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Con lo sviluppo di nuovi materiali ultra-morbidi per dispositivi medici e applicazioni biomediche, la caratterizzazione completa delle loro proprietà fisiche e meccaniche è tanto importante quanto impegnativa. Una tecnica di nanoindentazione con microscopia a forza atomica (AFM) modificata è stata applicata per caratterizzare il modulo superficiale estremamente basso della nuova lente a contatto biomimetica in idrogel di silicone lehfilcon A rivestita con uno strato di strutture a spazzola polimeriche ramificate. Questo metodo consente la determinazione precisa dei punti di contatto senza gli effetti dell'estrusione viscosa quando si avvicinano ai polimeri ramificati. Inoltre, consente di determinare le caratteristiche meccaniche dei singoli elementi della spazzola senza l'effetto della poroelasticità. Ciò si ottiene selezionando una sonda AFM con un design (dimensione della punta, geometria e rigidità della molla) particolarmente adatto alla misurazione delle proprietà di materiali morbidi e campioni biologici. Questo metodo migliora la sensibilità e l'accuratezza per la misurazione accurata del materiale estremamente morbido lehfilcon A, che presenta un modulo di elasticità superficiale estremamente basso (fino a 2 kPa) e un'elasticità estremamente elevata nell'ambiente acquoso interno (quasi il 100%). I risultati dello studio superficiale non solo hanno rivelato le proprietà superficiali ultra-morbide della lente Lehfilcon A, ma hanno anche dimostrato che il modulo delle spazzole polimeriche ramificate era paragonabile a quello del substrato silicio-idrogeno. Questa tecnica di caratterizzazione superficiale può essere applicata ad altri materiali ultra-morbidi e dispositivi medici.
Le proprietà meccaniche dei materiali progettati per il contatto diretto con i tessuti viventi sono spesso determinate dall'ambiente biologico. La perfetta corrispondenza di queste proprietà del materiale contribuisce a ottenere le caratteristiche cliniche desiderate senza causare risposte cellulari avverse1,2,3. Per i materiali omogenei in massa, la caratterizzazione delle proprietà meccaniche è relativamente semplice grazie alla disponibilità di procedure e metodi di prova standard (ad esempio, microindentazione4,5,6). Tuttavia, per i materiali ultra-morbidi come gel, idrogel, biopolimeri, cellule viventi, ecc., questi metodi di prova non sono generalmente applicabili a causa delle limitazioni di risoluzione delle misurazioni e della disomogeneità di alcuni materiali7. Nel corso degli anni, i metodi di indentazione tradizionali sono stati modificati e adattati per caratterizzare un'ampia gamma di materiali morbidi, ma molti metodi presentano ancora gravi carenze che ne limitano l'utilizzo8,9,10,11,12,13. La mancanza di metodi di prova specializzati in grado di caratterizzare in modo accurato e affidabile le proprietà meccaniche dei materiali super-morbidi e degli strati superficiali ne limita fortemente l'utilizzo in varie applicazioni.
