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의료기기 및 생의학 응용 분야에 사용되는 새로운 초연질 소재의 개발이 진행됨에 따라, 이러한 소재의 물리적 및 기계적 특성을 종합적으로 규명하는 것은 중요하면서도 어려운 과제입니다. 본 연구에서는 변형된 원자력 현미경(AFM) 나노압입 기술을 이용하여 분지형 고분자 브러시 구조층으로 코팅된 새로운 생체모방 실리콘 하이드로겔 콘택트렌즈인 레필콘 A의 극히 낮은 표면 탄성률을 분석했습니다. 이 방법은 분지형 고분자에 접근할 때 발생하는 점성 압출 효과 없이 접촉점을 정밀하게 측정할 수 있게 해줍니다. 또한, 다공탄성의 영향을 배제하고 개별 브러시 요소의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 이는 연질 소재 및 생체 시료의 특성 측정에 특히 적합한 설계(팁 크기, 형상 및 스프링 상수)의 AFM 프로브를 선택함으로써 가능해집니다. 이 방법은 표면 탄성률이 극히 낮고(최대 2kPa), 내부 수용액 환경에서는 탄성률이 극히 높은(거의 100%) 초연질 소재인 레필콘 A의 특성을 정확하게 측정하는 데 필요한 감도와 정확도를 향상시킵니다. 표면 연구 결과는 레필콘 A 렌즈의 초연질 표면 특성을 밝혀냈을 뿐만 아니라, 분지형 고분자 브러시의 탄성률이 실리콘-수소 기판의 탄성률과 유사하다는 것도 보여주었습니다. 이러한 표면 특성 분석 기술은 다른 초연질 소재 및 의료 기기에도 적용될 수 있습니다.
생체 조직과 직접 접촉하도록 설계된 재료의 기계적 특성은 생물학적 환경에 의해 결정되는 경우가 많습니다. 이러한 재료 특성의 완벽한 조화는 세포에 유해한 반응을 일으키지 않고 원하는 임상적 특성을 달성하는 데 도움이 됩니다.^1,2,3 균일한 벌크 재료의 경우, 표준 절차 및 시험 방법(예: 미세압입^4,5,6)이 존재하기 때문에 기계적 특성 분석이 비교적 용이합니다. 그러나 젤, 하이드로젤, 생체 고분자, 살아있는 세포 등과 같은 초연질 재료의 경우, 측정 해상도의 한계와 일부 재료의 불균일성으로 인해 이러한 시험 방법은 일반적으로 적용할 수 없습니다.⁷ 수년에 걸쳐 기존의 압입 방법은 다양한 연질 재료의 특성을 분석하기 위해 수정 및 적용되어 왔지만, 여전히 많은 방법이 심각한 단점을 가지고 있어 활용에 제약이 있습니다.^{8,9,10,11,12,13} 초연질 재료 및 표면층의 기계적 특성을 정확하고 신뢰할 수 있게 분석할 수 있는 특수 시험 방법의 부족은 다양한 응용 분야에서 이러한 재료의 사용을 심각하게 제한합니다.
이전 연구에서 우리는 눈의 각막 표면에서 영감을 얻은 생체모방 설계를 통해 초연질 표면 특성을 모두 갖춘 연질 이종 소재인 레필콘 A(CL) 콘택트렌즈를 소개했습니다. 이 생체 소재는 의료기기용으로 설계된 실리콘 하이드로겔(SiHy)¹⁵에 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(MPC))(PMPC)의 분지형 가교 폴리머 층을 접합하여 개발되었습니다. 이 접합 과정을 통해 표면에 매우 부드럽고 탄성이 뛰어난 분지형 폴리머 브러시 구조의 층이 형성됩니다. 이전 연구에서 우리는 레필콘 A CL의 생체모방 구조가 향상된 습윤성 및 오염 방지, 윤활성 증가, 세포 및 박테리아 부착 감소와 같은 우수한 표면 특성을 제공한다는 것을 확인했습니다¹⁵,¹⁶. 또한, 이 생체모방 소재의 활용 및 개발은 다른 생의학 기기로의 확장 가능성을 시사합니다. 따라서, 미래의 개발과 응용을 뒷받침할 포괄적인 지식 기반을 구축하기 위해서는 이 초연질 소재의 표면 특성을 규명하고 눈과의 기계적 상호작용을 이해하는 것이 매우 중요합니다. 시중에 판매되는 대부분의 실리콘 하이드로겔(SiHy) 콘택트렌즈는 균일한 소재 구조를 형성하는 친수성 및 소수성 고분자의 균질 혼합물로 구성되어 있습니다.¹⁷ 기존의 압축, 인장 및 미세압입 시험 방법을 사용하여 이러한 렌즈의 기계적 특성을 조사한 연구는 여러 건 진행되었습니다.^18,19,20,21 그러나 레필콘 A 콘택트렌즈는 생체모방 설계로 인해 분지형 고분자 브러시 구조의 기계적 특성이 SiHy 기판의 특성과 크게 다른 독특한 이종 소재입니다. 따라서 기존의 압축 및 압입 방법을 사용하여 이러한 특성을 정확하게 정량화하는 것은 매우 어렵습니다. 원자력 현미경(AFM)에 구현된 나노압입 시험법은 유망한 방법 중 하나로, 생물 세포 및 조직과 같은 연질 점탄성 물질뿐만 아니라 연질 고분자22,23,24,25,26,27,28,29,30의 기계적 특성을 측정하는 데 사용되어 왔습니다. AFM 나노압입은 나노압입 시험의 기본 원리와 최신 AFM 기술의 발전을 결합하여 측정 감도를 향상시키고 다양한 초연질 물질을 광범위하게 시험할 수 있도록 합니다31,32,33,34,35,36. 또한, 이 기술은 다양한 형상의 압입기와 프로브를 사용할 수 있고 다양한 액체 매체에서 시험할 수 있다는 점에서 중요한 이점을 제공합니다.
