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의료 기기 및 생체 의학 응용 분야를 위한 새로운 초연성 소재의 개발에 따라, 그 물리적 및 기계적 특성을 종합적으로 분석하는 것은 중요하면서도 어려운 과제입니다. 변형된 원자간력 현미경(AFM) 나노압입 기술을 적용하여 가지형 폴리머 브러시 구조 층으로 코팅된 새로운 생체모방 실리콘 하이드로겔 콘택트 렌즈인 레필콘 A의 매우 낮은 표면 탄성률을 분석했습니다. 이 방법을 사용하면 가지형 폴리머에 접근할 때 점성 압출의 영향 없이 접촉점을 정확하게 측정할 수 있습니다. 또한, 다공성 탄성의 영향 없이 개별 브러시 요소의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 이는 연성 소재 및 생물학적 샘플의 특성 측정에 특히 적합한 설계(팁 크기, 형상 및 스프링 속도)를 갖춘 AFM 프로브를 선택함으로써 달성됩니다. 이 방법은 표면적의 탄성률이 매우 낮고(최대 2kPa) 내부(거의 100%) 수성 환경에서 매우 높은 탄성률을 갖는 매우 연성 소재인 레필콘 A의 정확한 측정을 위한 감도와 정확도를 향상시킵니다. 표면 연구 결과는 레필콘 A 렌즈의 초연성 표면 특성을 밝혀냈을 뿐만 아니라, 분지형 폴리머 브러시의 탄성 계수가 실리콘-수소 기판의 탄성 계수와 유사함을 보여주었습니다. 이 표면 특성 분석 기술은 다른 초연성 소재 및 의료 기기에도 적용될 수 있습니다.
생체 조직과 직접 접촉하도록 설계된 재료의 기계적 특성은 종종 생물학적 환경에 의해 결정됩니다. 이러한 재료 특성의 완벽한 조화는 세포에 부정적인 반응을 일으키지 않으면서 재료의 원하는 임상적 특성을 얻는 데 도움이 됩니다.1,2,3 벌크 균질 재료의 경우, 표준 절차 및 시험 방법(예: 미세 압입)을 이용할 수 있어 기계적 특성 분석이 비교적 쉽습니다.4,5,6 그러나 겔, 하이드로겔, 생체고분자, 생체 세포 등과 같은 초연성 재료의 경우, 측정 분해능의 한계와 일부 재료의 불균일성으로 인해 이러한 시험 방법은 일반적으로 적용할 수 없습니다.7 수년에 걸쳐 전통적인 압입 방법은 다양한 연성 재료의 특성을 분석하기 위해 수정 및 적용되었지만, 여전히 많은 방법이 그 사용을 제한하는 심각한 단점을 안고 있습니다.8,9,10,11,12,13 초연성 재료 및 표면층의 기계적 특성을 정확하고 신뢰성 있게 분석할 수 있는 전문 시험 방법이 부족하여 다양한 응용 분야에서의 사용이 심각하게 제한됩니다.
이전 연구에서는 눈의 각막 표면에서 영감을 받은 생체모방적 설계에서 파생된 초연성 표면 특성을 모두 갖춘 연성 이종 소재인 레필콘 A(CL) 콘택트렌즈를 소개했습니다. 이 생체재료는 의료기기용으로 설계된 실리콘 하이드로겔(SiHy)15에 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(MPC))(PMPC)의 분지형 가교 고분자 층을 접목하여 개발되었습니다. 이 접목 공정은 표면에 매우 부드럽고 탄성이 높은 분지형 고분자 브러시 구조로 구성된 층을 생성합니다. 이전 연구에서는 레필콘 A CL의 생체모방 구조가 습윤 및 오염 방지 개선, 윤활성 증가, 세포 및 박테리아 부착 감소15,16와 같은 우수한 표면 특성을 제공한다는 것을 확인했습니다. 또한, 이 생체모방 소재의 사용 및 개발은 다른 생체의학 기기로의 추가 확장을 시사합니다. 따라서 이 초연성 소재의 표면 특성을 분석하고 눈과의 기계적 상호작용을 이해하는 것은 향후 개발 및 응용 분야를 뒷받침할 포괄적인 지식 기반을 구축하는 데 매우 중요합니다. 시중에서 판매되는 대부분의 SiHy 콘택트렌즈는 균일한 재료 구조를 형성하는 친수성 및 소수성 고분자의 균질 혼합물로 구성됩니다.17 기존의 압축, 인장 및 미세압입 시험법을 사용하여 기계적 특성을 조사하기 위한 여러 연구가 수행되었습니다.18,19,20,21 그러나 레필콘 A CL의 새로운 생체모방 설계는 분지형 고분자 브러시 구조의 기계적 특성이 SiHy 기재의 기계적 특성과 크게 다른 독특한 이종 소재를 만들어냅니다. 따라서 기존의 압입 시험법을 사용하여 이러한 특성을 정확하게 정량화하는 것은 매우 어렵습니다. 유망한 방법 중 하나는 원자간력현미경(AFM)에 구현된 나노인덴테이션 시험법을 사용하는 것입니다. 이 방법은 생물학적 세포 및 조직과 같은 연성 점탄성 재료와 연성 폴리머의 기계적 특성을 측정하는 데 사용되어 왔습니다22,23,24,25.,26,27,28,29,30. AFM 나노인덴테이션 시험에서는 나노인덴테이션 시험의 기본 원리와 최신 AFM 기술을 결합하여 측정 감도를 높이고 다양한 초연성 재료의 시험을 지원합니다31,32,33,34,35,36. 또한, 이 기술은 다양한 형상의 압입자와 프로브를 사용하고 다양한 액체 매질에서 시험할 수 있다는 점에서 다른 중요한 장점들을 제공합니다.