Nel nostro lavoro precedente, abbiamo presentato la lente a contatto lehfilcon A (CL), un materiale eterogeneo morbido con tutte le proprietà superficiali ultra-morbide derivanti da design potenzialmente biomimetici ispirati alla superficie della cornea dell'occhio. Questo biomateriale è stato sviluppato innestando uno strato polimerico ramificato e reticolato di poli(2-metacriloilossietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) su un idrogel di silicone (SiHy) 15 progettato per dispositivi medici basati su. Questo processo di innesto crea uno strato sulla superficie costituito da una struttura polimerica ramificata a spazzola molto morbida e altamente elastica. Il nostro lavoro precedente ha confermato che la struttura biomimetica di lehfilcon A CL offre proprietà superficiali superiori, come una migliore bagnabilità e prevenzione dell'incrostazione, una maggiore lubrificazione e una ridotta adesione cellulare e batterica15,16. Inoltre, l'uso e lo sviluppo di questo materiale biomimetico suggeriscono anche un'ulteriore espansione ad altri dispositivi biomedici. Pertanto, è fondamentale caratterizzare le proprietà superficiali di questo materiale ultra-morbido e comprenderne l'interazione meccanica con l'occhio, al fine di creare una base di conoscenze completa a supporto di sviluppi e applicazioni futuri. La maggior parte delle lenti a contatto in SiHy disponibili in commercio è composta da una miscela omogenea di polimeri idrofili e idrofobi che formano una struttura uniforme17. Sono stati condotti diversi studi per indagarne le proprietà meccaniche utilizzando metodi tradizionali di compressione, trazione e microindentazione18,19,20,21. Tuttavia, il nuovo design biomimetico del lehfilcon A CL lo rende un materiale eterogeneo unico, in cui le proprietà meccaniche delle strutture a spazzola del polimero ramificato differiscono significativamente da quelle del substrato di base in SiHy. Pertanto, è molto difficile quantificare accuratamente queste proprietà utilizzando metodi convenzionali e di indentazione. Un metodo promettente utilizza il metodo di test di nanoindentazione implementato nella microscopia a forza atomica (AFM), un metodo che è stato utilizzato per determinare le proprietà meccaniche di materiali viscoelastici morbidi come cellule e tessuti biologici, nonché polimeri morbidi22,23,24,25, 26,27,28,29,30. Nella nanoindentazione AFM, i fondamenti dei test di nanoindentazione sono combinati con i più recenti progressi nella tecnologia AFM per fornire una maggiore sensibilità di misura e test di un'ampia gamma di materiali intrinsecamente super morbidi31,32,33,34,35,36. Inoltre, la tecnologia offre altri importanti vantaggi attraverso l'uso di diverse geometrie, penetratore e sonda e la possibilità di testare in vari mezzi liquidi.
La nanoindentazione AFM può essere condizionatamente suddivisa in tre componenti principali: (1) apparecchiatura (sensori, rilevatori, sonde, ecc.); (2) parametri di misura (come forza, spostamento, velocità, dimensione della rampa, ecc.); (3) elaborazione dei dati (correzione della linea di base, stima del punto di contatto, adattamento dei dati, modellazione, ecc.). Un problema significativo con questo metodo è che diversi studi in letteratura che utilizzano la nanoindentazione AFM riportano risultati quantitativi molto diversi per lo stesso tipo di campione/cellula/materiale37,38,39,40,41. Ad esempio, Lekka et al. hanno studiato e confrontato l'influenza della geometria della sonda AFM sul modulo di Young misurato di campioni di idrogel meccanicamente omogenei e cellule eterogenee. Essi riportano che i valori del modulo dipendono fortemente dalla selezione del cantilever e dalla forma della punta, con il valore più alto per una sonda piramidale e il valore più basso di 42 per una sonda sferica. Analogamente, Selhuber-Unkel et al. È stato dimostrato come la velocità di penetrazione, le dimensioni dell'indentatore e lo spessore dei campioni di poliacrilammide (PAAM) influenzino il modulo di Young misurato mediante nanoindentazione ACM43. Un altro fattore complicante è la mancanza di materiali di prova standard a modulo estremamente basso e di procedure di prova gratuite. Ciò rende molto difficile ottenere risultati accurati con sicurezza. Tuttavia, il metodo è molto utile per misurazioni relative e valutazioni comparative tra tipi di campioni simili, ad esempio utilizzando la nanoindentazione AFM per distinguere le cellule normali dalle cellule tumorali 44, 45.