AFM 나노압입은 조건부로 세 가지 주요 구성 요소로 나눌 수 있습니다. (1) 장비(센서, 검출기, 프로브 등); (2) 측정 매개변수(힘, 변위, 속도, 램프 크기 등); (3) 데이터 처리(기준선 보정, 접촉점 추정, 데이터 피팅, 모델링 등). 이 방법의 중요한 문제점은 AFM 나노압입을 사용한 여러 연구에서 동일한 시료/세포/재료 유형에 대해 매우 다른 정량적 결과를 보고한다는 점입니다.37,38,39,40,41 예를 들어, Lekka 등은 기계적으로 균질한 하이드로겔과 이질적인 세포 시료의 측정된 영률에 대한 AFM 프로브 형상의 영향을 연구하고 비교했습니다. 그들은 영률 값이 캔틸레버 선택과 팁 모양에 크게 의존하며, 피라미드형 프로브에서 가장 높은 값, 구형 프로브에서 가장 낮은 값42을 나타냈다고 보고했습니다. 마찬가지로 Selhuber-Unkel 등도 유사한 결과를 보고했습니다. 압입기 속도, 압입기 크기 및 폴리아크릴아미드(PAAM) 시료의 두께가 ACM43 나노압입으로 측정한 영률에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 또 다른 복잡한 요인은 표준적인 초저 탄성률 시험 재료와 자유로운 시험 절차가 부족하다는 점입니다. 이로 인해 정확한 결과를 확신 있게 얻기가 매우 어렵습니다. 그러나 이 방법은 상대적인 측정과 유사한 시료 유형 간의 비교 평가에 매우 유용합니다. 예를 들어 AFM 나노압입을 사용하여 정상 세포와 암세포를 구별할 수 있습니다. 44, 45
AFM 나노압입을 이용하여 연질 재료를 테스트할 때, 일반적으로 시료의 탄성률과 유사한 낮은 스프링 상수(k)를 가진 프로브와 반구형/원형 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 이는 프로브가 연질 재료와 처음 접촉할 때 시료 표면을 뚫지 않도록 하기 위함입니다. 또한 프로브에서 발생하는 편향 신호가 레이저 검출 시스템에서 감지될 수 있을 만큼 충분히 강해야 합니다.24,34,46,47 초연질의 이질적인 세포, 조직 및 겔의 경우, 재현성 있고 신뢰할 수 있는 측정을 보장하기 위해 프로브와 시료 표면 사이의 접착력을 극복하는 것이 또 다른 과제입니다.48,49,50 최근까지 AFM 나노압입에 관한 대부분의 연구는 콜로이드 프로브(CP)라고 불리는 비교적 큰 구형 프로브를 사용하여 생물학적 세포, 조직, 겔, 하이드로겔 및 생체 분자의 기계적 거동 연구에 집중되어 왔습니다. 47, 51, 52, 53, 54, 55. 이러한 팁은 반경이 1~50µm이며 일반적으로 붕규산 유리, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리스티렌(PS), 이산화규소(SiO2) 및 다이아몬드 유사 탄소(DLC)로 만들어집니다. CP-AFM 나노압입은 연질 시료 특성 분석에 가장 먼저 선택되는 방법이지만, 자체적인 문제점과 한계가 있습니다. 마이크론 크기의 큰 구형 팁을 사용하면 팁과 시료의 총 접촉 면적이 증가하여 공간 해상도가 크게 저하됩니다. 국부적인 요소의 기계적 특성이 넓은 영역의 평균과 크게 다를 수 있는 연질의 불균일한 시료의 경우, CP 압입은 국부적인 규모의 특성 불균일성을 숨길 수 있습니다.52 콜로이드 프로브는 일반적으로 에폭시 접착제를 사용하여 마이크론 크기의 콜로이드 구체를 팁이 없는 캔틸레버에 부착하여 만듭니다. 제조 공정 자체에 여러 가지 문제가 있으며, 이로 인해 프로브 교정 과정에서 일관성이 떨어질 수 있습니다. 또한, 콜로이드 입자의 크기와 질량은 공진 주파수, 스프링 강성, 편향 감도와 같은 캔틸레버의 주요 교정 매개변수에 직접적인 영향을 미칩니다.56,57,58 따라서 온도 교정과 같은 기존 AFM 프로브에 일반적으로 사용되는 방법은 콜로이드 프로브(CP)에 대해 정확한 교정을 제공하지 못할 수 있으며, 이러한 보정을 위해서는 다른 방법이 필요할 수 있습니다.57, 59, 60, 61 일반적인 CP 압입 실험에서는 연질 시료의 특성을 연구하기 위해 큰 편차의 캔틸레버를 사용하는데, 이는 비교적 큰 편차에서 캔틸레버의 비선형 거동을 교정할 때 또 다른 문제를 야기합니다.62,63,64 최신 콜로이드 프로브 압입 방법은 일반적으로 프로브 교정에 사용되는 캔틸레버의 기하학적 구조를 고려하지만, 콜로이드 입자의 영향을 무시하여 방법의 정확도에 추가적인 불확실성을 초래합니다.38,61 마찬가지로, 접촉 모델 피팅으로 계산된 탄성 계수는 ​​압입 프로브의 기하학적 구조에 직접적으로 의존하며, 팁과 시료 표면 특성 간의 불일치는 부정확성을 초래할 수 있습니다.27, 65, 66, 67, 68 Spencer 등이 최근 수행한 연구에서는 CP-AFM 나노압입법을 사용하여 연질 고분자 브러시를 특성화할 때 고려해야 할 요소들을 강조했습니다. 그들은 속도에 따라 고분자 브러시 내 점성 유체의 잔류가 헤드 하중 증가를 초래하고, 결과적으로 속도에 따른 특성 측정값이 달라진다고 보고했습니다.30, 69, 70, 71
