukuran modulus permukaan. Untuk mengkaji kesan geometri prob dan kelajuan lekukan pada pengekalan cecair, lengkung daya lekukan telah diplotkan untuk sampel lehfilcon A CL menggunakan prob berdiameter 140 nm pada kadar anjakan malar 1 µm/s dan 2 µm/s. Diameter prob 45 µm, tetapan daya tetap 6 nN dicapai pada 1 µm/s. Eksperimen dengan prob berdiameter 140 nm telah dijalankan pada kelajuan lekukan 1 µm/s dan daya tetap 300 pN, dipilih untuk mencipta tekanan sentuhan dalam julat fisiologi (1–8 kPa) kelopak mata atas. tekanan 72. Sampel hidrogel PAA yang lembut dan sedia dibuat dengan tekanan 1 kPa telah diuji untuk daya lekukan 50 pN pada kelajuan 1 μm/s menggunakan prob dengan diameter 140 nm.
Oleh kerana panjang bahagian kon hujung prob PFQNM-LC-A-CAL adalah lebih kurang 500 nm, untuk sebarang kedalaman lekukan < 500 nm, boleh diandaikan dengan selamat bahawa geometri prob semasa lekukan akan kekal sejajar dengan bentuk konnya. Di samping itu, diandaikan bahawa permukaan bahan yang diuji akan menunjukkan tindak balas elastik boleh balik, yang juga akan disahkan dalam bahagian berikut. Oleh itu, bergantung pada bentuk dan saiz hujung, kami memilih model pemadanan kon-sfera yang dibangunkan oleh Briscoe, Sebastian dan Adams, yang tersedia dalam perisian vendor, untuk memproses eksperimen nanoindentasi AFM kami (NanoScope). Perisian analisis data pemisahan, Bruker) 73. Model tersebut menerangkan hubungan daya-anjakan F(δ) untuk kon dengan kecacatan puncak sfera. Pada rajah. Rajah 2 menunjukkan geometri sentuhan semasa interaksi kon tegar dengan hujung sfera, di mana R ialah jejari hujung sfera, a ialah jejari sentuhan, b ialah jejari sentuhan pada hujung hujung sfera, δ ialah jejari sentuhan. kedalaman lekukan, θ ialah separuh sudut kon. Imej SEM prob ini dengan jelas menunjukkan bahawa hujung sfera berdiameter 140 nm bergabung secara tangensial ke dalam kon, jadi di sini b ditakrifkan hanya melalui R, iaitu b = R cos θ. Perisian yang dibekalkan oleh vendor menyediakan hubungan kon-sfera untuk mengira nilai modulus Young (E) daripada data pemisahan daya dengan mengandaikan a > b. Hubungan:
di mana F ialah daya lekukan, E ialah modulus Young, ν ialah nisbah Poisson. Jejari sentuhan a boleh dianggarkan menggunakan:
Skema geometri sentuhan kon tegar dengan hujung sfera yang ditekan ke dalam bahan kanta lekap Lefilcon dengan lapisan permukaan berus polimer bercabang.
Jika a ≤ b, hubungan tersebut akan berkurangan kepada persamaan untuk indentor sfera konvensional;
Kami percaya bahawa interaksi prob inden dengan struktur bercabang berus polimer PMPC akan menyebabkan jejari sentuhan a menjadi lebih besar daripada jejari sentuhan sfera b. Oleh itu, untuk semua ukuran kuantitatif modulus elastik yang dilakukan dalam kajian ini, kami menggunakan pergantungan yang diperoleh untuk kes a > b.
