Nature.com をご利用いただきありがとうございます。ご利用のブラウザは CSS のサポートが制限されています。最適な環境でご利用いただくために、最新のブラウザをご利用いただくか、Internet Explorer の互換モードを無効にしてください。また、継続的なサポートのため、このサイトはスタイルと JavaScript を無効にして表示しています。
3枚のスライドを一度に表示するカルーセルです。「前へ」ボタンと「次へ」ボタンを使って3枚のスライドを一度に切り替えたり、画面下部のスライダーボタンを使って3枚のスライドを一度に切り替えたりできます。
医療機器や生物医学用途向けの新しい超柔軟材料の開発に伴い、その物理的および機械的特性の包括的な評価は重要かつ困難です。改良型原子間力顕微鏡（AFM）ナノインデンテーション技術を用いて、分岐ポリマーブラシ構造の層でコーティングされた新しいlehfilcon A生体模倣シリコーンハイドロゲルコンタクトレンズの極めて低い表面弾性率を評価しました。この方法により、分岐ポリマーに近づく際に粘性押し出しの影響を受けることなく、接触点を正確に特定できます。さらに、多孔弾性の影響を受けることなく、個々のブラシ要素の機械的特性を特定することもできます。これは、柔らかい材料や生物学的サンプルの特性測定に特に適した設計（チップサイズ、形状、バネ定数）のAFMプローブを選択することで実現します。この手法により、非常に柔らかい材料であるレフィルコンAの正確な測定感度と精度が向上します。レフィルコンAは、表面領域での弾性率が極めて低く（最大2 kPa）、内部（ほぼ100%）の水性環境では極めて高い弾性を示します。表面研究の結果は、レフィルコンAレンズの超軟質表面特性を明らかにしただけでなく、分岐ポリマーブラシの弾性率がシリコン-水素基板の弾性率に匹敵することを示しました。この表面特性評価技術は、他の超軟質材料や医療機器にも応用できます。
生体組織と直接接触するように設計された材料の機械的特性は、多くの場合、生物学的環境によって決定されます。これらの材料特性が完全に適合することで、有害な細胞応答を引き起こすことなく、材料の望ましい臨床特性を実現することができます1,2,3。バルク均質材料の場合、標準的な手順と試験方法（例えば、マイクロインデンテーション4,5,6）が利用可能であるため、機械的特性の評価は比較的容易です。しかし、ゲル、ハイドロゲル、バイオポリマー、生細胞などの超軟質材料の場合、測定解像度の限界や一部の材料の不均質性のために、これらの試験方法は一般的に適用できません7。長年にわたり、従来のインデンテーション法は、幅広い軟質材料の特性評価のために改良・適応されてきましたが、多くの方法には依然として重大な欠点があり、その使用が制限されています8,9,10,11,12,13。超軟質材料および表面層の機械的特性を正確かつ確実に評価できる専門的な試験方法の欠如は、様々な用途におけるそれらの使用を著しく制限しています。
以前の研究で、私たちは、眼の角膜表面からヒントを得た潜在的に生体模倣的な設計から生まれた、すべての超柔軟表面特性を備えた柔らかい異種材料であるlehfilcon A（CL）コンタクトレンズを紹介しました。 この生体材料は、医療機器用に設計されたシリコーンハイドロゲル（SiHy）15に、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC））（PMPC）の分岐架橋ポリマー層をグラフトすることによって開発されました。 このグラフトプロセスにより、非常に柔らかく、非常に弾性のある分岐ポリマーブラシ構造からなる層が表面に形成されます。 私たちの以前の研究では、lehfilcon A CLの生体模倣構造により、濡れ性や汚れ防止性の向上、潤滑性の向上、細胞や細菌の付着の低減など、優れた表面特性が得られることが確認されています15,16。 さらに、この生体模倣材料の使用と開発は、他の生物医学機器へのさらなる拡大も示唆しています。したがって、この超柔軟材料の表面特性を評価し、眼との機械的相互作用を理解することは、将来の開発と応用を支える包括的な知識ベースを構築する上で極めて重要です。市販されている SiHy コンタクト レンズのほとんどは、均一な材料構造を形成する親水性ポリマーと疎水性ポリマーの均質な混合物で構成されています17。従来の圧縮、引張、マイクロインデンテーション テスト方法を使用して機械的特性を調査するいくつかの研究が行われてきました18,19,20,21。ただし、lehfilcon A CL の新しい生体模倣設計により、分岐ポリマー ブラシ構造の機械的特性が SiHy ベース基板の機械的特性とは大きく異なる、ユニークな不均質材料となっています。そのため、従来の方法やインデンテーション方法ではこれらの特性を正確に定量化することは非常に困難です。有望な方法としては、原子間力顕微鏡（AFM）に実装されたナノインデンテーション試験法を用いるものがあります。この方法は、生体細胞や組織、軟質ポリマーなどの軟質粘弾性材料の機械的特性の測定に用いられてきました22,23,24,25,26,27,28,29,30。AFMナノインデンテーションでは、ナノインデンテーション試験の基礎技術と最新のAFM技術を組み合わせることで、測定感度が向上し、本質的に超軟質である幅広い材料の試験が可能になります31,32,33,34,35,36。さらに、この技術は、様々な形状のインデンターとプローブの使用、そして様々な液体媒体での試験が可能であることなど、他の重要な利点も提供します。