Quando si testano materiali morbidi con la nanoindentazione AFM, una regola generale è quella di utilizzare una sonda con una bassa costante elastica (k) che corrisponda il più possibile al modulo elastico del campione e una punta emisferica/rotonda in modo che la prima sonda non perfori le superfici del campione al primo contatto con i materiali morbidi. È inoltre importante che il segnale di deflessione generato dalla sonda sia sufficientemente forte da essere rilevato dal sistema di rilevamento laser24,34,46,47. Nel caso di cellule, tessuti e gel eterogenei ultra-morbidi, un'altra sfida è superare la forza adesiva tra la sonda e la superficie del campione per garantire misurazioni riproducibili e affidabili48,49,50. Fino a poco tempo fa, la maggior parte dei lavori sulla nanoindentazione AFM si è concentrata sullo studio del comportamento meccanico di cellule biologiche, tessuti, gel, idrogel e biomolecole utilizzando sonde sferiche relativamente grandi, comunemente chiamate sonde colloidali (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Queste punte hanno un raggio da 1 a 50 µm e sono comunemente realizzate in vetro borosilicato, polimetilmetacrilato (PMMA), polistirene (PS), biossido di silicio (SiO2) e carbonio simile al diamante (DLC). Sebbene la nanoindentazione CP-AFM sia spesso la prima scelta per la caratterizzazione di campioni morbidi, presenta problemi e limitazioni. L'uso di punte sferiche di grandi dimensioni, dell'ordine dei micron, aumenta l'area di contatto totale della punta con il campione e si traduce in una significativa perdita di risoluzione spaziale. Per campioni morbidi e disomogenei, in cui le proprietà meccaniche degli elementi locali possono differire significativamente dalla media su un'area più ampia, l'indentazione CP può nascondere qualsiasi disomogeneità nelle proprietà su scala locale52. Le sonde colloidali sono in genere realizzate fissando sfere colloidali di dimensioni micrometriche a cantilever senza punta utilizzando adesivi epossidici. Il processo di produzione in sé è irto di numerosi problemi e può portare a incongruenze nel processo di calibrazione della sonda. Inoltre, le dimensioni e la massa delle particelle colloidali influenzano direttamente i principali parametri di calibrazione del cantilever, come la frequenza di risonanza, la rigidità della molla e la sensibilità alla deflessione56,57,58. Pertanto, i metodi comunemente utilizzati per le sonde AFM convenzionali, come la calibrazione della temperatura, potrebbero non fornire una calibrazione accurata per la CP e potrebbero essere necessari altri metodi per eseguire queste correzioni57, 59, 60, 61. I tipici esperimenti di indentazione CP utilizzano cantilever con grandi deviazioni per studiare le proprietà di campioni morbidi, il che crea un ulteriore problema quando si calibra il comportamento non lineare del cantilever a deviazioni relativamente grandi62,63,64. I moderni metodi di indentazione con sonda colloidale solitamente tengono conto della geometria del cantilever utilizzato per calibrare la sonda, ma ignorano l'influenza delle particelle colloidali, il che crea ulteriore incertezza nell'accuratezza del metodo38,61. Analogamente, i moduli elastici calcolati mediante l'adattamento del modello di contatto dipendono direttamente dalla geometria della sonda di indentazione e la mancata corrispondenza tra le caratteristiche della punta e della superficie del campione può portare a imprecisioni27, 65, 66, 67, 68. Alcuni lavori recenti di Spencer et al. evidenziano i fattori da tenere in considerazione quando si caratterizzano spazzole in polimero morbido utilizzando il metodo di nanoindentazione CP-AFM. Hanno riportato che la ritenzione di un fluido viscoso nelle spazzole in polimero in funzione della velocità si traduce in un aumento del carico sulla testa e quindi in diverse misurazioni delle proprietà dipendenti dalla velocità30,69,70,71.
In questo studio, abbiamo caratterizzato il modulo di superficie del materiale ultra-morbido altamente elastico lehfilcon A CL utilizzando un metodo di nanoindentazione AFM modificato. Date le proprietà e la nuova struttura di questo materiale, l'intervallo di sensibilità del metodo di indentazione tradizionale è chiaramente insufficiente per caratterizzare il modulo di questo materiale estremamente morbido, quindi è necessario utilizzare un metodo di nanoindentazione AFM con maggiore e minore sensibilità. Dopo aver esaminato le carenze e i problemi delle attuali tecniche di nanoindentazione con sonda AFM colloidale, mostriamo perché abbiamo scelto una sonda AFM più piccola e progettata su misura per eliminare sensibilità, rumore di fondo, individuare il punto di contatto, misurare il modulo di velocità di materiali eterogenei morbidi, come la dipendenza dalla ritenzione di fluidi, e una quantificazione accurata. Inoltre, siamo stati in grado di misurare con precisione la forma e le dimensioni della punta di indentazione, consentendoci di utilizzare il modello di adattamento cono-sfera per determinare il modulo di elasticità senza valutare l'area di contatto della punta con il materiale. I due presupposti impliciti quantificati in questo lavoro sono le proprietà completamente elastiche del materiale e il modulo indipendente dalla profondità di indentazione. Utilizzando questo metodo, abbiamo prima testato standard ultra-morbidi con un modulo noto per quantificare il metodo, e poi utilizzato questo metodo per caratterizzare le superfici di due diversi materiali per lenti a contatto. Si prevede che questo metodo di caratterizzazione delle superfici di nanoindentazione AFM con maggiore sensibilità sia applicabile a un'ampia gamma di materiali ultra-morbidi eterogenei biomimetici, con potenziale utilizzo in dispositivi medici e applicazioni biomediche.