Bahan biomimetik ultralembut yang dikaji dalam kajian ini telah diimejkan secara komprehensif menggunakan mikroskopi elektron penghantaran pengimbasan (STEM) bagi keratan rentas sampel dan mikroskopi daya atom (AFM) permukaan. Pencirian permukaan terperinci ini dilakukan sebagai lanjutan daripada kerja kami yang diterbitkan sebelum ini, di mana kami menentukan bahawa struktur berus polimer bercabang secara dinamik bagi permukaan lehfilcon A CL yang diubah suai PMPC mempamerkan sifat mekanikal yang serupa dengan tisu kornea asli 14. Atas sebab ini, kami merujuk kepada permukaan kanta lekap sebagai bahan biomimetik 14. Pada rajah 3a, b, tunjukkan keratan rentas struktur berus polimer PMPC bercabang pada permukaan substrat lehfilcon A CL dan substrat SiHy yang tidak dirawat. Permukaan kedua-dua sampel dianalisis selanjutnya menggunakan imej AFM resolusi tinggi, yang seterusnya mengesahkan keputusan analisis STEM (Rajah 3c, d). Secara keseluruhan, imej-imej ini memberikan anggaran panjang struktur berus polimer bercabang PMPC pada 300–400 nm, yang penting untuk mentafsir ukuran nanoindentasi AFM. Satu lagi pemerhatian utama yang diperoleh daripada imej tersebut ialah struktur permukaan keseluruhan bahan biomimetik CL berbeza secara morfologi daripada bahan substrat SiHy. Perbezaan dalam morfologi permukaannya ini boleh menjadi jelas semasa interaksi mekanikalnya dengan prob AFM yang mengesot dan seterusnya dalam nilai modulus yang diukur.
Imej STEM keratan rentas bagi (a) lehfilcon A CL dan (b) substrat SiHy. Bar skala, 500 nm. Imej AFM bagi permukaan substrat lehfilcon A CL (c) dan substrat SiHy asas (d) (3 µm × 3 µm).
Polimer dan struktur berus polimer yang diinspirasikan oleh bio sememangnya lembut dan telah dikaji secara meluas serta digunakan dalam pelbagai aplikasi bioperubatan74,75,76,77. Oleh itu, adalah penting untuk menggunakan kaedah nanoindentasi AFM, yang boleh mengukur sifat mekanikalnya dengan tepat dan andal. Tetapi pada masa yang sama, sifat unik bahan ultra lembut ini, seperti modulus elastik yang sangat rendah, kandungan cecair yang tinggi dan keanjalan yang tinggi, sering menyukarkan untuk memilih bahan, bentuk dan saiz prob inden yang betul. Ini penting supaya indentor tidak menembusi permukaan lembut sampel, yang akan menyebabkan ralat dalam menentukan titik sentuhan dengan permukaan dan kawasan sentuhan.
Untuk ini, pemahaman yang komprehensif tentang morfologi bahan biomimetik ultra lembut (lehfilcon A CL) adalah penting. Maklumat tentang saiz dan struktur berus polimer bercabang yang diperoleh menggunakan kaedah pengimejan menyediakan asas untuk pencirian mekanikal permukaan menggunakan teknik nanoindentasi AFM. Daripada prob koloid sfera bersaiz mikron, kami memilih prob silikon nitrida PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) dengan diameter hujung 140 nm, yang direka khas untuk pemetaan kuantitatif sifat mekanikal sampel biologi 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 Rasional untuk menggunakan prob yang agak tajam berbanding prob koloid konvensional boleh dijelaskan oleh ciri-ciri struktur bahan. Membandingkan saiz hujung prob (~140 nm) dengan berus polimer bercabang pada permukaan CL lehfilcon A, yang ditunjukkan dalam Rajah 3a, dapat disimpulkan bahawa hujungnya cukup besar untuk bersentuhan langsung dengan struktur berus ini, yang mengurangkan kemungkinan hujung menembusinya. Untuk menggambarkan perkara ini, dalam Rajah 4 ialah imej STEM lehfilcon A CL dan hujung lekukan prob AFM (dilukis mengikut skala).
Skematik menunjukkan imej STEM lehfilcon A CL dan prob lekukan ACM (dilukis mengikut skala).