AFM ナノインデンテーションは、条件付きで 3 つの主要コンポーネントに分けられます。(1) 機器 (センサー、検出器、プローブなど)、(2) 測定パラメーター (力、変位、速度、ランプ サイズなど)、(3) データ処理 (ベースライン補正、タッチ ポイントの推定、データ フィッティング、モデリングなど)。この方法の大きな問題は、AFM ナノインデンテーションを使用した文献の複数の研究で、同じサンプル/セル/材料タイプに対して非常に異なる定量的な結果が報告されていることです37,38,39,40,41。たとえば、Lekka らは、AFM プローブの形状が、機械的に均質なハイドロゲルと不均質な細胞のサンプルの測定されたヤング率に及ぼす影響を調査し、比較しました。彼らは、弾性率の値がカンチレバーの選択とチップの形状に大きく依存し、ピラミッド型のプローブで最高値、球形のプローブで最低値が 42 であると報告しています。ポリアクリルアミド（PAAM）サンプルのインデンター速度、インデンターサイズ、および厚さが、ACM43ナノインデンテーション法で測定されるヤング率にどのように影響するかが示されています。もう一つの複雑な要因は、極めて低弾性率の標準的な試験材料と自由な試験手順が存在しないことです。そのため、信頼性の高い正確な結果を得ることは非常に困難です。しかしながら、この方法は、類似したサンプルタイプ間の相対測定や比較評価には非常に有用であり、例えばAFMナノインデンテーションを用いて正常細胞と癌細胞を区別することができます44, 45。
AFMナノインデンテーションを用いて軟質材料を試験する場合、一般的な目安としては、サンプルの弾性率に近い低いバネ定数（k）と半球形／円形の先端を持つプローブを使用することです。これは、最初のプローブが軟質材料と初めて接触した際にサンプル表面を貫通しないようにするためです。また、プローブによって生成される偏向信号が、レーザー検出器システムで検出できるほど強力であることも重要です24,34,46,47。極めて軟質な異種細胞、組織、ゲルの場合、再現性と信頼性の高い測定を保証するために、プローブとサンプル表面間の接着力を克服することがもう一つの課題です48,49,50。最近まで、AFMナノインデンテーションに関する研究のほとんどは、比較的大きな球形プローブ（一般にコロイドプローブ（CP）と呼ばれる）を用いて、生物学的細胞、組織、ゲル、ハイドロゲル、および生体分子の機械的挙動を研究することに焦点を当てていました。 、47、51、52、53、54、55。これらのチップの半径は1〜50µmで、一般的にホウケイ酸ガラス、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリスチレン（PS）、二酸化ケイ素（SiO2）、ダイヤモンドライクカーボン（DLC）で作られています。 CP-AFMナノインデンテーションは柔らかいサンプルの特性評価の第一選択肢となることが多いですが、独自の問題と限界があります。ミクロンサイズの大きな球状チップを使用すると、チップとサンプルとの総接触面積が大きくなり、空間分解能が大幅に低下します。局所的な要素の機械的特性が広い領域の平均と大きく異なる可能性のある柔らかく不均質な試料の場合、CPインデンテーションにより、局所的なスケールでの特性の不均一性を隠すことができます52。コロイドプローブは通常、エポキシ接着剤を使用してミクロンサイズのコロイド球をチップレスカンチレバーに取り付けることによって作られます。製造プロセス自体には多くの問題が伴い、プローブのキャリブレーションプロセスに不整合が生じる可能性があります。さらに、コロイド粒子のサイズと質量は、共振周波数、バネ剛性、偏向感度といったカンチレバーの主要なキャリブレーションパラメータに直接影響を及ぼします56,57,58。そのため、従来のAFMプローブに一般的に用いられる温度キャリブレーションなどの方法では、CPの正確なキャリブレーションが得られない場合があり、これらの補正を行うには他の方法が必要となる場合があります57, 59, 60, 61。典型的なCPインデンテーション実験では、軟質サンプルの特性を調べるために大きな偏差を持つカンチレバーが用いられますが、比較的大きな偏差におけるカンチレバーの非線形挙動をキャリブレーションする際には、別の問題が発生します62,63,64。現代のコロイドプローブインデンテーション法では、通常、プローブのキャリブレーションに使用するカンチレバーの形状は考慮されますが、コロイド粒子の影響は無視されるため、方法の精度にさらなる不確実性が生じます38,61。同様に、接触モデルフィッティングによって計算される弾性率は、インデンテーションプローブの形状に直接依存し、先端と試料表面特性の不一致が不正確さにつながる可能性があります27, 65, 66, 67, 68。Spencerらによる最近の研究では、CP-AFMナノインデンテーション法を用いて柔らかいポリマーブラシの特性評価を行う際に考慮すべき要因が強調されています。彼らは、ポリマーブラシ内の粘性流体の保持速度の関数として、ヘッド負荷が増加し、速度依存特性の測定値が異なることを報告しています30,69,70,71。