본 연구에서는 변형된 AFM 나노압입법을 이용하여 초연질 고탄성 소재인 레필콘 A CL의 표면 탄성률을 측정하였다. 이 소재의 특성과 새로운 구조를 고려할 때, 기존의 압입법으로는 이 극도로 연질인 소재의 탄성률을 측정하기에 감도가 부족하므로, 더 높은 감도와 낮은 감도 수준을 갖춘 AFM 나노압입법이 필요하였다. 기존 콜로이드 AFM 프로브 나노압입 기술의 단점과 문제점을 검토한 후, 감도 및 배경 잡음을 제거하고, 접촉점을 정확히 찾아내며, 유체 보유 의존성 등 연질 이종 소재의 탄성률 속도 측정 및 정확한 정량화를 위해 더 작고 맞춤 설계된 AFM 프로브를 선택한 이유를 제시한다. 또한, 압입 팁의 형상과 치수를 정확하게 측정할 수 있어, 팁과 소재의 접촉 면적을 측정하지 않고도 원뿔-구형 적합 모델을 이용하여 탄성률을 결정할 수 있었다. 본 연구에서 정량화된 두 가지 암묵적인 가정은 재료의 완전 탄성 특성과 압입 깊이에 무관한 탄성 계수입니다. 이 방법을 사용하여 먼저 탄성 계수가 알려진 초연질 표준 재료를 테스트하여 방법의 타당성을 검증한 다음, 이 방법을 이용하여 서로 다른 두 가지 콘택트렌즈 재질의 표면 특성을 분석했습니다. 향상된 감도로 AFM 나노압입 표면 특성을 분석하는 이 방법은 의료기기 및 생의학 응용 분야에 잠재적으로 사용될 수 있는 다양한 생체모방 이종 초연질 재료에 적용될 수 있을 것으로 기대됩니다.
나노압입 실험에는 Lehfilcon A 콘택트렌즈(Alcon, Fort Worth, Texas, USA)와 실리콘 하이드로겔 기판을 사용했습니다. 실험에는 특수 설계된 렌즈 마운트를 사용했습니다. 렌즈를 테스트용으로 장착하기 위해 돔형 스탠드에 조심스럽게 놓고 기포가 들어가지 않도록 주의한 후 가장자리를 고정했습니다. 렌즈 홀더 상단의 고정 장치에 있는 구멍을 통해 액체를 제자리에 유지하면서 나노압입 실험을 위해 렌즈의 광학 중심부에 접근할 수 있습니다. 이를 통해 렌즈는 충분한 수분을 유지합니다. 테스트 용액으로는 콘택트렌즈 포장 용액 500μl를 사용했습니다. 정량적 결과를 검증하기 위해, 탄성 계수가 1kPa로 알려진 폴리아크릴아미드-코-메틸렌-비스아크릴아미드 조성물(100mm Petrisoft 페트리 접시, Matrigen, Irvine, CA, USA)로부터 시판되는 비활성화 폴리아크릴아미드(PAAM) 하이드로겔을 제조했습니다. 인산염 완충 용액(PBS, Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) 4~5방울(약 125µl)과 OPTI-FREE Puremoist 콘택트렌즈 용액(Alcon, Vaud, TX, USA) 1방울을 AFM 하이드로겔-프로브 계면에 사용하십시오.
Lehfilcon A CL 및 SiHy 기판 샘플은 주사투과전자현미경(STEM) 검출기가 장착된 FEI Quanta 250 전계방출 주사전자현미경(FEG SEM) 시스템을 사용하여 관찰하였다. 샘플 준비를 위해 먼저 렌즈를 물로 세척한 후 파이 모양으로 잘랐다. 샘플의 친수성 부분과 소수성 부분 사이의 차별적 대비를 얻기 위해 0.10% 안정화된 RuO4 용액을 염료로 사용하여 샘플을 30분 동안 담갔다. Lehfilcon A CL의 RuO4 염색은 차별적 대비를 향상시키는 데 중요할 뿐만 아니라, 가지형 고분자 브러시의 구조를 원래 형태로 보존하는 데에도 도움이 되어 STEM 이미지에서 이를 확인할 수 있다. 그런 다음 샘플을 에탄올 농도가 점차 증가하는 에탄올/물 혼합 용액으로 세척하고 탈수시켰다. 마지막으로 EMBed 812/Araldite 에폭시를 사용하여 샘플을 주형하고 70°C에서 밤새 경화시켰다. 수지 중합으로 얻은 시료 블록을 초미세절편기로 절단하고, 얻어진 박편을 30kV 가속 전압의 저진공 모드에서 STEM 검출기를 사용하여 관찰하였다. 동일한 SEM 시스템을 사용하여 PFQNM-LC-A-CAL AFM 프로브(Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA)를 자세히 분석하였다. AFM 프로브의 SEM 이미지는 30kV 가속 전압의 일반적인 고진공 모드에서 촬영하였다. 다양한 각도와 배율로 이미지를 획득하여 AFM 프로브 팁의 모양과 크기에 대한 모든 세부 사항을 기록하였다. 이미지에서 관심 있는 팁의 모든 치수는 디지털 방식으로 측정하였다.