Di samping itu, saiz hujung 140 nm adalah cukup kecil untuk mengelakkan risiko sebarang kesan penyemperitan melekit yang dilaporkan sebelum ini untuk berus polimer yang dihasilkan oleh kaedah nanoindentasi CP-AFM69,71. Kami menganggap bahawa disebabkan oleh bentuk kon-sfera khas dan saiz hujung AFM ini yang agak kecil (Rajah 1), sifat lengkung daya yang dihasilkan oleh nanoindentasi lehfilcon A CL tidak akan bergantung pada kelajuan indentasi atau kelajuan pemuatan/pemunggahan. Oleh itu, ia tidak terjejas oleh kesan poroelastik. Untuk menguji hipotesis ini, sampel lehfilcon A CL diinden pada daya maksimum tetap menggunakan prob PFQNM-LC-A-CAL, tetapi pada dua halaju yang berbeza, dan lengkung daya tegangan dan tarik balik yang terhasil digunakan untuk memplot daya (nN) dalam pemisahan (µm) seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5a. Jelas bahawa lengkung daya semasa pemuatan dan pemunggahan bertindih sepenuhnya, dan tiada bukti jelas bahawa ricih daya pada kedalaman lekukan sifar meningkat dengan kelajuan lekukan dalam rajah tersebut, menunjukkan bahawa elemen berus individu dicirikan tanpa kesan poroelastik. Sebaliknya, kesan pengekalan bendalir (kesan penyemperitan likat dan poroelastik) jelas untuk prob AFM berdiameter 45 µm pada kelajuan lekukan yang sama dan diserlahkan oleh histeresis antara lengkung regangan dan penarikan balik, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5b. Keputusan ini menyokong hipotesis dan mencadangkan bahawa prob berdiameter 140 nm adalah pilihan yang baik untuk mencirikan permukaan lembut sedemikian.
lengkung daya lekukan lehfilcon A CL menggunakan ACM; (a) menggunakan prob dengan diameter 140 nm pada dua kadar pemuatan, menunjukkan ketiadaan kesan poroelastik semasa lekukan permukaan; (b) menggunakan prob dengan diameter 45 µm dan 140 nm. s menunjukkan kesan penyemperitan likat dan poroelastik untuk prob yang besar berbanding prob yang lebih kecil.
Untuk mencirikan permukaan ultralembut, kaedah nanoindentasi AFM mesti mempunyai prob terbaik untuk mengkaji sifat-sifat bahan yang dikaji. Selain bentuk dan saiz hujung, sensitiviti sistem pengesan AFM, sensitiviti terhadap pesongan hujung dalam persekitaran ujian, dan kekakuan cantilever memainkan peranan penting dalam menentukan ketepatan dan kebolehpercayaan pengukuran nanoindentasi. Bagi sistem AFM kami, had pengesanan Pengesan Sensitif Kedudukan (PSD) adalah lebih kurang 0.5 mV dan berdasarkan kadar spring pra-kalibrasi dan sensitiviti pesongan bendalir yang dikira bagi prob PFQNM-LC-A-CAL, yang sepadan dengan sensitiviti beban teori. adalah kurang daripada 0.1 pN. Oleh itu, kaedah ini membolehkan pengukuran daya indentasi minimum ≤ 0.1 pN tanpa sebarang komponen hingar periferi. Walau bagaimanapun, hampir mustahil bagi sistem AFM untuk mengurangkan hingar periferi ke tahap ini disebabkan oleh faktor-faktor seperti getaran mekanikal dan dinamik bendalir. Faktor-faktor ini mengehadkan kepekaan keseluruhan kaedah nanoindentasi AFM dan juga menghasilkan isyarat hingar latar belakang kira-kira ≤ 10 pN. Untuk pencirian permukaan, sampel substrat lehfilcon A CL dan SiHy telah diinden di bawah keadaan terhidrat sepenuhnya menggunakan prob 140 nm untuk pencirian SEM, dan lengkung daya yang terhasil telah ditumpangkan antara daya (pN) dan tekanan. Plot pemisahan (µm) ditunjukkan dalam Rajah 6a. Berbanding dengan substrat asas SiHy, lengkung daya lehfilcon A CL dengan jelas menunjukkan fasa peralihan bermula pada titik sentuhan dengan berus polimer bercabang