本研究では、改良型AFMナノインデンテーション法を用いて、超柔軟高弾性材料であるlehfilcon A CLの表面弾性率を特性評価した。この材料の特性と新しい構造を考えると、従来のインデンテーション法の感度範囲はこの極めて柔らかい材料の弾性率を特性評価するには明らかに不十分であるため、より高感度でより低感度のAFMナノインデンテーション法を使用する必要があります。既存のコロイドAFMプローブナノインデンテーション技術の欠点と問題点を検討した後、感度、バックグラウンドノイズを排除し、接触点を正確に特定し、液体保持依存性などの柔らかい異種材料の速度弾性率を測定するために、より小型のカスタム設計AFMプローブを選択した理由を示します。そして正確な定量化。さらに、インデンテーションチップの形状と寸法を正確に測定できたため、円錐球フィットモデルを使用して、チップと材料の接触面積を評価することなく弾性率を決定できました。本研究で定量化された2つの暗黙の仮定は、材料の完全弾性特性と、インデンテーション深さに依存しない弾性率です。この方法を用いて、まず弾性率が既知の超軟質材料の標準試料を試験し、その定量化を行いました。次に、この方法を用いて2種類の異なるコンタクトレンズ材料の表面特性を評価しました。AFMナノインデンテーション表面を高感度で評価するこの方法は、医療機器や生物医学用途への応用が期待される、幅広い生体模倣型異種超軟質材料に適用できると期待されます。
ナノインデンテーション実験には、Lehfilcon Aコンタクトレンズ（Alcon、米国テキサス州フォートワース）とそのシリコーンハイドロゲル基板を選択しました。実験では、特別に設計されたレンズマウントを使用しました。テスト用にレンズを取り付けるには、気泡が入らないように注意しながらドーム型のスタンドに置き、端を固定しました。レンズホルダーの上部にある固定具の穴からレンズの光学中心にアクセスでき、液体を保持しながらナノインデンテーション実験を行うことができます。これにより、レンズが完全に水分補給されます。コンタクトレンズ包装溶液500μlをテスト溶液として使用しました。定量結果を検証するために、市販の非活性ポリアクリルアミド（PAAM）ハイドロゲルを、弾性率が1 kPaのポリアクリルアミド-コ-メチレン-ビスアクリルアミド組成物（100 mm Petrisoftペトリ皿、Matrigen、米国カリフォルニア州アーバイン）から調製しました。 AFM ハイドロゲル プローブ インターフェイスに、リン酸緩衝生理食塩水 (Corning Life Sciences、米国マサチューセッツ州テュークスベリーの PBS) を 4 ～ 5 滴 (約 125 µl) と、OPTI-FREE Puremoist コンタクト レンズ ソリューション (Alcon、米国テキサス州ヴォー) を 1 滴使用します。 )。
Lehfilcon A CLおよびSiHy基板のサンプルは、走査透過型電子顕微鏡（STEM）検出器を備えたFEI Quanta 250電界放出走査型電子顕微鏡（FEG SEM）システムを使用して可視化されました。サンプルを準備するには、まずレンズを水で洗浄し、パイ型のくさび形に切断しました。サンプルの親水性成分と疎水性成分の示差コントラストを得るために、RuO4の0.10％安定化溶液を染料として使用し、サンプルを30分間浸漬しました。Lehfilcon A CL RuO4染色は、示差コントラストを向上させるだけでなく、分岐ポリマーブラシの構造を元の形で保存するのにも重要であり、その後、STEM画像で観察できます。次に、エタノール濃度を増加させながら一連のエタノール/水混合液で洗浄し、脱水しました。その後、サンプルはEMBed 812/アラルダイトエポキシで成型され、70℃で一晩硬化しました。樹脂重合によって得られたサンプルブロックはウルトラミクロトームで切断され、得られた薄片は、加速電圧30 kVの低真空モードでSTEM検出器を使用して可視化されました。同じSEMシステムを使用して、PFQNM-LC-A-CAL AFMプローブ（Bruker Nano、米国カリフォルニア州サンタバーバラ）の詳細な特性評価を行いました。AFMプローブのSEM画像は、加速電圧30 kVの一般的な高真空モードで取得されました。AFMプローブの先端の形状とサイズの詳細をすべて記録するために、さまざまな角度と倍率で画像を取得しました。画像内の対象となるすべての先端寸法はデジタルで測定されました。
Dimension FastScan Bio Icon原子間力顕微鏡（Bruker Nano、米国カリフォルニア州サンタバーバラ）の「PeakForce QNM in Fluid」モードを用いて、lehfilcon A CL、SiHy基板、およびPAAmハイドロゲルサンプルの可視化およびナノインデンテーションを行った。イメージング実験では、公称先端半径1 nmのPEAKFORCE-HIRS-FAプローブ（Bruker）を用いて、スキャン速度0.50 Hzでサンプルの高解像度画像を取得した。すべての画像は水溶液中で撮影した。