레필콘 A CL, SiHy 기판 및 PAAm 하이드로겔 샘플을 시각화하고 나노압입하기 위해 "PeakForce QNM in Fluid" 모드가 장착된 Dimension FastScan Bio Icon 원자력 현미경(Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA)을 사용했습니다. 이미징 실험에는 공칭 팁 반경이 1 nm인 PEAKFORCE-HIRS-FA 프로브(Bruker)를 사용하여 0.50 Hz의 스캔 속도로 샘플의 고해상도 이미지를 획득했습니다. 모든 이미지는 수용액에서 촬영되었습니다.
AFM 나노압입 실험은 PFQNM-LC-A-CAL 프로브(Bruker)를 사용하여 수행되었습니다. 이 AFM 프로브는 두께 345 nm, 길이 54 µm, 폭 4.5 µm의 질화물 캔틸레버에 실리콘 팁이 장착되어 있으며 공진 주파수는 45 kHz입니다. 이 프로브는 연질 생체 시료의 특성을 분석하고 정량적인 나노역학적 측정을 수행하도록 특별히 설계되었습니다. 센서는 공장에서 개별적으로 교정되며 스프링 설정은 미리 보정됩니다. 본 연구에 사용된 프로브의 스프링 상수는 0.05~0.1 N/m 범위였습니다. 팁의 모양과 크기를 정확하게 파악하기 위해 SEM을 사용하여 프로브를 자세히 분석했습니다. 그림 1a는 PFQNM-LC-A-CAL 프로브의 고해상도 저배율 주사전자현미경 사진으로, 프로브의 전체적인 모습을 보여줍니다. 그림 1b는 프로브 팁 상단의 확대 사진으로, 팁의 모양과 크기에 대한 정보를 제공합니다. 바늘 끝부분은 직경이 약 140 nm인 반구형입니다(그림 1c). 이보다 아래쪽으로 끝부분은 원뿔형으로 가늘어지며, 측정된 길이는 약 500 nm입니다. 가늘어지는 부분 바깥쪽은 원통형이며, 끝부분의 총 길이는 1.18 µm입니다. 이 부분이 프로브 팁의 주요 기능 부분입니다. 또한, 비교를 위해 끝부분 직경이 45 µm이고 스프링 상수가 2 N/m인 대형 구형 폴리스티렌(PS) 프로브(Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA)도 콜로이드 프로브로 사용했습니다.
나노압입 과정에서 AFM 프로브와 고분자 브러시 구조 사이에 액체가 갇혀 프로브가 실제로 표면에 닿기 전에 위쪽으로 힘을 가할 수 있다는 보고가 있습니다.69 이러한 유체 잔류로 인한 점성 압출 효과는 접촉 지점을 변화시켜 표면 탄성률 측정에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로브 형상과 압입 속도가 유체 잔류에 미치는 영향을 연구하기 위해, 직경 140 nm의 프로브를 사용하여 1 µm/s 및 2 µm/s의 일정한 변위 속도로 레필콘 A CL 샘플에 대한 압입력 곡선을 작성했습니다. 프로브 직경 45 µm, 고정된 힘 설정값 6 nN은 1 µm/s에서 얻어졌습니다. 직경 140 nm 프로브를 사용한 실험은 1 µm/s의 압입 속도와 300 pN의 설정 힘으로 수행되었으며, 이는 상안검의 생리적 접촉 압력 범위(1~8 kPa) 내의 접촉 압력을 생성하도록 선택되었습니다. 압력 72. 1kPa의 압력을 가진 부드러운 PAA 하이드로겔 기성 샘플을 직경 140nm의 프로브를 사용하여 1μm/s의 속도로 50pN의 압입력에 대해 테스트했습니다.
PFQNM-LC-A-CAL 프로브 끝부분의 원뿔형 부분의 길이가 약 500 nm이므로, 500 nm 미만의 모든 압입 깊이에 대해 압입 중 프로브의 기하학적 형태는 원뿔 모양을 유지할 것이라고 안전하게 가정할 수 있습니다. 또한, 시험 대상 재료의 표면은 가역적인 탄성 반응을 보일 것으로 가정하며, 이는 다음 절에서 확인될 것입니다. 따라서, 끝부분의 모양과 크기에 따라, 우리는 AFM 나노압입 실험(NanoScope, Bruker 분리 데이터 분석 소프트웨어)을 처리하기 위해 제조사 소프트웨어에 포함된 Briscoe, Sebastian 및 Adams가 개발한 원뿔-구형 맞춤 모델을 선택했습니다. 이 모델은 구형 꼭지 결함을 가진 원뿔에 대한 힘-변위 관계 F(δ)를 설명합니다. 그림에서, 그림 2는 단단한 원뿔과 구형 팁의 상호 작용 중 접촉 형상을 보여줍니다. 여기서 R은 구형 팁의 반지름, a는 접촉 반지름, b는 구형 팁 끝단의 접촉 반지름, δ는 접촉 반지름/압입 깊이, θ는 원뿔의 반각입니다. 이 프로브의 SEM 이미지는 직경 140nm의 구형 팁이 접선 방향으로 원뿔에 합쳐지는 것을 명확하게 보여주므로, 여기서 b는 R에 의해서만 정의됩니다. 즉, b = R cos θ입니다. 제조사에서 제공하는 소프트웨어는 a > b라는 가정 하에 힘 분리 데이터로부터 영률(E) 값을 계산하기 위한 원뿔-구 관계식을 제공합니다. 관계식:
여기서 F는 압입력, E는 영률, ν는 푸아송 비입니다. 접촉 반경 a는 다음 식을 이용하여 추정할 수 있습니다.