AFM 나노인덴테이션은 조건부로 세 가지 주요 구성 요소로 나눌 수 있습니다.(1) 장비(센서, 검출기, 프로브 등); (2) 측정 매개변수(힘, 변위, 속도, 램프 크기 등); (3) 데이터 처리(기준선 수정, 터치 포인트 추정, 데이터 피팅, 모델링 등). 이 방법의 중요한 문제점은 AFM 나노인덴테이션을 사용하는 문헌의 여러 연구에서 동일한 샘플/셀/재료 유형에 대해 매우 다른 정량적 결과를 보고한다는 것입니다37,38,39,40,41. 예를 들어, Lekka et al. 기계적으로 균질한 하이드로젤과 이질적인 세포의 샘플에서 측정된 영률에 대한 AFM 프로브 기하학의 영향을 연구하고 비교했습니다. 그들은 계수 값이 캔틸레버 선택과 팁 모양에 크게 의존하며 피라미드 모양 프로브의 경우 가장 높은 값, 구형 프로브의 경우 가장 낮은 값인 42라고 보고했습니다. 마찬가지로, Selhuber-Unkel et al. 폴리아크릴아미드(PAAM) 시료의 압입자 속도, 압입자 크기, 그리고 두께가 ACM43 나노압입법으로 측정한 영률에 어떤 영향을 미치는지 밝혀졌습니다. 또 다른 복잡한 요인은 표준 극저탄성률 시험 재료와 무료 시험 절차가 부족하다는 것입니다. 이로 인해 정확한 결과를 확신 있게 얻기가 매우 어렵습니다. 그러나 이 방법은 유사한 시료 유형 간의 상대적 측정 및 비교 평가에 매우 유용합니다. 예를 들어, AFM 나노압입법을 사용하여 정상 세포와 암 세포를 구별할 수 있습니다.44, 45
AFM 나노인덴테이션으로 연성 재료를 시험할 때, 일반적인 경험 법칙은 샘플 탄성계수와 거의 일치하는 낮은 스프링 상수(k)를 가진 프로브와 반구형/둥근 팁을 사용하여 첫 번째 프로브가 연성 재료와 처음 접촉할 때 샘플 표면을 뚫지 않도록 하는 것입니다. 또한 프로브에서 생성되는 편향 신호가 레이저 검출기 시스템24,34,46,47에서 감지될 수 있을 만큼 충분히 강한 것도 중요합니다. 초연성 이질 세포, 조직 및 젤의 경우, 또 다른 과제는 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 측정을 보장하기 위해 프로브와 샘플 표면 사이의 접착력을 극복하는 것입니다48,49,50. 최근까지 AFM 나노인덴테이션에 대한 대부분의 연구는 일반적으로 콜로이드 프로브(CP)라고 하는 비교적 큰 구형 프로브를 사용하여 생물학적 세포, 조직, 젤, 하이드로젤 및 생체 분자의 기계적 거동을 연구하는 데 집중되어 왔습니다. , 47, 51, 52, 53, 54, 55. 이러한 팁은 반경이 1~50µm이며 일반적으로 붕규산 유리, 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA), 폴리스티렌(PS), 이산화규소(SiO2) 및 다이아몬드 유사 탄소(DLC)로 만들어집니다. CP-AFM 나노압입은 종종 연성 샘플 특성화를 위한 첫 번째 선택이지만 고유한 문제와 한계가 있습니다. 마이크론 크기의 큰 구형 팁을 사용하면 팁과 샘플의 총 접촉 면적이 증가하고 공간 분해능이 크게 손실됩니다. 국소 요소의 기계적 특성이 더 넓은 영역에서 평균과 크게 다를 수 있는 연성 불균일 시편의 경우 CP 압입을 통해 국소적 규모의 특성 불균일성을 숨길 수 있습니다52. 콜로이드 프로브는 일반적으로 에폭시 접착제를 사용하여 마이크론 크기의 콜로이드 구형체를 팁이 없는 캔틸레버에 부착하여 만듭니다. 제조 공정 자체에는 많은 문제가 있으며, 프로브 교정 과정에서 불일치가 발생할 수 있습니다. 또한, 콜로이드 입자의 크기와 질량은 공진 주파수, 스프링 강성, 처짐 감도와 같은 캔틸레버의 주요 교정 매개변수에 직접적인 영향을 미칩니다.56,57,58 따라서 온도 교정과 같이 기존 AFM 프로브에 일반적으로 사용되는 방법은 CP에 대한 정확한 교정을 제공하지 못할 수 있으며, 이러한 교정을 위해 다른 방법이 필요할 수 있습니다.57,59,60,61 일반적인 CP 압입 실험은 연성 시료의 특성을 연구하기 위해 큰 편차의 캔틸레버를 사용하는데, 이는 비교적 큰 편차에서 캔틸레버의 비선형 거동을 교정할 때 또 다른 문제를 야기합니다.62,63,64 최신 콜로이드 프로브 압입 방법은 일반적으로 프로브 교정에 사용되는 캔틸레버의 형상을 고려하지만, 콜로이드 입자의 영향을 무시하기 때문에 방법의 정확도에 추가적인 불확실성이 발생합니다.38,61 마찬가지로, 접촉 모델 피팅을 통해 계산된 탄성 계수는 ​​압입 프로브의 형상에 직접적으로 의존하며, 팁과 샘플 표면 특성 간의 불일치는 부정확성을 초래할 수 있습니다.27, 65, 66, 67, 68. Spencer 등의 최근 연구에서는 CP-AFM 나노압입법을 사용하여 연성 폴리머 브러시의 특성을 분석할 때 고려해야 할 요소들을 강조합니다. 그들은 속도에 따라 폴리머 브러시에 점성 유체가 유지되면 헤드 하중이 증가하고, 이로 인해 속도 의존적 ​​특성 측정값이 달라진다고 보고했습니다.30,69,70,71.