AFM ナノインデンテーション実験は、PFQNM-LC-A-CAL プローブ (Bruker) を使用して実施しました。AFM プローブは、厚さ 345 nm、長さ 54 µm、幅 4.5 µm の窒化物カンチレバー上にシリコン チップを備え、共振周波数は 45 kHz です。このプローブは、柔らかい生物学的サンプルの特性評価と定量的なナノメカニカル測定を行うために特別に設計されています。センサーは、工場で個別に校正され、スプリング設定も事前に行われています。この研究で使用したプローブのスプリング定数は、0.05～0.1 N/m の範囲でした。チップの形状とサイズを正確に決定するために、SEM を使用してプローブを詳細に特性評価しました。図 1a は、PFQNM-LC-A-CAL プローブの高解像度、低倍率の走査型電子顕微鏡写真で、プローブ設計の全体像を示しています。図 1b は、PFQNM-LC-A-CAL プローブの高解像度、低倍率の走査型電子顕微鏡写真で、プローブ設計の全体像を示しています。図1bは、プローブチップの上部の拡大図を示しており、チップの形状とサイズに関する情報を提供しています。最先端では、針は直径約140 nmの半球状です（図1c）。その下側では、チップは円錐形に先細りし、測定された長さは約500 nmに達します。先細り領域の外側では、チップは円筒形で、チップの全長は1.18 µmで終わります。これがプローブチップの主な機能部分です。さらに、チップ直径45 µm、バネ定数2 N/mの大型球状ポリスチレン（PS）プローブ（Novascan Technologies, Inc.、米国アイオワ州ブーン）もコロイドプローブとしてのテストに使用されました。比較のために、PFQNM-LC-A-CAL 140 nmプローブを使用しました。
ナノインデンテーション中に AFM プローブとポリマー ブラシ構造の間に液体が閉じ込められることがあり、これが実際に表面に接触する前に AFM プローブに上向きの力を加えることが報告されています69。液体保持によるこの粘性押し出し効果により、見かけの接触点が変わり、表面弾性係数の測定に影響を及ぼす可能性があります。プローブの形状とインデント速度が液体保持に及ぼす影響を調べるために、140 nm 径のプローブを使用し、一定の変位速度 1 µm/s および 2 µm/s で、Lehfilcon A CL サンプルのインデント力曲線をプロットしました。プローブ径 45 µm、固定力設定 6 nN、1 µm/s で達成。直径 140 nm のプローブを使用した実験は、1 µm/s のインデント速度、上まぶたの生理的範囲内 (1～8 kPa) の接触圧力を生み出すように選択された 300 pN の設定力で実施しました。圧力72. 直径140 nmのプローブを使用して、圧力1 kPaのPAAハイドロゲルの柔らかい既製サンプルを、速度1 μm/sで50 pNの押し込み力でテストしました。
PFQNM-LC-A-CAL プローブの先端の円錐部分の長さは約 500 nm なので、インデンテーションの深さが 500 nm 未満であれば、インデンテーション中のプローブの形状はその円錐形状に忠実であると想定できます。さらに、試験対象の材料の表面は可逆的な弾性応答を示すと想定されており、これも次のセクションで確認します。したがって、先端の形状とサイズに応じて、Briscoe、Sebastian、および Adams によって開発された円錐球フィッティング モデルを選択しました。このモデルは、ベンダーのソフトウェアで使用でき、AFM ナノインデンテーション実験 (NanoScope) を処理します。分離データ分析ソフトウェア、Bruker) 73。このモデルは、球状の頂点欠陥を持つ円錐の力と変位の関係 F(δ) を表します。図 74図2は、剛体円錐と球状先端の相互作用時の接触形状を示しています。ここで、Rは球状先端の半径、aは接触半径、bは球状先端の先端における接触半径、δは接触半径です。インデント深さ、θは円錐の半角です。このプローブのSEM画像は、直径140 nmの球状先端が接線方向に円錐に融合していることを明確に示しています。したがって、ここでbはRのみによって定義されます。つまり、b = R cos θです。ベンダー提供のソフトウェアは、a > bを仮定して、力の分離データからヤング率（E）値を計算するための円錐球関係を提供します。関係：
ここで、Fは押込み力、Eはヤング率、νはポアソン比である。接触半径aは次式で推定できる。
分岐ポリマー ブラシの表面層を持つ Lefilcon コンタクト レンズの材料に押し付けられた球状の先端を持つ剛性円錐の接触形状の図。
a ≤ b の場合、この関係は従来の球状インデンターの式に簡略化されます。
インデンティングプローブとPMPCポリマーブラシの分岐構造との相互作用により、接触半径aが球面接触半径bよりも大きくなると考えられる。したがって、本研究で実施した弾性率の定量測定では、a > bの場合に得られた依存性を用いた。