가지 모양의 고분자 브러시 표면층을 가진 레필콘 콘택트렌즈 재질에 구형 끝부분을 가진 단단한 원뿔이 눌러져 접촉하는 기하학적 구조를 나타낸 모식도.
만약 a ≤ b이면, 이 관계는 일반적인 구형 압입기에 대한 방정식으로 축소됩니다.
본 연구에서는 압입 프로브와 PMPC 고분자 브러시의 가지형 구조 간의 상호작용으로 인해 접촉 반경 a가 구형 접촉 반경 b보다 커질 것으로 예상합니다. 따라서 본 연구에서 수행한 모든 탄성 계수 정량 측정에서는 a > b인 경우에 대한 관계식을 사용했습니다.
본 연구에서 조사한 초연질 생체모방 소재는 시료 단면의 주사투과전자현미경(STEM)과 표면의 원자력현미경(AFM)을 이용하여 종합적으로 분석하였다. 이러한 상세한 표면 특성 분석은 이전에 발표한 연구의 연장선상에서 수행되었으며, 해당 연구에서는 PMPC로 개질된 레필콘 A 콘택트렌즈(CL) 표면의 동적으로 분지된 고분자 브러시 구조가 천연 각막 조직과 유사한 기계적 특성을 나타낸다는 것을 확인하였다.14 이러한 이유로 본 연구에서는 콘택트렌즈 표면을 생체모방 소재라고 칭한다.14 그림 3a,b는 각각 레필콘 A CL 기판과 미처리된 SiHy 기판 표면의 분지된 PMPC 고분자 브러시 구조의 단면을 보여준다. 두 시료의 표면은 고해상도 AFM 이미지를 이용하여 추가 분석하였으며, 이는 STEM 분석 결과를 더욱 확증하였다(그림 3c,d). 이러한 이미지들을 종합해 보면, PMPC 분지형 고분자 브러시 구조의 대략적인 길이는 300~400 nm 정도임을 알 수 있는데, 이는 AFM 나노압입 측정 결과를 해석하는 데 매우 중요합니다. 이미지에서 도출된 또 다른 중요한 관찰 결과는 CL 생체모방 재료의 전체 표면 구조가 SiHy 기판 재료의 표면 구조와 형태학적으로 다르다는 것입니다. 이러한 표면 형태의 차이는 AFM 탐침과의 기계적 상호작용 과정에서, 그리고 결과적으로 측정된 탄성 계수 값에서 명확하게 드러납니다.
(a) 레필콘 A CL 및 (b) SiHy 기판의 단면 STEM 이미지. 스케일 바: 500 nm. (c) 레필콘 A CL 기판 표면 및 (d) 기저 SiHy 기판의 AFM 이미지(3 µm × 3 µm).
생체모방 고분자와 고분자 브러시 구조는 본질적으로 부드러우며 다양한 생의학 응용 분야에서 널리 연구되고 사용되어 왔습니다.74,75,76,77 따라서 이러한 물질의 기계적 특성을 정확하고 신뢰할 수 있게 측정할 수 있는 AFM 나노압입법을 사용하는 것이 중요합니다. 그러나 동시에, 극도로 낮은 탄성 계수, 높은 액체 함량, 높은 탄성과 같은 이러한 초연질 물질의 고유한 특성으로 인해 적절한 재질, 모양 및 압입 프로브의 크기를 선택하는 것이 어려운 경우가 많습니다. 이는 압입기가 시료의 부드러운 표면을 뚫고 들어가지 않도록 하는 데 중요하며, 표면과의 접촉점 및 접촉 면적 측정에 오차가 발생할 수 있기 때문입니다.
이를 위해서는 초연질 생체모방 재료(레필콘 A CL)의 형태에 대한 포괄적인 이해가 필수적입니다. 이미징 방법을 사용하여 얻은 분지형 고분자 브러시의 크기와 구조에 대한 정보는 AFM 나노압입 기술을 이용한 표면의 기계적 특성 분석의 기초를 제공합니다. 마이크론 크기의 구형 콜로이드 프로브 대신, 생체 시료의 기계적 특성을 정량적으로 매핑하기 위해 특별히 설계된 팁 직경 140 nm의 PFQNM-LC-A-CAL 질화규소 프로브(Bruker)를 선택했습니다. 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 기존의 콜로이드 프로브에 비해 상대적으로 날카로운 프로브를 사용한 이유는 재료의 구조적 특징으로 설명할 수 있습니다. 그림 3a에 나타낸 CL 레필콘 A 표면의 가지형 고분자 브러시와 프로브 팁 크기(~140 nm)를 비교해 보면, 팁이 이러한 브러시 구조와 직접 접촉할 만큼 충분히 커서 팁이 브러시를 뚫고 지나갈 가능성이 적다는 것을 알 수 있습니다. 이를 설명하기 위해 그림 4에는 레필콘 A CL과 AFM 프로브의 압입 팁을 축척에 맞춰 그린 STEM 이미지가 나와 있습니다.
레필콘 A CL의 STEM 이미지와 ACM 압입 프로브를 보여주는 개략도(실제 크기에 맞춰 그려짐).