본 연구에서는 변형된 AFM 나노인덴테이션 방법을 이용하여 초연성 고탄성 재료인 레필콘 ACL의 표면 탄성률을 특성화했습니다. 이 재료의 특성과 새로운 구조를 고려할 때, 기존 인덴테이션 방법의 감도 범위는 이 매우 연성 재료의 탄성률을 특성화하기에 분명히 부족합니다. 따라서 감도가 더 높고 감도가 낮은 AFM 나노인덴테이션 방법을 사용해야 합니다. 기존 콜로이드 AFM 프로브 나노인덴테이션 기술의 단점과 문제점을 검토한 후, 감도, 배경 잡음 제거, 정확한 접촉점 측정, 유체 보유 의존성과 같은 연성 이종 재료의 속도 탄성률 측정, 그리고 정확한 정량화를 위해 더 작고 맞춤 설계된 AFM 프로브를 선택한 이유를 설명합니다. 또한, 인덴테이션 팁의 모양과 치수를 정확하게 측정하여, 팁과 재료의 접촉 면적을 평가하지 않고도 원뿔-구형 적합 모델을 사용하여 탄성률을 결정할 수 있었습니다. 본 연구에서 정량화되는 두 가지 암묵적 가정은 완전 탄성 재료의 물성과 압입 깊이에 독립적인 탄성 계수입니다. 이 방법을 사용하여, 먼저 탄성 계수가 알려진 초연성 표준 물질을 시험하여 방법을 정량화한 다음, 이 방법을 사용하여 두 가지 다른 콘택트렌즈 재료의 표면을 특성화했습니다. 향상된 감도로 AFM 나노압입 표면을 특성화하는 이 방법은 의료 기기 및 생체 의학 분야에 잠재적으로 활용될 수 있는 다양한 생체모방 이종 초연성 재료에 적용될 것으로 예상됩니다.
Lehfilcon A 콘택트 렌즈(Alcon, Fort Worth, Texas, USA)와 실리콘 하이드로겔 기판을 나노압입 실험에 선택했습니다. 실험에는 특별히 설계된 렌즈 마운트를 사용했습니다. 테스트를 위해 렌즈를 설치하려면 돔형 스탠드에 조심스럽게 놓고 공기 방울이 들어가지 않도록 한 다음 가장자리로 고정했습니다. 렌즈 홀더 상단의 고정 장치에 있는 구멍은 액체를 제자리에 고정하면서 나노압입 실험을 위해 렌즈의 광학 중심에 접근할 수 있도록 합니다. 이렇게 하면 렌즈가 완전히 수화된 상태로 유지됩니다. 500 μl의 콘택트 렌즈 포장 용액을 테스트 용액으로 사용했습니다. 정량적 결과를 확인하기 위해 시중에서 판매되는 비활성화 폴리아크릴아미드(PAAM) 하이드로겔을 폴리아크릴아미드-코-메틸렌-비스아크릴아미드 조성물(100 mm Petrisoft Petri dish, Matrigen, Irvine, CA, USA)로부터 제조했습니다. 탄성 계수는 ​​1 kPa로 알려져 있습니다. 인산완충식염수(Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA의 PBS) 4-5방울(약 125 µl)과 OPTI-FREE Puremoist 콘택트렌즈 용액(Alcon, Vaud, TX, USA) 1방울을 AFM 하이드로젤-프로브 계면에 떨어뜨립니다.
Lehfilcon A CL 및 SiHy 기판 샘플은 주사 투과 전자 현미경(STEM) 검출기가 장착된 FEI Quanta 250 전계 방출 주사 전자 현미경(FEG SEM) 시스템을 사용하여 시각화했습니다.샘플을 준비하기 위해 렌즈를 먼저 물로 세척하고 파이 모양의 쐐기 모양으로 자릅니다.샘플의 친수성 및 소수성 구성 요소 간의 차등 대비를 얻기 위해 0.10% 안정화 RuO4 용액을 염료로 사용하여 샘플을 30분 동안 담갔습니다.Lehfilcon A CL RuO4 염색은 차등 대비를 개선하는 데 중요할 뿐만 아니라 STEM 이미지에서 볼 수 있는 원래 형태의 가지형 폴리머 브러시 구조를 보존하는 데 도움이 됩니다.그런 다음 에탄올 농도를 증가시키면서 일련의 에탄올/물 혼합물에서 세척하고 탈수했습니다.그런 다음 샘플을 EMBed 812/Araldite 에폭시로 주조하고 70°C에서 하룻밤 동안 경화했습니다. 수지 중합으로 얻은 샘플 블록을 초박절편기로 절단하고, 생성된 박편을 가속 전압 30 kV의 저진공 모드에서 STEM 검출기로 시각화했습니다. PFQNM-LC-A-CAL AFM 프로브(Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA)의 상세 특성 분석에는 동일한 SEM 시스템을 사용했습니다. AFM 프로브의 SEM 이미지는 가속 전압 30 kV의 일반적인 고진공 모드에서 얻었습니다. AFM 프로브 팁의 모양과 크기에 대한 모든 세부 정보를 기록하기 위해 다양한 각도와 배율에서 이미지를 획득했습니다. 이미지에서 관심 있는 모든 팁 치수는 디지털 방식으로 측정되었습니다.