本研究で研究した超柔軟生体模倣材料は、試料断面の走査透過型電子顕微鏡 (STEM) と表面の原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して包括的に画像化されました。この詳細な表面特性評価は、以前に発表した研究の延長として実施されました。その研究で、PMPC 改質 lehfilcon A CL 表面の動的に分岐したポリマーブラシ構造は、天然の角膜組織と同様の機械的特性を示すことを明らかにしました 14 。このため、私たちはコンタクトレンズ表面を生体模倣材料 14 と呼んでいます。図 3a、b に、それぞれ lehfilcon A CL 基板と未処理の SiHy 基板表面の分岐 PMPC ポリマーブラシ構造の断面を示します。両試料の表面は高解像度 AFM 画像を使用してさらに分析され、STEM 分析の結果がさらに確認されました (図 3c、d)。これらの画像を総合すると、PMPC分岐ポリマーブラシ構造のおおよその長さが300～400 nmであることが示され、これはAFMナノインデンテーション測定の解釈に極めて重要です。画像から得られたもう一つの重要な観察結果は、CL生体模倣材料の全体的な表面構造がSiHy基板材料のそれとは形態的に異なることです。この表面形態の違いは、インデントAFMプローブとの機械的相互作用によって明らかになり、結果として測定された弾性率値にも反映されます。
(a) lehfilcon A CLおよび(b) SiHy基板の断面STEM像。スケールバーは500 nm。lehfilcon A CL基板(c)およびベースSiHy基板(d)の表面のAFM像（3 µm × 3 µm）。
バイオインスパイアードポリマーとポリマーブラシ構造は本質的に柔らかく、様々な生物医学的用途で広く研究され、利用されてきました74,75,76,77。そのため、その機械的特性を正確かつ確実に測定できるAFMナノインデンテーション法を使用することが重要です。しかし同時に、これらの超軟質材料の極めて低い弾性率、高い液体含有量、高い弾性率などの特有の特性により、適切なインデンティングプローブの材質、形状、サイズの選択が困難になることがよくあります。これは、インデンターがサンプルの柔らかい表面を突き刺さないようにするために重要です。突き刺さると、表面との接触点と接触面積の決定に誤差が生じます。
このためには、超柔軟生体模倣材料（lehfilcon A CL）の形態に関する包括的な理解が不可欠です。イメージング法を用いて得られた分岐ポリマーブラシのサイズと構造に関する情報は、AFMナノインデンテーション法を用いた表面の機械的特性評価の基礎となります。マイクロサイズの球状コロイドプローブの代わりに、先端径140nmのPFQNM-LC-A-CALシリコン窒化物プローブ（Bruker）を選択しました。これは、生物学的サンプル78, 79, 80, 81, 82, 83, 84の機械的特性の定量的マッピング用に特別に設計されています。従来のコロイドプローブと比較して比較的鋭いプローブを使用する理由は、材料の構造的特徴によって説明できます。図3aに示すCL lehfilcon A表面の分岐ポリマーブラシとプローブ先端のサイズ（約140 nm）を比較すると、先端がこれらのブラシ構造に直接接触するのに十分な大きさであるため、先端がブラシ構造を貫通する可能性が低いことがわかります。この点を説明するために、図4は、lehfilcon A CLとAFMプローブのインデント先端のSTEM像（スケールに合わせて描画）を示しています。
Lehfilcon A CL と ACM インデンテーション プローブの STEM 画像を示す概略図 (縮尺どおりに描かれています)。
さらに、140 nm のチップサイズは、CP-AFM ナノインデンテーション法で生成されたポリマーブラシで以前に報告された粘着性押し出し効果のリスクを回避するのに十分に小さいです69,71。この AFM チップの特殊な円錐球形と比較的小さいサイズ (図 1) により、lehfilcon A CL ナノインデンテーションで生成される力の曲線の性質は、インデンテーション速度や負荷/除荷速度に依存しないと考えられます。したがって、多孔弾性効果の影響を受けません。この仮説を検証するために、PFQNM-LC-A-CAL プローブを使用して、lehfilcon A CL サンプルを固定最大力でインデントしましたが、2 つの異なる速度でインデントしました。得られた引張力と収縮力の曲線を使用して、分離 (µm) における力 (nN) をプロットしました (図 5a)。荷重負荷時と除荷時の力曲線が完全に重なり合っていることは明らかであり、図ではインデント深さゼロにおける力のせん断がインデント速度とともに増加するという明確な証拠は見られないことから、個々のブラシ要素は多孔質弾性効果なしに特性評価されたことが示唆されます。対照的に、直径45 µmのAFMプローブでは、同じインデント速度で流体保持効果（粘性押し出し効果と多孔質弾性効果）が明確に見られ、図5bに示すように、伸長曲線と収縮曲線間のヒステリシスによって強調されています。これらの結果は仮説を裏付け、直径140 nmのプローブがこのような柔らかい表面の特性評価に適していることを示唆しています。