dan berakhir dengan perubahan mendadak dalam sentuhan penanda cerun hujung dengan bahan asas. Bahagian peralihan lengkung daya ini menonjolkan kelakuan elastik berus polimer bercabang pada permukaan, seperti yang dibuktikan oleh lengkung mampatan yang mengikuti lengkung tegangan dan kontras dalam sifat mekanikal antara struktur berus dan bahan SiHy yang besar. Apabila membandingkan lefilcon. Pemisahan purata panjang berus polimer bercabang dalam imej STEM PCS (Rajah 3a) dan lengkung dayanya di sepanjang absis dalam Rajah 3a. 6a menunjukkan bahawa kaedah ini dapat mengesan hujung dan polimer bercabang yang mencapai bahagian paling atas permukaan. Sentuhan antara struktur berus. Di samping itu, pertindihan lengkung daya yang rapat menunjukkan tiada kesan pengekalan cecair. Dalam kes ini, langsung tiada lekatan antara jarum dan permukaan sampel. Bahagian paling atas lengkung daya untuk kedua-dua sampel bertindih, mencerminkan persamaan sifat mekanikal bahan substrat.
(a) Lengkung daya nanoindentasi AFM untuk substrat lehfilcon A CL dan substrat SiHy, (b) lengkung daya yang menunjukkan anggaran titik sentuhan menggunakan kaedah ambang hingar latar belakang.
Untuk mengkaji butiran lengkung daya yang lebih halus, lengkung tegangan sampel lehfilcon A CL diplotkan semula dalam Rajah 6b dengan daya maksimum 50 pN di sepanjang paksi-y. Graf ini memberikan maklumat penting tentang hingar latar belakang asal. Hilang bunyi berada dalam julat ±10 pN, yang digunakan untuk menentukan titik sentuhan dengan tepat dan mengira kedalaman lekukan. Seperti yang dilaporkan dalam literatur, pengenalpastian titik sentuhan adalah penting untuk menilai sifat bahan seperti modulus85 dengan tepat. Pendekatan yang melibatkan pemprosesan automatik data lengkung daya telah menunjukkan kesesuaian yang lebih baik antara kesesuaian data dan pengukuran kuantitatif untuk bahan lembut86. Dalam kajian ini, pilihan titik sentuhan kami agak mudah dan objektif, tetapi ia mempunyai batasannya. Pendekatan konservatif kami untuk menentukan titik sentuhan mungkin mengakibatkan nilai modulus yang sedikit terlalu tinggi untuk kedalaman lekukan yang lebih kecil (< 100 nm). Penggunaan pengesanan titik sentuhan berasaskan algoritma dan pemprosesan data automatik boleh menjadi kesinambungan kajian ini pada masa hadapan untuk menambah baik lagi kaedah kami. Oleh itu, untuk hingar latar belakang intrinsik pada peringkat ±10 pN, kami mentakrifkan titik sentuhan sebagai titik data pertama pada paksi-x dalam Rajah 6b dengan nilai ≥10 pN. Kemudian, selaras dengan ambang hingar 10 pN, garis menegak pada aras ~0.27 µm menandakan titik sentuhan dengan permukaan, selepas itu lengkung regangan berterusan sehingga substrat memenuhi kedalaman lekukan ~270 nm. Menariknya, berdasarkan saiz ciri berus polimer bercabang (300–400 nm) yang diukur menggunakan kaedah pengimejan, kedalaman lekukan CL lehfilcon. Sampel yang diperhatikan menggunakan kaedah ambang hingar latar belakang adalah kira-kira 270 nm, yang sangat hampir dengan saiz pengukuran dengan STEM. Keputusan ini seterusnya mengesahkan keserasian dan kebolehgunaan bentuk dan saiz hujung prob AFM untuk lekukan struktur berus polimer bercabang yang sangat lembut dan sangat elastik ini. Data ini juga memberikan bukti kukuh untuk menyokong kaedah kami menggunakan hingar latar belakang sebagai ambang untuk menentukan titik sentuhan. Oleh itu, sebarang keputusan kuantitatif yang diperoleh daripada pemodelan matematik dan pemadanan lengkung daya hendaklah agak tepat.