Dimension FastScan Bio Icon 원자간력 현미경(Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA)과 "PeakForce QNM in Fluid" 모드를 사용하여 레필콘 A CL, SiHy 기질, 그리고 PAAm 하이드로젤 시료를 시각화하고 나노인덴테이션(nanoindentation)했습니다. 이미징 실험을 위해, 공칭 팁 반경이 1 nm인 PEAKFORCE-HIRS-FA 프로브(Bruker)를 사용하여 0.50 Hz의 스캔 속도로 시료의 고해상도 이미지를 촬영했습니다. 모든 이미지는 수용액에서 촬영했습니다.
AFM 나노압입 실험은 PFQNM-LC-A-CAL 프로브(Bruker)를 사용하여 수행되었습니다. AFM 프로브는 두께 345nm, 길이 54µm, 폭 4.5µm의 질화물 캔틸레버에 실리콘 팁이 있으며 공진 주파수는 45kHz입니다. 이 프로브는 연성 생물학적 샘플에 대한 정량적 나노역학 측정을 특성화하고 수행하도록 특별히 설계되었습니다. 센서는 사전 교정된 스프링 설정으로 공장에서 개별적으로 교정됩니다. 이 연구에 사용된 프로브의 스프링 상수는 0.05~0.1N/m 범위였습니다. 팁의 모양과 크기를 정확하게 결정하기 위해 SEM을 사용하여 프로브를 자세히 특성화했습니다. 그림 1a는 PFQNM-LC-A-CAL 프로브의 고해상도, 저배율 주사 전자 현미경 사진을 보여주며 프로브 설계에 대한 전체적인 관점을 제공합니다. 그림 1a는 PFQNM-LC-A-CAL 프로브의 고해상도, 저배율 주사 전자 현미경 사진을 보여주며 프로브 설계에 대한 전체적인 관점을 제공합니다. 그림 1b는 프로브 팁 상단의 확대도를 보여주며, 팁의 모양과 크기에 대한 정보를 제공합니다. 바늘 끝부분은 직경이 약 140nm인 반구입니다(그림 1c). 이 아래에서 팁은 원뿔 모양으로 가늘어지며 측정 길이는 약 500nm에 이릅니다. 가늘어지는 영역 바깥쪽의 팁은 원통형이며 총 팁 길이는 1.18µm입니다. 이것이 프로브 팁의 주요 기능 부분입니다. 또한, 팁 직경이 45µm이고 스프링 상수가 2N/m인 대형 구형 폴리스티렌(PS) 프로브(Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA)도 콜로이드 프로브로 테스트에 사용되었습니다. 비교를 위해 PFQNM-LC-A-CAL 140nm 프로브와 함께 사용했습니다.
나노압입 중에 AFM 프로브와 폴리머 브러시 구조 사이에 액체가 갇힐 수 있다고 보고되었으며, 이는 실제로 표면에 닿기 전에 AFM 프로브에 위쪽으로 힘을 가하게 됩니다69. 유체 유지로 인한 이러한 점성 압출 효과는 접촉 지점을 변경할 수 있으므로 표면 탄성률 측정에 영향을 미칩니다. 프로브 형상과 압입 속도가 유체 유지에 미치는 영향을 연구하기 위해 1µm/s와 2µm/s의 일정한 변위 속도에서 140nm 직경의 프로브를 사용하여 lehfilcon A CL 샘플에 대한 압입력 곡선을 그렸습니다. 프로브 직경 45µm, 고정력 설정 6nN은 1µm/s에서 달성되었습니다. 직경 140nm의 프로브를 사용한 실험은 1µm/s의 압입 속도와 300pN의 설정력에서 수행되었으며, 이는 상안검의 생리적 범위(1–8kPa) 내에서 접촉 압력을 생성하도록 선택되었습니다. 압력 72. 1 kPa의 압력을 갖는 PAA 하이드로젤의 부드러운 기성 샘플은 직경 140 nm의 프로브를 사용하여 1 μm/s의 속도에서 50 pN의 압입력에 대해 테스트되었습니다.
PFQNM-LC-A-CAL 프로브 팁의 원뿔 부분 길이가 약 500nm이므로, 500nm 미만의 압입 깊이에 대해 압입 중 프로브의 기하학적 구조가 원뿔 모양을 그대로 유지한다고 안전하게 가정할 수 있습니다.또한, 테스트 중인 재료의 표면이 가역적인 탄성 응답을 보일 것으로 가정하며, 이는 다음 섹션에서도 확인할 것입니다.따라서 팁의 모양과 크기에 따라 공급업체의 소프트웨어(NanoScope)에서 사용할 수 있는 Briscoe, Sebastian 및 Adams가 개발한 원뿔-구형 피팅 모델을 선택하여 AFM 나노압입 실험을 처리했습니다.분리 데이터 분석 소프트웨어, Bruker) 73.이 모델은 구형 정점 결함이 있는 원뿔에 대한 힘-변위 관계 F(δ)를 설명합니다.그림에서 그림 2는 강체 원뿔과 구형 팁의 상호 작용 시 접촉 기하 구조를 보여줍니다. 여기서 R은 구형 팁의 반지름, a는 접촉 반지름, b는 구형 팁 끝부분의 접촉 반지름, δ는 접촉 반지름입니다. 압입 깊이, θ는 원뿔의 반각입니다. 이 프로브의 SEM 이미지는 직경 140nm의 구형 팁이 원뿔에 접선 방향으로 합쳐지는 것을 명확하게 보여줍니다. 따라서 여기서 b는 R을 통해서만 정의됩니다. 즉, b = R cos θ입니다. 공급업체에서 제공하는 소프트웨어는 a > b를 가정하여 힘 분리 데이터에서 영률(E) 값을 계산하는 원뿔-구체 관계를 제공합니다. 관계:
여기서 F는 압입력, E는 영률, ν는 푸아송 비입니다. 접촉 반경 a는 다음을 사용하여 추정할 수 있습니다.