ACM を使用した lehfilcon A CL インデンテーション力曲線。(a) 直径 140 nm のプローブを 2 つの荷重速度で使用し、表面インデンテーション中に多孔質弾性効果がないことを示しています。(b) 直径 45 µm および 140 nm のプローブを使用しています。s は、大きいプローブと小さいプローブを比較した場合の粘性押し出しと多孔質弾性の影響を示しています。
超軟質表面の特性評価には、AFM ナノインデンテーション法で、調査対象の材料の特性を調べるための最適なプローブが必要です。チップの形状とサイズに加えて、AFM 検出システムの感度、テスト環境でのチップのたわみに対する感度、およびカンチレバーの剛性が、ナノインデンテーション測定の精度と信頼性を決定する上で重要な役割を果たします。当社の AFM システムでは、位置敏感検出器 (PSD) の検出限界は約 0.5 mV で、事前較正済みのバネ定数と、理論的な荷重感度に対応する PFQNM-LC-A-CAL プローブの計算された流体たわみ感度に基づいています。は 0.1 pN 未満です。したがって、この方法では、周辺ノイズ成分なしで 0.1 pN 未満の最小インデンテーション力を測定できます。ただし、機械的振動や流体力学などの要因により、AFM システムで周辺ノイズをこのレベルまで低減することはほぼ不可能です。これらの要因により、AFM ナノインデンテーション法の全体的な感度が制限され、バックグラウンド ノイズ信号が約 ≤ 10 pN になります。表面特性評価では、SEM 特性評価用の 140 nm プローブを使用して、lehfilcon A CL および SiHy 基板サンプルを完全に水和した状態でインデントし、得られた力曲線を力 (pN) と圧力の間で重ね合わせました。分離プロット (µm) を図 6a に示します。SiHy ベース基板と比較して、lehfilcon A CL の力曲線は、分岐したポリマー ブラシとの接触点で始まり、先端が下にある材料と接触したことを示す急激な傾斜の変化で終わる遷移段階を明確に示しています。力曲線のこの遷移部分は、表面上の分岐ポリマー ブラシの真の弾性挙動を強調しています。これは、圧縮曲線が張力曲線に密接に追従していること、およびブラシ構造とかさばる SiHy 材料との機械的特性の対比によって証明されています。lefilcon を比較する場合。 PCSのSTEM像（図3a）における分岐ポリマーブラシの平均長さと、図3aの横軸に沿った力曲線の分離。図6aは、この方法によって先端と表面の最上部に到達した分岐ポリマーを検出できることを示しています。ブラシ構造間の接触。さらに、力曲線が密接に重なり合っていることから、液体保持効果がないことがわかります。この場合、針とサンプル表面の間には全く接着がありません。2つのサンプルの力曲線の最上部は重なり合っており、これは基板材料の機械的特性の類似性を反映しています。
(a) lehfilcon A CL基板およびSiHy基板のAFMナノインデンテーション力曲線、(b) バックグラウンドノイズ閾値法を使用した接触点推定を示す力曲線。
力曲線のより詳細な情報を調べるために、図6bに、y軸に沿って最大力を50 pNとして、lehfilcon A CLサンプルの張力曲線を再プロットしました。このグラフは、元のバックグラウンドノイズに関する重要な情報を提供します。ノイズは±10 pNの範囲にあり、接触点を正確に特定し、押し込み深さを計算するために使用されます。文献で報告されているように、接触点の特定は、弾性率85などの材料特性を正確に評価するために重要です。力曲線データの自動処理を含むアプローチは、柔らかい材料のデータフィッティングと定量測定の適合性が向上することを示し86ています。本研究では、接触点の選択は比較的単純で客観的ですが、限界があります。接触点を決定するための保守的なアプローチは、より小さな押し込み深さ（< 100 nm）に対して弾性率の値をわずかに過大評価する可能性があります。アルゴリズムベースのタッチポイント検出と自動データ処理の使用は、今後この研究を継続し、方法をさらに改善する上で役立つ可能性があります。したがって、固有のバックグラウンド ノイズが ±10 pN 程度の場合、図 6b の x 軸上の最初のデータ ポイントで値が 10 pN 以上である点を接触点と定義します。次に、10 pN のノイズしきい値に従って、約 0.27 µm のレベルの垂直線が表面との接触点を示し、その後、基板が約 270 nm の押し込み深さに達するまで伸張曲線が続きます。興味深いことに、イメージング法を使用して測定された分岐ポリマー ブラシ特徴のサイズ (300～400 nm) に基づくと、バックグラウンド ノイズしきい値法を使用して観察された CL lehfilcon A サンプルの押し込み深さは約 270 nm であり、これは STEM による測定サイズに非常に近いです。これらの結果は、この非常に柔らかく高弾性の分岐ポリマー ブラシ構造の押し込みに対する AFM プローブ チップの形状とサイズの適合性と適用性をさらに裏付けています。このデータは、接触点を特定するための閾値として背景ノイズを用いるという我々の手法を裏付ける強力な証拠も提供している。したがって、数学的モデリングと力曲線フィッティングから得られる定量的な結果は、比較的正確であると考えられる。