Per gli esperimenti di nanoindentazione sono state scelte lenti a contatto Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) e i relativi substrati in idrogel di silicone. Nell'esperimento è stato utilizzato un supporto per lenti appositamente progettato. Per installare la lente per i test, è stata posizionata con cura sul supporto a cupola, assicurandosi che non entrassero bolle d'aria, e poi fissata con i bordi. Un foro nella parte superiore del supporto per lenti consente l'accesso al centro ottico della lente per gli esperimenti di nanoindentazione, mantenendo il liquido in posizione. Questo mantiene le lenti completamente idratate. 500 μl di soluzione di confezionamento per lenti a contatto sono stati utilizzati come soluzione di prova. Per verificare i risultati quantitativi, sono stati preparati idrogel di poliacrilammide non attivata (PAAM) disponibili in commercio a partire da una composizione di poliacrilammide-co-metilene-bisacrilammide (piastre Petrisoft da 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, USA), con un modulo elastico noto di 1 kPa. Utilizzare 4-5 gocce (circa 125 µl) di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS di Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) e 1 goccia di soluzione per lenti a contatto OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA). ) all'interfaccia idrogel-sonda AFM.
Campioni di substrati Lehfilcon A CL e SiHy sono stati visualizzati utilizzando un sistema FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM) dotato di un rivelatore Scanning Transmission Electron Microscope (STEM). Per preparare i campioni, le lenti sono state prima lavate con acqua e tagliate in spicchi a forma di torta. Per ottenere un contrasto differenziale tra le componenti idrofile e idrofobiche dei campioni, è stata utilizzata una soluzione stabilizzata allo 0,10% di RuO4 come colorante, in cui i campioni sono stati immersi per 30 minuti. La colorazione con RuO4 del Lehfilcon A CL è importante non solo per ottenere un migliore contrasto differenziale, ma aiuta anche a preservare la struttura dei pennelli polimerici ramificati nella loro forma originale, che sono quindi visibili nelle immagini STEM. Sono stati quindi lavati e disidratati in una serie di miscele etanolo/acqua con concentrazione crescente di etanolo. I campioni sono stati quindi colati con resina epossidica EMBed 812/Araldite, che è stata polimerizzata per una notte a 70 °C. Blocchi di campione ottenuti mediante polimerizzazione di resina sono stati tagliati con un ultramicrotomo e le sezioni sottili risultanti sono state visualizzate con un rivelatore STEM in modalità a basso vuoto a una tensione di accelerazione di 30 kV. Lo stesso sistema SEM è stato utilizzato per la caratterizzazione dettagliata della sonda AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). Le immagini SEM della sonda AFM sono state ottenute in una tipica modalità ad alto vuoto con una tensione di accelerazione di 30 kV. Acquisire immagini a diverse angolazioni e ingrandimenti per registrare tutti i dettagli della forma e delle dimensioni della punta della sonda AFM. Tutte le dimensioni della punta di interesse nelle immagini sono state misurate digitalmente.
Un microscopio a forza atomica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) con modalità "PeakForce QNM in Fluid" è stato utilizzato per visualizzare e nanoindentare campioni di lehfilcon A CL, substrato SiHy e idrogel PAAm. Per gli esperimenti di imaging, è stata utilizzata una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) con un raggio nominale della punta di 1 nm per acquisire immagini ad alta risoluzione del campione a una velocità di scansione di 0,50 Hz. Tutte le immagini sono state acquisite in soluzione acquosa.