구형 팁이 있는 단단한 원뿔의 접촉 기하학을 나타낸 그림으로, Lefilcon 콘택트 렌즈의 소재에 압착되어 있으며, 표면은 가지형 폴리머 브러시로 되어 있습니다.
a ≤ b인 경우, 관계는 기존 구형 압입자에 대한 방정식으로 축소됩니다.
압입 프로브와 PMPC 폴리머 브러시의 분지형 구조의 상호작용으로 인해 접촉 반경 a가 구형 접촉 반경 b보다 커질 것으로 예상됩니다. 따라서 본 연구에서 수행된 모든 정량적 탄성 계수 측정에는 a > b인 경우에 대해 얻은 종속성을 사용했습니다.
이 연구에서 연구한 초연성 생체모방 소재는 샘플 단면의 주사 투과 전자 현미경(STEM)과 표면의 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 포괄적으로 이미지화했습니다. 이 자세한 표면 특성화는 이전에 발표된 연구의 연장으로 수행되었으며, 이 연구에서 PMPC로 변형된 레필콘 A CL 표면의 동적 분기 폴리머 브러시 구조가 천연 각막 조직과 유사한 기계적 특성을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 이러한 이유로 콘택트 렌즈 표면을 생체모방 소재라고 합니다. 그림 3a, b는 각각 레필콘 A CL 기판과 처리되지 않은 SiHy 기판 표면의 분기된 PMPC 폴리머 브러시 구조의 단면을 보여줍니다. 두 샘플의 표면은 고해상도 AFM 이미지를 사용하여 추가로 분석되었으며, 이는 STEM 분석 결과를 더욱 확인했습니다(그림 3c, d). 이 이미지들을 종합하면, 300~400nm에서 PMPC 분지형 폴리머 브러시 구조의 대략적인 길이를 알 수 있으며, 이는 AFM 나노인덴테이션 측정을 해석하는 데 중요합니다. 이미지에서 도출된 또 다른 중요한 관찰 결과는 CL 생체모방 소재의 전반적인 표면 구조가 SiHy 기판 소재와 형태학적으로 다르다는 것입니다. 이러한 표면 형태의 차이는 AFM 프로브와의 기계적 상호작용을 통해, 그리고 결과적으로 측정된 탄성 계수 값에서 명확하게 드러날 수 있습니다.
(a) 레필콘 A CL 및 (b) SiHy 기판의 단면 STEM 이미지. 스케일 바, 500 nm. 레필콘 A CL 기판 표면(c)과 기본 SiHy 기판(d)의 AFM 이미지(3 µm × 3 µm).
생체모방 고분자와 고분자 브러시 구조는 본질적으로 부드러워 다양한 생의학 분야에서 널리 연구되고 사용되어 왔습니다74,75,76,77. 따라서 기계적 특성을 정확하고 신뢰성 있게 측정할 수 있는 AFM 나노인덴테이션 방법을 사용하는 것이 중요합니다. 그러나 매우 낮은 탄성 계수, 높은 액체 함량, 높은 탄성률과 같은 이러한 초연성 재료의 고유한 특성으로 인해 압입 프로브의 적절한 재질, 모양 및 크기를 선택하는 것이 종종 어렵습니다. 이는 압입자가 시료의 부드러운 표면을 뚫지 않도록 하는 데 중요하며, 이로 인해 표면과의 접촉 지점 및 접촉 면적을 결정하는 데 오류가 발생할 수 있습니다.
이를 위해서는 초연성 생체모방 소재(lehfilcon A CL)의 형태에 대한 포괄적인 이해가 필수적입니다. 이미징 방법을 사용하여 얻은 분지형 폴리머 브러시의 크기와 구조에 대한 정보는 AFM 나노인덴테이션 기술을 사용하여 표면의 기계적 특성을 분석하는 데 필요한 기반을 제공합니다. 마이크론 크기의 구형 콜로이드 프로브 대신, 생물학적 시료의 기계적 특성을 정량적으로 측정하기 위해 특별히 설계된 팁 직경 140nm의 PFQNM-LC-A-CAL 실리콘 질화물 프로브(Bruker)를 선택했습니다.78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 기존 콜로이드 프로브에 비해 상대적으로 날카로운 프로브를 사용하는 이유는 재료의 구조적 특성으로 설명할 수 있습니다. 그림 3a에 나타낸 CL 레필콘 A 표면의 분지형 폴리머 브러시와 프로브 팁 크기(~140 nm)를 비교하면, 팁이 브러시 구조와 직접 접촉할 만큼 충분히 크기 때문에 팁이 브러시 구조를 뚫을 가능성이 줄어든다는 결론을 내릴 수 있습니다. 이를 설명하기 위해 그림 4는 레필콘 A CL과 AFM 프로브의 압입 팁의 STEM 이미지(실제 크기대로 그려짐)를 보여줍니다.
레필콘 A CL과 ACM 압입 프로브의 STEM 이미지를 보여주는 개략도(실제 비율에 맞게 그려짐).