AFMナノインデンテーション法による定量測定は、データ選択とその後の解析に使用される数学モデルに完全に依存します。したがって、特定のモデルを選択する前に、インデンターの選択、材料特性、およびそれらの相互作用のメカニズムに関連するすべての要素を考慮することが重要です。この場合、SEM顕微鏡写真（図1）を使用してチップ形状を慎重に特性評価し、その結果に基づいて、ハードコーンと球形のチップ形状を備えた直径140 nmのAFMナノインデンティングプローブが、lehfilcon A CL79サンプルの特性評価に適した選択肢であることがわかりました。慎重に評価する必要があるもう1つの重要な要素は、試験対象のポリマー材料の弾性です。ナノインデンテーションの初期データ（図5aおよび6a）は、張力曲線と圧縮曲線の重なりの特徴、つまり材料の完全な弾性回復を明確に示していますが、接触の純粋な弾性特性を確認することが非常に重要です。この目的のため、Lehfilcon A CLサンプル表面の同一箇所に、完全水和条件下で1µm/sのインデンテーション速度で2回の連続インデンテーションを実施しました。得られたフォースカーブデータを図7に示します。予想通り、2つのプリントの膨張曲線と圧縮曲線はほぼ一致しており、分岐ポリマーブラシ構造の高い弾性が強調されています。
Lehfilcon A CL の表面の同じ位置にある 2 つの押込み力曲線は、レンズ表面の理想的な弾力性を示しています。
プローブ先端とLehfilcon A CL表面のSEM像およびSTEM像から得られた情報に基づくと、円錐球モデルはAFMプローブ先端と試験対象の軟質ポリマー材料との相互作用を数学的に適切に表現するものである。さらに、この円錐球モデルでは、インプリントされた材料の弾性特性に関する基本的な仮定がこの新しい生体模倣材料にも当てはまり、弾性率の定量化に用いられる。
AFM ナノインデンテーション法と、インデンテーションプローブの特性 (形状、サイズ、バネ剛性)、感度 (バックグラウンドノイズと接触点の推定)、データフィッティングモデル (定量的な弾性率測定) などのコンポーネントを包括的に評価した後、この方法を使用しました。市販の超軟質サンプルを特性評価し、定量的な結果を検証しました。弾性率 1 kPa の市販のポリアクリルアミド (PAAM) ハイドロゲルを、水和条件下で 140 nm プローブを使用してテストしました。弾性率のテストと計算の詳細は、補足情報に記載されています。結果は、測定された平均弾性率が 0.92 kPa であり、既知の弾性率からの %RSD およびパーセンテージ (%) 偏差が 10% 未満であることを示しました。これらの結果により、超軟質材料の弾性率を測定するために本研究で使用した AFM ナノインデンテーション法の精度と再現性が確認できました。 lehfilcon A CLサンプルとSiHyベース基板の表面は、同じAFMナノインデンテーション法を使用してさらに特性評価され、超軟質表面の見かけの接触弾性率をインデントの深さの関数として調べました。インデンテーション力分離曲線は、力300 pN、速度1 µm/s、完全水和で、各タイプの3つの試験片（n = 3、試験片あたり1つのインデント）に対して生成されました。インデンテーション力共有曲線は、円錐球モデルを使用して近似されました。インデントの深さに依存する弾性率を取得するために、接触点から20 nmの増分ごとに力曲線の40 nm幅の部分を設定し、力曲線の各ステップで弾性率の値を計測しました。Spin Cy et al.同様のアプローチが、コロイドAFMプローブナノインデンテーションを用いたポリ(ラウリルメタクリレート)(P12MA)ポリマーブラシの弾性率勾配の特性評価に使用されており、ヘルツ接触モデルを使用したデータと一致しています。 このアプローチは、図8に示すように、見かけの接触弾性率(kPa)と押し込み深さ(nm)のプロットを提供し、見かけの接触弾性率/深さ勾配を示しています。 CL lehfilcon Aサンプルの計算された弾性率は、サンプルの上部100 nm以内では2～3 kPaの範囲にあり、それを超えると深さとともに増加し始めます。 一方、表面にブラシ状のフィルムのないSiHyベース基板をテストする場合、300 pNの力で達成される最大押し込み深さは50 nm未満であり、データから得られた弾性率は約400 kPaであり、これはバルク材料のヤング率の値に匹敵します。
弾性率を測定するために円錐球形状の AFM ナノインデンテーション法を使用した、Lehfilcon A CL および SiHy 基板の見かけ接触弾性率 (kPa) とインデンテーション深さ (nm) の関係。
新規生体模倣分岐ポリマーブラシ構造の最表面は、極めて低い弾性率（2～3 kPa）を示しています。これは、STEM像に示されているように、分岐ポリマーブラシの自由端と一致します。CLの外縁には弾性率の勾配が見られますが、主な高弾性率基板の影響がより顕著です。しかし、表面上部100 nmは分岐ポリマーブラシの全長の20%以内であるため、この押し込み深さ範囲における弾性率の測定値は比較的正確であり、底部物体の影響に大きく依存しないと考えられます。