또한, 140 nm의 팁 크기는 CP-AFM 나노압입법으로 제조된 폴리머 브러시에서 이전에 보고된 점착 압출 효과의 위험을 방지할 만큼 충분히 작습니다.69,71 이 AFM 팁의 특수한 원뿔-구형 모양과 상대적으로 작은 크기(그림 1)로 인해, 레필콘 A CL 나노압입에 의해 생성된 힘 곡선의 특성은 압입 속도나 하중/하역 속도에 의존하지 않을 것으로 예상됩니다. 따라서 다공탄성 효과의 영향을 받지 않습니다. 이 가설을 검증하기 위해, PFQNM-LC-A-CAL 프로브를 사용하여 레필콘 A CL 샘플을 고정된 최대 힘으로 두 가지 다른 속도로 압입하고, 그 결과로 얻은 인장 및 수축력 곡선을 이용하여 분리 거리(µm)에 대한 힘(nN)을 나타낸 그래프를 그림 5a에 제시했습니다. 하중 및 하중 제거 시 힘 곡선이 완전히 겹치는 것이 분명하며, 그림에서 압입 깊이가 0일 때의 전단력이 압입 속도에 따라 증가한다는 명확한 증거가 없어 개별 브러시 요소가 다공탄성 효과 없이 특성화되었음을 알 수 있습니다. 반면, 동일한 압입 속도에서 직경 45µm의 AFM 프로브의 경우 유체 보유 효과(점성 압출 및 다공탄성 효과)가 분명하게 나타나며, 그림 5b에서 볼 수 있듯이 신장 및 수축 곡선 사이의 히스테리시스로 강조됩니다. 이러한 결과는 가설을 뒷받침하며 직경 140nm 프로브가 이러한 연질 표면의 특성화에 적합한 선택임을 시사합니다.
ACM을 사용한 lehfilcon A CL 압입력 곡선; (a) 직경 140 nm의 프로브를 사용하여 두 가지 하중 속도로 측정한 결과, 표면 압입 시 다공탄성 효과가 나타나지 않음을 보여줍니다. (b) 직경 45 µm 및 140 nm의 프로브를 사용한 결과. 큰 프로브는 작은 프로브에 비해 점성 압출 및 다공탄성 효과를 나타냅니다.
초연질 표면의 특성을 분석하기 위해서는 AFM 나노압입법을 사용할 때 연구 대상 재료의 특성을 가장 잘 연구할 수 있는 최적의 프로브가 필수적입니다. 팁의 모양과 크기뿐만 아니라 AFM 검출기 시스템의 감도, 시험 환경에서의 팁 변형에 대한 감도, 그리고 캔틸레버 강성 또한 나노압입 측정의 정확성과 신뢰성을 결정하는 중요한 요소입니다. 본 연구에서 사용한 AFM 시스템의 위치 감지기(PSD)의 검출 한계는 약 0.5mV이며, 이는 사전 보정된 스프링 상수와 PFQNM-LC-A-CAL 프로브의 유체 변형 감도를 기반으로 계산된 값입니다. 이론적인 하중 감도는 0.1pN 미만입니다. 따라서 이 방법은 주변 잡음 성분 없이 최소 0.1pN 이하의 압입력을 측정할 수 있습니다. 그러나 기계적 진동이나 유체 역학적 특성과 같은 요인들로 인해 AFM 시스템에서 주변 잡음을 이 수준까지 완전히 제거하는 것은 사실상 불가능합니다. 이러한 요인들은 AFM 나노압입법의 전반적인 감도를 제한하고, 약 ≤ 10 pN의 배경 잡음 신호를 발생시킵니다. 표면 특성 분석을 위해, lehfilcon A CL 및 SiHy 기판 샘플을 완전 수화 조건에서 140 nm 프로브를 사용하여 압입하고 SEM 분석을 수행했으며, 얻어진 힘 곡선을 힘(pN)과 압력 사이에 중첩시켰습니다. 분리 거리(µm) 그래프는 그림 6a에 나타냈습니다. SiHy 기판과 비교했을 때, lehfilcon A CL의 힘 곡선은 갈라진 고분자 브러시와의 접촉 지점에서 시작하여 팁이 하부 물질과 접촉하는 지점에서 기울기가 급격하게 변하는 전이 단계를 명확하게 보여줍니다. 힘 곡선의 이러한 전이 부분은 표면의 분지형 고분자 브러시의 진정한 탄성 거동을 강조하며, 이는 압축 곡선이 인장 곡선을 밀접하게 따르는 것과 브러시 구조와 부피가 큰 SiHy 물질 사이의 기계적 특성 차이에서 확인할 수 있습니다. lefilcon과 비교했을 때, PCS의 STEM 이미지(그림 3a)에서 가지형 고분자 브러시의 평균 길이와 그림 3a의 가로축을 따라 나타낸 힘 곡선을 분리하여 보면, 이 방법이 표면 최상단까지 도달하는 브러시 구조의 끝부분과 가지형 고분자를 감지할 수 있음을 알 수 있습니다. 또한, 힘 곡선이 거의 겹치는 것은 액체 잔류 효과가 없음을 나타냅니다. 이 경우 바늘과 시료 표면 사이에 접착력이 전혀 없습니다. 두 시료의 힘 곡선 최상단 부분이 겹치는 것은 기판 재료의 기계적 특성이 유사함을 반영합니다.
(a) 레필콘 A CL 기판 및 SiHy 기판에 대한 AFM 나노압입력 곡선, (b) 배경 잡음 임계값 방법을 사용한 접촉점 추정을 보여주는 힘 곡선.