또한, 140nm의 팁 크기는 이전에 CP-AFM 나노압입법으로 생산된 폴리머 브러시에 대해 보고된 점착성 압출 효과의 위험을 피하기에 충분히 작습니다69,71. 이 AFM 팁의 특수한 원뿔 구형과 비교적 작은 크기(그림 1)로 인해 lehfilcon A CL 나노압입에 의해 생성된 힘 곡선의 특성은 압입 속도 또는 로딩/언로딩 속도에 의존하지 않을 것이라고 가정합니다. 따라서 다공성 탄성 효과의 영향을 받지 않습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 lehfilcon A CL 샘플은 PFQNM-LC-A-CAL 프로브를 사용하여 고정된 최대 힘으로 압입되었지만 두 가지 다른 속도로 압입되었고, 결과적인 인장 및 수축력 곡선을 사용하여 분리(µm)에서의 힘(nN)을 플롯팅했습니다. 그림 5a에 나와 있습니다. 하중 및 제하 중 힘 곡선이 완전히 겹치는 것이 분명하며, 그림에서 압입 깊이가 0일 때의 힘 전단이 압입 속도에 따라 증가한다는 명확한 증거는 없습니다. 이는 개별 브러시 요소가 기공탄성 효과 없이 특성화되었음을 시사합니다. 반면, 동일한 압입 속도에서 45µm 직경의 AFM 프로브의 경우 유체 보유 효과(점성 압출 및 기공탄성 효과)가 명백하게 나타나며, 그림 5b에서 볼 수 있듯이 신축 곡선과 수축 곡선 사이의 히스테리시스로 강조됩니다. 이러한 결과는 가설을 뒷받침하며, 140nm 직경의 프로브가 이러한 연성 표면을 특성화하는 데 적합한 선택임을 시사합니다.
ACM을 사용한 lehfilcon A CL 압입력 곡선; (a) 두 가지 하중 속도에서 직경 140nm의 프로브를 사용하여 표면 압입 중에 다공성 탄성 효과가 없음을 보여줍니다. (b) 직경 45µm 및 140nm의 프로브를 사용합니다. s는 작은 프로브와 비교하여 큰 프로브의 점성 압출 및 다공성 탄성 효과를 보여줍니다.
초연성 표면을 특성화하기 위해 AFM 나노인덴테이션 방법은 연구 대상 재료의 특성을 연구할 수 있는 최적의 프로브를 가져야 합니다. 팁 모양과 크기 외에도 AFM 검출기 시스템의 감도, 시험 환경에서 팁 처짐에 대한 감도, 그리고 캔틸레버 강성은 나노인덴테이션 측정의 정확도와 신뢰성을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 본 AFM 시스템의 경우, 위치 감지 검출기(PSD) 검출 한계는 약 0.5mV이며, 사전 보정된 스프링 속도와 PFQNM-LC-A-CAL 프로브의 계산된 유체 처짐 감도를 기반으로 하며, 이는 이론적 하중 감도에 해당합니다. 0.1pN 미만입니다. 따라서 이 방법을 사용하면 주변 잡음 성분 없이 최소 압입력 ≤ 0.1pN을 측정할 수 있습니다. 그러나 기계적 진동 및 유체 역학과 같은 요인으로 인해 AFM 시스템이 주변 잡음을 이 수준까지 줄이는 것은 거의 불가능합니다. 이러한 요인들은 AFM 나노압입법의 전반적인 감도를 제한하고 약 ≤ 10 pN의 배경 잡음 신호를 초래합니다. 표면 특성 분석을 위해, lehfilcon A CL 및 SiHy 기판 샘플을 SEM 특성 분석을 위해 140 nm 프로브를 사용하여 완전히 수화된 조건에서 압입했고, 그 결과 힘 곡선은 힘(pN)과 압력 사이에 중첩되었습니다. 분리 플롯(µm)은 그림 6a에 나와 있습니다. SiHy 기반 기판과 비교하여 lehfilcon A CL 힘 곡선은 포크형 폴리머 브러시와의 접촉 지점에서 시작하여 팁과 기본 재료의 접촉을 표시하는 경사의 급격한 변화로 끝나는 전이 단계를 명확하게 보여줍니다. 힘 곡선의 이 전이 부분은 표면에서 분지형 폴리머 브러시의 진정한 탄성 거동을 강조하며, 이는 인장 곡선을 밀접하게 따르는 압축 곡선과 브러시 구조와 부피가 큰 SiHy 재료 간의 기계적 특성의 대조로 입증됩니다. lefilcon을 비교할 때. PCS의 STEM 이미지(그림 3a)에서 분지형 고분자 브러시의 평균 길이를 분리한 것과 그림 3a의 가로축을 따른 힘 곡선을 비교한 결과, 그림 6a는 이 방법이 팁과 분지형 고분자가 표면의 최상단까지 도달하는 것을 감지할 수 있음을 보여줍니다. 브러시 구조 간의 접촉. 또한, 힘 곡선이 거의 겹치는 것은 액체 유지 효과가 없음을 나타냅니다. 이 경우 바늘과 샘플 표면 사이에 접착력이 전혀 없습니다. 두 샘플의 힘 곡선의 최상단 부분이 겹치는 것은 기판 재료의 기계적 특성이 유사함을 나타냅니다.
(a) Lehfilcon A CL 기판과 SiHy 기판에 대한 AFM 나노압입력 곡선, (b) 배경 잡음 임계값 방법을 사용하여 접촉점 추정을 보여주는 힘 곡선.