lehfilcon Aコンタクトレンズは、SiHy基板の表面にグラフトされた分岐PMPCポリマーブラシ構造からなる独自の生体模倣設計のため、従来の測定方法では表面構造の機械的特性を確実に評価することが非常に困難です。本研究では、lefilcon Aなどの高水分含有量と極めて高い弾性率を持つ超軟質材料を正確に評価するための高度なAFMナノインデンテーション法を紹介します。この方法は、インプリントする超軟質表面構造の構造寸法に合わせて先端サイズと形状を慎重に選択したAFMプローブの使用に基づいています。プローブと構造の寸法の組み合わせにより感度が向上し、多孔弾性効果に関わらず、分岐ポリマーブラシ要素の低弾性率と固有の弾性特性を測定できます。結果は、レンズ表面の特徴である独自の分岐PMPCポリマーブラシが、水性環境でテストしたときに極めて低い弾性率（最大2 kPa）と非常に高い弾性率（ほぼ100%）を示すことを示しました。 AFMナノインデンテーションの結果から、生体模倣レンズ表面の見かけの接触弾性率/深さ勾配（30 kPa/200 nm）を特性評価することができました。この勾配は、分岐ポリマーブラシとSiHy基板の弾性率差、ポリマーブラシの分岐構造/密度、あるいはそれらの組み合わせに起因する可能性があります。しかし、構造と特性の関係、特にブラシの分岐が機械的特性に及ぼす影響を完全に理解するには、さらなる詳細な研究が必要です。同様の測定は、他の超軟質材料や医療機器の表面の機械的特性を評価するのに役立ちます。
本研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて各著者から入手できます。
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. and Haugen, HJ. 生体材料表面の物理的・化学的特性に対する生物学的反応. 化学協会. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FMおよびLiu, X. 組織工学のためのヒト由来バイオマテリアルの改良。プログラミング。ポリマー。科学。53, 86 (2016)。
Sadtler, K. 他「再生医療におけるバイオマテリアルの設計、臨床応用、そして免疫応答」National Matt Rev. 1, 16040 (2016)
Oliver WKとFarr GM「荷重と変位測定を用いたインデンテーション実験による硬度と弾性率の測定法の改良」J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM インデンテーション硬度試験の歴史的起源。母校。科学。テクノロジー。28、1028–1044 (2012)。
Broitman, E. マクロ、マイクロ、ナノスケールにおける押込み硬度測定：批評的レビュー. トライブ. ライト. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JDおよびClapperich, SM「表面検出エラーは、軟質材料のナノインデンテーションにおいて弾性率の過大評価につながる」J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR, Yahya M.Yu. 実験的および計算的手法を用いた異種ナノ複合材料の機械的特性測定におけるナノインデンテーション法の評価．The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, Owart, TS「インデンテーションと最適化に基づく逆有限要素解析による軟質粘弾性ゲルの機械的特性評価」J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J, Chaneler D. 適合測定システムを用いた粘弾性測定の最適化．Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. および Pellillo, E. ポリマー表面のナノインデンテーション。J. Physics. D. 物理学への応用。31, 2395 (1998)。
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. and Van Vliet KJ. 衝撃インデンテーションを用いた高弾性ポリマーおよび生物組織の粘弾性機械特性の評価. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV、Kovalev AE、Gorb SN、Borodich FM 拡張Borodich-Galanov（BG）法と深いインデンテーションを使用した軟質材料の弾性率と接着仕事の評価。fur. alma mater. 129、198–213（2019）。
Shi, X. et al. シリコーンハイドロゲルコンタクトレンズの生体模倣ポリマー表面のナノスケール形態と機械的特性. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).