Pengukuran kuantitatif melalui kaedah nanoindentasi AFM bergantung sepenuhnya pada model matematik yang digunakan untuk pemilihan data dan analisis seterusnya. Oleh itu, adalah penting untuk mempertimbangkan semua faktor yang berkaitan dengan pilihan indentor, sifat bahan dan mekanik interaksinya sebelum memilih model tertentu. Dalam kes ini, geometri hujung dicirikan dengan teliti menggunakan mikrograf SEM (Rajah 1), dan berdasarkan keputusan, prob nanoindentasi AFM berdiameter 140 nm dengan kon keras dan geometri hujung sfera adalah pilihan yang baik untuk mencirikan sampel lehfilcon A CL79. Satu lagi faktor penting yang perlu dinilai dengan teliti ialah keanjalan bahan polimer yang diuji. Walaupun data awal nanoindentasi (Rajah 5a dan 6a) menggariskan dengan jelas ciri-ciri pertindihan lengkung tegangan dan mampatan, iaitu pemulihan elastik bahan yang lengkap, adalah sangat penting untuk mengesahkan sifat elastik semata-mata bagi sentuhan tersebut. Untuk tujuan ini, dua lekukan berturut-turut telah dilakukan di lokasi yang sama pada permukaan sampel lehfilcon A CL pada kadar lekukan 1 µm/s di bawah keadaan penghidratan penuh. Data lengkung daya yang terhasil ditunjukkan dalam rajah 7 dan, seperti yang dijangkakan, lengkung pengembangan dan mampatan kedua-dua cetakan hampir sama, menonjolkan keanjalan tinggi struktur berus polimer bercabang.
Dua lengkung daya lekukan pada lokasi yang sama pada permukaan lehfilcon. A CL menunjukkan keanjalan ideal permukaan kanta.
Berdasarkan maklumat yang diperoleh daripada imej SEM dan STEM bagi hujung prob dan permukaan lehfilcon A CL, masing-masing, model kon-sfera merupakan perwakilan matematik yang munasabah bagi interaksi antara hujung prob AFM dan bahan polimer lembut yang sedang diuji. Di samping itu, bagi model kon-sfera ini, andaian asas tentang sifat elastik bahan yang dicetak adalah benar untuk bahan biomimetik baharu ini dan digunakan untuk mengukur modulus elastik.