힘 곡선의 세부 사항을 연구하기 위해, lehfilcon A CL 샘플의 인장 곡선을 y축을 따라 최대 힘 50pN으로 그림 6b에 다시 그렸습니다. 이 그래프는 원래 배경 잡음에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 잡음은 ±10pN 범위에 있으며, 이는 접촉점을 정확하게 결정하고 압입 깊이를 계산하는 데 사용됩니다. 문헌에 보고된 바와 같이, 접촉점을 식별하는 것은 탄성률과 같은 재료 특성을 정확하게 평가하는 데 중요합니다. 힘 곡선 데이터의 자동 처리를 포함하는 접근 방식은 연성 재료에 대한 데이터 피팅과 정량적 측정 간의 적합성이 향상된 것으로 나타났습니다. 이 작업에서 접촉점의 선택은 비교적 간단하고 객관적이지만 한계가 있습니다. 접촉점을 결정하는 데 대한 보수적인 접근 방식은 더 작은 압입 깊이(<100nm)에 대해 탄성률 값을 약간 과대평가하는 결과를 초래할 수 있습니다. 알고리즘 기반 접촉점 감지 및 자동 데이터 처리를 사용하면 향후 이 작업의 연속으로 방법을 더욱 개선할 수 있습니다. 따라서 ±10 pN 정도의 고유 배경 잡음에 대해 그림 6b의 x축에서 값이 ≥10 pN인 첫 번째 데이터 점으로 접촉점을 정의합니다. 그런 다음 10 pN의 잡음 임계값에 따라 ~0.27 µm 수준의 수직선이 표면과의 접촉점을 표시하고 그 후 기판이 ~270 nm의 압입 깊이를 만날 때까지 스트레칭 곡선이 계속됩니다. 흥미롭게도 이미징 방법을 사용하여 측정한 분기형 폴리머 브러시 특징(300–400 nm)의 크기를 기반으로 배경 잡음 임계값 방법을 사용하여 관찰한 CL lehfilcon A 샘플의 압입 깊이는 약 270 nm로 STEM을 사용한 측정 크기와 매우 가깝습니다. 이러한 결과는 매우 부드럽고 탄성이 높은 분기형 폴리머 브러시 구조의 압입을 위한 AFM 프로브 팁의 모양과 크기의 적합성과 적용 가능성을 더욱 확인합니다. 이 데이터는 또한 접촉점을 정확히 찾아내기 위한 임계값으로 배경 잡음을 사용하는 방법을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공합니다. 따라서 수학적 모델링과 힘 곡선 적합을 통해 얻은 모든 정량적 결과는 비교적 정확할 것입니다.
AFM 나노인덴테이션 방법에 의한 정량적 측정은 데이터 선택 및 후속 분석에 사용된 수학적 모델에 전적으로 의존합니다. 따라서 특정 모델을 선택하기 전에 압입자 선택, 재료 특성 및 상호 작용의 역학과 관련된 모든 요소를 ​​고려하는 것이 중요합니다. 이 경우, 팁 형상은 SEM 현미경 사진(그림 1)을 사용하여 신중하게 특성화되었으며, 결과에 따르면 경질 원뿔과 구형 팁 형상을 가진 140nm 직경의 AFM 나노인덴팅 프로브는 lehfilcon A CL79 샘플 특성화에 적합한 선택입니다. 신중하게 평가해야 하는 또 다른 중요한 요소는 시험 중인 폴리머 재료의 탄성입니다. 나노인덴테이션의 초기 데이터(그림 5a 및 6a)는 인장 및 압축 곡선의 중첩, 즉 재료의 완전한 탄성 회복의 특징을 명확하게 설명하지만, 접촉의 순수 탄성 특성을 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해, 완전 수화 조건에서 레필콘 A CL 샘플 표면의 동일한 위치에 1 µm/s의 압입 속도로 두 번의 연속 압입을 ​​수행했습니다. 그 결과 얻은 힘 곡선 데이터는 그림 7에 나와 있으며, 예상대로 두 인쇄물의 팽창 및 압축 곡선이 거의 동일하여 분지형 폴리머 브러시 구조의 높은 탄성을 강조합니다.
레필콘 A CL 표면의 동일한 위치에 있는 두 개의 압입력 곡선은 렌즈 표면의 이상적인 탄성을 나타냅니다.
프로브 팁과 레필콘 A CL 표면의 SEM 및 STEM 이미지에서 얻은 정보를 기반으로, 원뿔-구형 모델은 AFM 프로브 팁과 시험 대상 연성 폴리머 재료 간의 상호작용을 수학적 방식으로 합리적으로 표현합니다. 또한, 이 원뿔-구형 모델의 경우, 임프린팅된 재료의 탄성 특성에 대한 기본 가정이 이 새로운 생체모방 재료에도 적용되며, 탄성 계수를 정량화하는 데 사용됩니다.