Gli esperimenti di nanoindentazione AFM sono stati condotti utilizzando una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). La sonda AFM ha una punta in silicio su un cantilever in nitruro di 345 nm di spessore, 54 µm di lunghezza e 4,5 µm di larghezza con una frequenza di risonanza di 45 kHz. È specificamente progettata per caratterizzare ed eseguire misurazioni nanomeccaniche quantitative su campioni biologici morbidi. I sensori sono calibrati individualmente in fabbrica con impostazioni di molla pre-calibrate. Le costanti elastiche delle sonde utilizzate in questo studio erano comprese tra 0,05 e 0,1 N/m. Per determinare con precisione la forma e le dimensioni della punta, la sonda è stata caratterizzata in dettaglio utilizzando il microscopio elettronico a scansione (SEM). Nella figura 1a è mostrata una micrografia elettronica a scansione ad alta risoluzione e basso ingrandimento della sonda PFQNM-LC-A-CAL, che fornisce una visione olistica del design della sonda. Nella figura 1b è mostrata una vista ingrandita della parte superiore della punta della sonda, che fornisce informazioni sulla forma e le dimensioni della punta. All'estremità, l'ago è un emisfero di circa 140 nm di diametro (Fig. 1c). Al di sotto di questo, la punta si assottiglia in una forma conica, raggiungendo una lunghezza misurata di circa 500 nm. Al di fuori della zona di assottigliamento, la punta è cilindrica e termina con una lunghezza totale di 1,18 µm. Questa è la parte funzionale principale della punta della sonda. Inoltre, è stata utilizzata anche una grande sonda sferica in polistirene (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) con un diametro della punta di 45 µm e una costante elastica di 2 N/m per i test come sonda colloidale, con sonda PFQNM-LC-A-CAL da 140 nm per confronto.
È stato riportato che il liquido può rimanere intrappolato tra la sonda AFM e la struttura a spazzola polimerica durante la nanoindentazione, esercitando una forza verso l'alto sulla sonda AFM prima che tocchi effettivamente la superficie69. Questo effetto di estrusione viscosa dovuto alla ritenzione di fluido può modificare il punto di contatto apparente, influenzando così le misurazioni del modulo superficiale. Per studiare l'effetto della geometria della sonda e della velocità di indentazione sulla ritenzione di fluido, sono state tracciate curve di forza di indentazione per campioni di lehfilcon A CL utilizzando una sonda di 140 nm di diametro a velocità di spostamento costanti di 1 µm/s e 2 µm/s. Diametro della sonda 45 µm, impostazione di forza fissa 6 nN ottenuta a 1 µm/s. Sono stati condotti esperimenti con una sonda di 140 nm di diametro a una velocità di indentazione di 1 µm/s e una forza di impostazione di 300 pN, scelta per creare una pressione di contatto entro l'intervallo fisiologico (1–8 kPa) della palpebra superiore. pressione 72. Campioni morbidi pronti all'uso di idrogel PAA con una pressione di 1 kPa sono stati testati per una forza di indentazione di 50 pN a una velocità di 1 μm/s utilizzando una sonda con un diametro di 140 nm.
Poiché la lunghezza della parte conica della punta della sonda PFQNM-LC-A-CAL è di circa 500 nm, per qualsiasi profondità di indentazione < 500 nm si può tranquillamente presumere che la geometria della sonda durante l'indentazione rimarrà fedele alla sua forma conica. Inoltre, si presume che la superficie del materiale in esame presenti una risposta elastica reversibile, che sarà confermata anche nelle sezioni seguenti. Pertanto, a seconda della forma e delle dimensioni della punta, abbiamo scelto il modello di adattamento cono-sfera sviluppato da Briscoe, Sebastian e Adams, disponibile nel software del fornitore, per elaborare i nostri esperimenti di nanoindentazione AFM (NanoScope). Software di analisi dei dati di separazione, Bruker) 73. Il modello descrive la relazione forza-spostamento F(δ) per un cono con un difetto sferico all'apice. In fig. La Figura 2 mostra la geometria del contatto durante l'interazione di un cono rigido con una punta sferica, dove R è il raggio della punta sferica, a è il raggio di contatto, b è il raggio di contatto all'estremità della punta sferica, δ è il raggio di contatto. Profondità di indentazione, θ è il semiangolo del cono. L'immagine SEM di questa sonda mostra chiaramente che la punta sferica di 140 nm di diametro si fonde tangenzialmente in un cono, quindi qui b è definito solo tramite R, ovvero b = R cos θ. Il software fornito dal produttore fornisce una relazione cono-sfera per calcolare i valori del modulo di Young (E) dai dati di separazione delle forze, assumendo a > b. Relazione:
dove F è la forza di indentazione, E è il modulo di Young, ν è il coefficiente di Poisson. Il raggio di contatto a può essere stimato utilizzando:
Schema della geometria di contatto di un cono rigido con punta sferica pressata nel materiale di una lente a contatto Lefilcon con uno strato superficiale di spazzole polimeriche ramificate.