Selepas penilaian komprehensif terhadap kaedah nanoindentasi AFM dan komponennya, termasuk sifat prob indentasi (bentuk, saiz dan kekakuan spring), kepekaan (bunyi latar belakang dan anggaran titik sentuhan), dan model pemadanan data (pengukuran modulus kuantitatif), kaedah tersebut telah digunakan. Mencirikan sampel ultra-lembut yang tersedia secara komersial untuk mengesahkan keputusan kuantitatif. Hidrogel poliakrilamida komersial (PAAM) dengan modulus elastik 1 kPa telah diuji di bawah keadaan terhidrat menggunakan prob 140 nm. Butiran ujian dan pengiraan modul disediakan dalam Maklumat Tambahan. Keputusan menunjukkan bahawa purata modulus yang diukur ialah 0.92 kPa, dan %RSD dan sisihan peratusan (%) daripada modulus yang diketahui adalah kurang daripada 10%. Keputusan ini mengesahkan ketepatan dan kebolehulangan kaedah nanoindentasi AFM yang digunakan dalam kerja ini untuk mengukur moduli bahan ultralembut. Permukaan sampel lehfilcon A CL dan substrat asas SiHy dicirikan selanjutnya menggunakan kaedah nanoindentasi AFM yang sama untuk mengkaji modulus sentuhan ketara permukaan ultralembut sebagai fungsi kedalaman lekukan. Lengkung pemisahan daya indentasi dijana untuk tiga spesimen setiap jenis (n = 3; satu lekukan setiap spesimen) pada daya 300 pN, kelajuan 1 µm/s, dan penghidratan penuh. Lengkung perkongsian daya indentasi dianggarkan menggunakan model kon-sfera. Untuk mendapatkan modulus yang bergantung pada kedalaman lekukan, bahagian lengkung daya selebar 40 nm ditetapkan pada setiap kenaikan 20 nm bermula dari titik sentuhan, dan mengukur nilai modulus pada setiap langkah lengkung daya. Spin Cy et al. Pendekatan yang serupa telah digunakan untuk mencirikan kecerunan modulus berus polimer poli(lauril metakrilat) (P12MA) menggunakan nanoindentasi prob koloid AFM, dan ia konsisten dengan data menggunakan model sentuhan Hertz. Pendekatan ini menyediakan plot modulus sentuhan ketara (kPa) berbanding kedalaman lekukan (nm), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8, yang menggambarkan kecerunan modulus/kedalaman sentuhan ketara. Modulus elastik yang dikira bagi sampel CL lehfilcon A adalah dalam julat 2–3 kPa dalam 100 nm atas sampel, di luarnya ia mula meningkat dengan kedalaman. Sebaliknya, apabila menguji substrat asas SiHy tanpa filem seperti berus pada permukaan, kedalaman lekukan maksimum yang dicapai pada daya 300 pN adalah kurang daripada 50 nm, dan nilai modulus yang diperoleh daripada data adalah kira-kira 400 kPa, yang setanding dengan nilai modulus Young untuk bahan pukal.
Modulus sentuhan ketara (kPa) vs. kedalaman lekukan (nm) untuk substrat lehfilcon A CL dan SiHy menggunakan kaedah nanolekukan AFM dengan geometri kon-sfera untuk mengukur modulus.
Permukaan paling atas bagi struktur berus polimer bercabang biomimetik baharu mempamerkan modulus keanjalan yang sangat rendah (2–3 kPa). Ini akan sepadan dengan hujung gantung bebas berus polimer bercabang seperti yang ditunjukkan dalam imej STEM. Walaupun terdapat beberapa bukti kecerunan modulus di pinggir luar CL, substrat modulus tinggi utama lebih berpengaruh. Walau bagaimanapun, 100 nm atas permukaan berada dalam lingkungan 20% daripada jumlah panjang berus polimer bercabang, jadi adalah munasabah untuk mengandaikan bahawa nilai modulus yang diukur dalam julat kedalaman lekukan ini agak tepat dan tidak bergantung sepenuhnya pada kesan objek bawah.