힘 곡선의 세부 사항을 연구하기 위해, Lehfilcon A CL 샘플의 인장 곡선을 그림 6b에 다시 나타냈으며, y축에는 최대 힘 50 pN을 표시했습니다. 이 그래프는 원래 배경 잡음에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 잡음은 ±10 pN 범위 내에 있으며, 이를 이용하여 접촉점을 정확하게 판별하고 압입 깊이를 계산했습니다. 문헌에 보고된 바와 같이, 접촉점 식별은 탄성률과 같은 재료 특성을 정확하게 평가하는 데 매우 중요합니다.85 힘 곡선 데이터의 자동 처리를 포함하는 접근 방식은 연질 재료에 대해 데이터 피팅과 정량적 측정값 간의 적합도를 향상시키는 것으로 나타났습니다.86 본 연구에서 접촉점 선택은 비교적 간단하고 객관적이지만, 한계가 있습니다. 접촉점 결정에 대한 보수적인 접근 방식은 작은 압입 깊이(< 100 nm)에서 탄성률 값을 약간 과대평가할 수 있습니다. 알고리즘 기반 접촉점 감지 및 자동 데이터 처리를 활용하면 향후 본 연구 방법을 더욱 개선할 수 있을 것입니다. 따라서, ±10 pN 정도의 내재적 배경 잡음에 대해, 그림 6b의 x축에서 10 pN 이상의 값을 갖는 첫 번째 데이터 포인트를 접촉점으로 정의합니다. 그러면, 10 pN의 잡음 임계값에 따라, 약 0.27 µm 높이에 수직선이 그려져 표면과의 접촉점을 나타내며, 이후 기판이 약 270 nm의 압입 깊이에 도달할 때까지 신장 곡선이 이어집니다. 흥미롭게도, 이미징 방법을 사용하여 측정한 가지형 고분자 브러시 구조의 크기(300~400 nm)를 기준으로 할 때, 배경 잡음 임계값 방법을 사용하여 관찰한 CL 레필콘 A 시료의 압입 깊이는 약 270 nm로, STEM으로 측정한 크기와 매우 유사합니다. 이러한 결과는 매우 부드럽고 탄성이 높은 가지형 고분자 브러시 구조의 압입에 있어 AFM 프로브 팁의 모양과 크기가 적합하고 적용 가능하다는 것을 더욱 확증합니다. 또한, 이 데이터는 배경 잡음을 접촉점 위치 파악을 위한 임계값으로 사용하는 본 연구 방법의 타당성을 강력하게 뒷받침합니다. 따라서 수학적 모델링과 힘 곡선 맞춤을 통해 얻은 정량적 결과는 비교적 정확해야 합니다.
AFM 나노압입법을 이용한 정량적 측정은 데이터 선택 및 후속 분석에 사용되는 수학적 모델에 전적으로 의존합니다. 따라서 특정 모델을 선택하기 전에 압입기 선택, 재료 특성 및 이들의 상호작용 메커니즘과 관련된 모든 요소를 ​​고려하는 것이 중요합니다. 본 연구에서는 SEM 현미경 사진(그림 1)을 이용하여 팁 형상을 신중하게 분석했으며, 그 결과, 경질 원뿔형과 구형 팁 형상을 가진 직경 140nm의 AFM 나노압입 프로브가 레필콘 A CL79 시료 분석에 적합한 것으로 판단되었습니다. 또한, 시험 대상 고분자 재료의 탄성도 신중하게 평가해야 할 중요한 요소입니다. 나노압입의 초기 데이터(그림 5a 및 6a)는 인장 및 압축 곡선의 중첩, 즉 재료의 완전한 탄성 회복을 명확하게 보여주지만, 접촉면이 순수한 탄성적 특성을 갖는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해, 완전 수화 조건에서 레필콘 A CL 시료 표면의 동일한 위치에 1 µm/s의 압입 속도로 두 번 연속 압입을 ​​수행했습니다. 그 결과 얻어진 힘 곡선 데이터는 그림 7에 나타냈으며, 예상대로 두 번의 압입에서 나타난 팽창 및 압축 곡선이 거의 동일하여 분지형 고분자 브러시 구조의 높은 탄성을 보여줍니다.
레필콘 A 콘택트렌즈 표면의 동일한 위치에서 측정한 두 개의 압입력 곡선은 렌즈 표면의 이상적인 탄성을 나타냅니다.
프로브 팁과 레필콘 A CL 표면의 SEM 및 STEM 이미지에서 얻은 정보를 바탕으로, 원뿔-구형 모델은 AFM 프로브 팁과 테스트 대상인 연질 고분자 재료 간의 상호작용을 수학적으로 적절하게 표현한 것으로 판단된다. 또한, 이 원뿔-구형 모델에서는 각인된 재료의 탄성 특성에 대한 기본적인 가정이 이 새로운 생체모방 재료에도 적용 가능하며, 이를 이용하여 탄성 계수를 정량화할 수 있다.