Se a ≤ b, la relazione si riduce all'equazione per un penetratore sferico convenzionale;
Riteniamo che l'interazione della sonda di indentazione con la struttura ramificata della spazzola in polimero PMPC farà sì che il raggio di contatto a sia maggiore del raggio di contatto sferico b. Pertanto, per tutte le misurazioni quantitative del modulo elastico eseguite in questo studio, abbiamo utilizzato la dipendenza ottenuta per il caso a > b.
I materiali biomimetici ultramorbidi studiati in questo studio sono stati sottoposti a imaging completo utilizzando la microscopia elettronica a scansione a trasmissione (STEM) della sezione trasversale del campione e la microscopia a forza atomica (AFM) della superficie. Questa caratterizzazione dettagliata della superficie è stata eseguita come estensione del nostro lavoro precedentemente pubblicato, in cui abbiamo determinato che la struttura a spazzola polimerica ramificata dinamicamente della superficie del lehfilcon A CL modificato con PMPC mostrava proprietà meccaniche simili al tessuto corneale nativo 14 . Per questo motivo, ci riferiamo alle superfici delle lenti a contatto come materiali biomimetici 14 . Le figure 3a e 3b mostrano sezioni trasversali di strutture a spazzola polimeriche ramificate in PMPC sulla superficie di un substrato di lehfilcon A CL e di un substrato di SiHy non trattato, rispettivamente. Le superfici di entrambi i campioni sono state ulteriormente analizzate utilizzando immagini AFM ad alta risoluzione, che hanno ulteriormente confermato i risultati dell'analisi STEM (Fig. 3c, d). Nel complesso, queste immagini forniscono una lunghezza approssimativa della struttura a spazzola del polimero ramificato PMPC a 300-400 nm, fondamentale per l'interpretazione delle misurazioni di nanoindentazione AFM. Un'altra osservazione chiave derivata dalle immagini è che la struttura superficiale complessiva del materiale biomimetico CL è morfologicamente diversa da quella del substrato SiHy. Questa differenza nella morfologia superficiale può diventare evidente durante l'interazione meccanica con la sonda AFM di indentazione e successivamente nei valori del modulo misurati.
Immagini STEM in sezione trasversale di (a) lehfilcon A CL e (b) substrato SiHy. Barra di scala, 500 nm. Immagini AFM della superficie del substrato lehfilcon A CL (c) e del substrato base SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
I polimeri bioispirati e le strutture a spazzola polimerica sono intrinsecamente morbidi e sono stati ampiamente studiati e utilizzati in varie applicazioni biomediche74,75,76,77. Pertanto, è importante utilizzare il metodo di nanoindentazione AFM, che può misurarne accuratamente e in modo affidabile le proprietà meccaniche. Allo stesso tempo, tuttavia, le proprietà uniche di questi materiali ultra-morbidi, come il modulo elastico estremamente basso, l'elevato contenuto di liquido e l'elevata elasticità, rendono spesso difficile la scelta del materiale, della forma e delle dimensioni della sonda di indentazione. Questo è importante affinché l'indentatore non perfori la superficie morbida del campione, il che comporterebbe errori nella determinazione del punto di contatto con la superficie e dell'area di contatto.