Disebabkan reka bentuk biomimetik unik kanta lekap lehfilcon A, yang terdiri daripada struktur berus polimer PMPC bercabang yang dicantumkan pada permukaan substrat SiHy, adalah sangat sukar untuk mencirikan sifat mekanikal struktur permukaannya dengan andal menggunakan kaedah pengukuran tradisional. Di sini kami membentangkan kaedah nanoindentasi AFM yang canggih untuk mencirikan bahan ultra lembut seperti lefilcon A dengan kandungan air yang tinggi dan keanjalan yang sangat tinggi. Kaedah ini adalah berdasarkan penggunaan prob AFM yang saiz hujung dan geometrinya dipilih dengan teliti untuk dipadankan dengan dimensi struktur ciri permukaan ultra lembut yang akan dicetak. Gabungan dimensi antara prob dan struktur ini memberikan peningkatan kepekaan, membolehkan kita mengukur modulus rendah dan sifat elastik yang wujud pada elemen berus polimer bercabang, tanpa mengira kesan poroelastik. Keputusan menunjukkan bahawa berus polimer PMPC bercabang unik yang menjadi ciri permukaan kanta mempunyai modulus elastik yang sangat rendah (sehingga 2 kPa) dan keanjalan yang sangat tinggi (hampir 100%) apabila diuji dalam persekitaran akueus. Keputusan nanoindentasi AFM juga membolehkan kami mencirikan modulus sentuhan ketara/kecerunan kedalaman (30 kPa/200 nm) permukaan kanta biomimetik. Kecerunan ini mungkin disebabkan oleh perbezaan modulus antara berus polimer bercabang dan substrat SiHy, atau struktur/ketumpatan berus polimer bercabang, atau gabungannya. Walau bagaimanapun, kajian mendalam selanjutnya diperlukan untuk memahami sepenuhnya hubungan antara struktur dan sifat, terutamanya kesan percabangan berus pada sifat mekanikal. Pengukuran yang serupa boleh membantu mencirikan sifat mekanikal permukaan bahan ultra lembut dan peranti perubatan yang lain.
Set data yang dijana dan/atau dianalisis semasa kajian semasa boleh didapati daripada penulis masing-masing atas permintaan yang munasabah.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. dan Haugen, HJ Tindak balas biologi terhadap sifat fizikal dan kimia permukaan biobahan. Masyarakat kimia. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM dan Liu, X. Penambahbaikan biobahan terbitan manusia untuk kejuruteraan tisu. pengaturcaraan. polimer. sains. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Reka bentuk, pelaksanaan klinikal dan tindak balas imun biobahan dalam perubatan regeneratif. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK dan Farr GM Kaedah yang dipertingkatkan untuk menentukan kekerasan dan modulus elastik menggunakan eksperimen lekukan dengan ukuran beban dan anjakan. J. Alma mater. tangki simpanan. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Asal usul sejarah ujian kekerasan lekukan. alma mater. sains. teknologi. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Pengukuran Kekerasan Lekukan pada Skala Makro, Mikro dan Nano: Satu Kajian Kritikal. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD dan Clapperich, SM Ralat pengesanan permukaan menyebabkan anggaran modulus yang berlebihan dalam nanoindentasi bahan lembut. J. Mecha. Tingkah Laku. Sains Bioperubatan. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR dan Yahya M.Yu. Penilaian kaedah nanoindentasi untuk menentukan ciri-ciri mekanikal nanokomposit heterogen menggunakan kaedah eksperimen dan pengiraan. sains. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, dan Owart, TS Pencirian mekanikal gel viskoelastik lembut melalui lekukan dan analisis unsur terhingga songsang berasaskan pengoptimuman. J. Mecha. Tingkah Laku. Sains Bioperubatan. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J dan Chaneler D. Pengoptimuman penentuan viskoelastik menggunakan sistem pengukuran yang serasi. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. dan Pellillo, E. Nanoindentasi permukaan polimer. J. Fizik. D. Memohon untuk fizik. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. dan Van Vliet KJ Pencirian sifat mekanikal viskoelastik polimer dan tisu biologi yang sangat elastik menggunakan lekukan hentakan. Jurnal Biobahan. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Penilaian modulus elastik dan kerja lekatan bahan lembut menggunakan kaedah Borodich-Galanov (BG) lanjutan dan lekukan dalam. bulu. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. dkk. Morfologi nanoskala dan sifat mekanikal permukaan polimer biomimetik kanta lekap hidrogel silikon. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).