AFM 나노인덴테이션 방법과 그 구성 요소(인덴테이션 프로브 특성(모양, 크기 및 스프링 강성), 민감도(배경 잡음 및 접촉점 추정), 데이터 피팅 모델(정량적 탄성 계수 측정) 포함)에 대한 포괄적인 평가 후, 이 방법을 사용했습니다. 시중에서 판매되는 초연성 샘플을 특성화하여 정량적 결과를 검증했습니다. 탄성 계수가 1kPa인 시중의 폴리아크릴아미드(PAAM) 하이드로젤을 140nm 프로브를 사용하여 수화 조건에서 테스트했습니다. 모듈 테스트 및 계산에 대한 자세한 내용은 보충 정보에 나와 있습니다. 결과는 측정된 평균 탄성 계수가 0.92kPa이고 알려진 탄성 계수와의 %RSD 및 백분율(%) 편차가 10% 미만임을 보여주었습니다. 이러한 결과는 이 작업에서 초연성 재료의 탄성 계수를 측정하기 위해 사용된 AFM 나노인덴테이션 방법의 정확성과 재현성을 확인합니다. 영어: lehfilcon A CL 샘플과 SiHy 기본 기판의 표면은 압입 깊이의 함수로서 초연성 표면의 겉보기 접촉 탄성률을 연구하기 위해 동일한 AFM 나노압입 방법을 사용하여 추가로 특성화되었습니다.압입력 분리 곡선은 각 유형의 3개 시편(n = 3, 시편당 1개 압입)에 대해 300 pN의 힘, 1 µm/s의 속도 및 완전 수화에서 생성되었습니다.압입력 공유 곡선은 원뿔-구 모델을 사용하여 근사화되었습니다.압입 깊이에 따른 탄성률을 얻기 위해 접촉 지점에서 시작하여 20nm씩 증가할 때마다 40nm 폭의 힘 곡선 부분을 설정하고 힘 곡선의 각 단계에서 탄성률 값을 측정했습니다.Spin Cy et al. 유사한 접근법이 콜로이드 AFM 프로브 나노압입을 사용하여 폴리(라우릴 메타크릴레이트)(P12MA) 폴리머 브러시의 탄성률 구배를 특성화하는 데 사용되었으며, 이는 헤르츠 접촉 모델을 사용하는 데이터와 일치합니다. 이 접근법은 그림 8에 표시된 것처럼 겉보기 접촉 탄성률(kPa) 대 압입 깊이(nm)의 플롯을 제공하며, 이는 겉보기 접촉 탄성률/깊이 구배를 보여줍니다. CL lehfilcon A 샘플의 계산된 탄성률은 샘플의 상위 100nm 내에서 2~3kPa 범위에 있으며, 이를 넘어서면 깊이에 따라 증가하기 시작합니다. 반면, 표면에 브러시와 같은 필름이 없는 SiHy 베이스 기판을 테스트할 때 300pN의 힘에서 달성된 최대 압입 깊이는 50nm 미만이며, 데이터에서 얻은 탄성률 값은 약 400kPa로 벌크 재료의 영률 값과 비슷합니다.
AFM 나노압입법을 사용하여 원뿔-구형 기하학을 사용하여 탄성률을 측정한 lehfilcon A CL 및 SiHy 기판의 겉보기 접촉 탄성률(kPa) 대 압입 깊이(nm)입니다.
새로운 생체모방 분지형 고분자 브러시 구조의 최상단 표면은 매우 낮은 탄성 계수(2~3kPa)를 나타냅니다. 이는 STEM 이미지에서 볼 수 있듯이, 갈래형 고분자 브러시의 자유로이 매달린 끝부분과 일치합니다. CL의 바깥쪽 가장자리에서 탄성 계수 구배가 일부 나타나지만, 주요 고탄성 기판이 더 큰 영향을 미칩니다. 그러나 표면의 상단 100nm는 분지형 고분자 브러시 전체 길이의 20% 이내이므로, 이 압입 깊이 범위에서 측정된 탄성 계수 값은 비교적 정확하며 바닥 물체의 영향에 크게 의존하지 않는다고 가정하는 것이 타당합니다.
영어: SiHy 기판 표면에 접목된 분지형 PMPC 폴리머 브러시 구조로 구성된 lehfilcon A 콘택트 렌즈의 독특한 생체모방적 디자인으로 인해 기존 측정 방법을 사용하여 표면 구조의 기계적 특성을 신뢰성 있게 특성화하는 것은 매우 어렵습니다. 여기서 우리는 높은 수분 함량과 매우 높은 탄성을 가진 lefilcon A와 같은 초연성 재료를 정확하게 특성화하기 위한 고급 AFM 나노인덴테이션 방법을 제시합니다. 이 방법은 인쇄할 초연성 표면 특징의 구조적 치수와 일치하도록 팁 크기와 형상이 신중하게 선택된 AFM 프로브를 사용하는 것을 기반으로 합니다. 프로브와 구조 사이의 이러한 치수 조합은 감도를 높여 다공성 탄성 효과에 관계없이 분지형 폴리머 브러시 요소의 낮은 탄성 계수와 고유 탄성 특성을 측정할 수 있게 합니다. 결과는 렌즈 표면의 고유한 분지형 PMPC 폴리머 브러시 특성이 수성 환경에서 테스트했을 때 매우 낮은 탄성 계수(최대 2kPa)와 매우 높은 탄성(거의 100%)을 가짐을 보여주었습니다. AFM 나노압입 결과를 통해 생체모방 렌즈 표면의 겉보기 접촉 탄성률/깊이 구배(30 kPa/200 nm)를 특성화할 수 있었습니다. 이 구배는 분지형 폴리머 브러시와 SiHy 기판 사이의 탄성률 차이, 폴리머 브러시의 분지형 구조/밀도, 또는 이들의 조합 때문일 수 있습니다. 그러나 구조와 특성 간의 관계, 특히 브러시 분지가 기계적 특성에 미치는 영향을 완전히 이해하기 위해서는 추가적인 심층 연구가 필요합니다. 유사한 측정을 통해 다른 초연성 소재 및 의료 기기 표면의 기계적 특성을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
현재 연구 중에 생성 및/또는 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청이 있을 경우 각 저자로부터 제공받을 수 있습니다.
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