AFM 나노압입법 및 그 구성 요소(압입 프로브 특성(형상, 크기 및 스프링 강성), 감도(배경 잡음 및 접촉점 추정), 데이터 피팅 모델(정량적 탄성 계수 측정) 포함)에 대한 종합적인 평가를 수행한 후, 이 방법을 사용하여 시판되는 초연질 시료의 탄성 계수를 측정하고 정량적 결과를 검증했습니다. 탄성 계수가 1 kPa인 시판 폴리아크릴아미드(PAAM) 하이드로겔을 140 nm 프로브를 사용하여 수화 조건에서 측정했습니다. 탄성 계수 측정 및 계산에 대한 자세한 내용은 보충 자료에 제공되어 있습니다. 측정 결과, 평균 탄성 계수는 ​​0.92 kPa였으며, 상대 표준 편차(%RSD)와 알려진 탄성 계수와의 편차율(%)은 10% 미만이었습니다. 이러한 결과는 본 연구에서 사용된 AFM 나노압입법이 초연질 재료의 탄성 계수를 측정하는 데 있어 정확성과 재현성을 입증합니다. 레필콘 A CL 시료와 SiHy 기판의 표면은 동일한 AFM 나노압입법을 사용하여 추가적으로 특성화되었으며, 이를 통해 압입 깊이에 따른 초연질 표면의 겉보기 접촉 탄성률을 연구했습니다. 각 유형의 시료 3개(n=3, 시료당 1회 압입)에 대해 300 pN의 힘, 1 µm/s의 속도, 그리고 완전 수화 조건에서 압입력 분리 곡선을 생성했습니다. 압입력 분배 곡선은 원뿔-구 모델을 사용하여 근사화했습니다. 압입 깊이에 따른 탄성률을 얻기 위해 접촉점에서 시작하여 20 nm 간격으로 40 nm 폭의 힘 곡선 구간을 설정하고, 각 단계에서 탄성률 값을 측정했습니다. (Spin Cy et al.) 유사한 접근 방식을 사용하여 콜로이드 AFM 프로브 나노압입을 통해 폴리(라우릴 메타크릴레이트)(P12MA) 폴리머 브러시의 탄성률 기울기를 특성화했으며, 이는 헤르츠 접촉 모델을 사용한 데이터와 일치합니다. 이 접근 방식은 그림 8에 나타낸 바와 같이 겉보기 접촉 탄성률(kPa) 대 압입 깊이(nm) 그래프를 제공하며, 이는 겉보기 접촉 탄성률/깊이 기울기를 보여줍니다. CL lehfilcon A 샘플의 계산된 탄성률은 샘플 상부 100nm 이내에서 2~3kPa 범위에 있으며, 그 이후에는 깊이에 따라 증가하기 시작합니다. 반면, 표면에 브러시 형태의 필름이 없는 SiHy 기판을 테스트했을 때, 300pN의 힘에서 얻은 최대 압입 깊이는 50nm 미만이며, 데이터에서 얻은 탄성률 값은 약 400kPa로, 벌크 재료의 영률 값과 유사합니다.
원뿔-구형 형상의 AFM 나노압입법을 사용하여 레필콘 A CL 및 SiHy 기판의 겉보기 접촉 탄성률(kPa) 대 압입 깊이(nm) 그래프를 나타낸다.
새로운 생체모방형 분지형 고분자 브러시 구조의 최상부 표면은 극히 낮은 탄성 계수(2~3 kPa)를 나타냅니다. 이는 STEM 이미지에서 보이는 것처럼 갈라진 고분자 브러시의 자유롭게 매달린 끝부분과 일치합니다. CL의 바깥쪽 가장자리에서 탄성 계수 기울기가 나타나는 일부 증거가 있지만, 주요 고탄성 계수 기판의 영향이 더 큽니다. 그러나 표면의 최상단 100 nm는 분지형 고분자 브러시 전체 길이의 20% 이내에 해당하므로, 이 압입 깊이 범위에서 측정된 탄성 계수 값은 비교적 정확하며 하부 물체의 영향에 크게 의존하지 않는다고 가정하는 것이 합리적입니다.
분지형 PMPC 고분자 브러시 구조가 SiHy 기판 표면에 접합된 독특한 생체모방 디자인의 레필콘 A 콘택트렌즈는 기존 측정 방법으로는 표면 구조의 기계적 특성을 정확하게 분석하기가 매우 어렵습니다. 본 연구에서는 높은 수분 함량과 극도로 높은 탄성을 지닌 레필콘 A와 같은 초연질 소재를 정밀하게 분석할 수 있는 첨단 AFM 나노압입법을 제시합니다. 이 방법은 초연질 표면 구조의 크기에 맞춰 프로브의 크기와 형상을 정밀하게 조정한 AFM 프로브를 사용합니다. 프로브와 구조의 크기 조합을 통해 감도를 향상시켜 다공성 탄성 효과에 관계없이 분지형 고분자 브러시 요소의 낮은 탄성률과 고유한 탄성 특성을 측정할 수 있습니다. 실험 결과, 렌즈 표면의 특징인 독특한 분지형 PMPC 고분자 브러시는 수용액 환경에서 테스트했을 때 극도로 낮은 탄성률(최대 2kPa)과 매우 높은 탄성률(거의 100%)을 나타냈습니다. AFM 나노압입 결과는 생체모방 렌즈 표면의 접촉 탄성률/깊이 기울기(30 kPa/200 nm)를 특성화하는 데에도 도움이 되었습니다. 이러한 기울기는 분지형 고분자 브러시와 SiHy 기판 사이의 탄성률 차이, 고분자 브러시의 분지 구조/밀도, 또는 이들의 조합에 기인할 수 있습니다. 그러나 구조와 특성 간의 관계, 특히 브러시 분지가 기계적 특성에 미치는 영향을 완전히 이해하기 위해서는 더 심층적인 연구가 필요합니다. 유사한 측정 방법은 다른 초연질 소재 및 의료 기기의 표면 기계적 특성을 특성화하는 데에도 도움이 될 수 있습니다.
본 연구에서 생성 및/또는 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청이 있을 경우 해당 저자에게서 제공받을 수 있습니다.
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