Per questo, è essenziale una comprensione completa della morfologia dei materiali biomimetici ultra-morbidi (lehfilcon A CL). Le informazioni sulle dimensioni e sulla struttura delle spazzole polimeriche ramificate ottenute utilizzando il metodo di imaging forniscono la base per la caratterizzazione meccanica della superficie mediante tecniche di nanoindentazione AFM. Invece di sonde colloidali sferiche di dimensioni micrometriche, abbiamo scelto la sonda in nitruro di silicio PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) con un diametro della punta di 140 nm, appositamente progettata per la mappatura quantitativa delle proprietà meccaniche di campioni biologici 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. La logica dell'utilizzo di sonde relativamente affilate rispetto alle sonde colloidali convenzionali può essere spiegata dalle caratteristiche strutturali del materiale. Confrontando le dimensioni della punta della sonda (~140 nm) con le spazzole polimeriche ramificate sulla superficie del CL lehfilcon A, mostrate in Fig. 3a, si può concludere che la punta è sufficientemente grande da entrare in contatto diretto con queste strutture a spazzola, il che riduce la possibilità che la punta le perfori. Per illustrare questo punto, in Fig. 4 è mostrata un'immagine STEM del CL lehfilcon A e della punta di indentatura della sonda AFM (disegnata in scala).
Schema che mostra l'immagine STEM del lehfilcon A CL e una sonda di indentazione ACM (disegnata in scala).
Inoltre, la dimensione della punta di 140 nm è sufficientemente piccola da evitare il rischio di effetti di estrusione appiccicosa precedentemente segnalati per le spazzole polimeriche prodotte con il metodo di nanoindentazione CP-AFM69,71. Supponiamo che, a causa della speciale forma cono-sferica e delle dimensioni relativamente ridotte di questa punta AFM (Fig. 1), la natura della curva di forza generata dalla nanoindentazione di lehfilcon A CL non dipenda dalla velocità di indentazione o dalla velocità di carico/scarico. Pertanto, non è influenzata da effetti poroelastici. Per verificare questa ipotesi, i campioni di lehfilcon A CL sono stati indentati a una forza massima fissa utilizzando una sonda PFQNM-LC-A-CAL, ma a due velocità diverse, e le curve di forza di trazione e di retrazione risultanti sono state utilizzate per tracciare la forza (nN) in separazione (µm) mostrata in Figura 5a. È chiaro che le curve di forza durante il carico e lo scarico si sovrappongono completamente e non vi è alcuna chiara evidenza che la forza di taglio a profondità di indentazione zero aumenti con la velocità di indentazione nella figura, suggerendo che i singoli elementi della spazzola siano stati caratterizzati senza un effetto poroelastico. Al contrario, gli effetti di ritenzione del fluido (effetti di estrusione viscosa e poroelasticità) sono evidenti per la sonda AFM da 45 µm di diametro alla stessa velocità di indentazione e sono evidenziati dall'isteresi tra le curve di allungamento e retrazione, come mostrato in Figura 5b. Questi risultati supportano l'ipotesi e suggeriscono che le sonde da 140 nm di diametro siano una buona scelta per caratterizzare tali superfici morbide.
Curve di forza di indentazione lehfilcon A CL utilizzando ACM; (a) utilizzando una sonda con un diametro di 140 nm a due velocità di carico, dimostrando l'assenza di un effetto poroelastico durante l'indentazione superficiale; (b) utilizzando sonde con un diametro di 45 µm e 140 nm. mostrano gli effetti dell'estrusione viscosa e della poroelasticità per sonde di grandi dimensioni rispetto a sonde più piccole.
Per caratterizzare le superfici ultramorbide, i metodi di nanoindentazione AFM devono disporre della sonda più adatta per studiare le proprietà del materiale in esame. Oltre alla forma e alle dimensioni della punta, la sensibilità del sistema di rilevamento AFM, la sensibilità alla deflessione della punta nell'ambiente di prova e la rigidità del cantilever svolgono un ruolo importante nel determinare l'accuratezza e l'affidabilità delle misurazioni di nanoindentazione. Per il nostro sistema AFM, il limite di rilevamento del rilevatore sensibile alla posizione (PSD) è di circa 0,5 mV e si basa sulla rigidità della molla pre-calibrata e sulla sensibilità di deflessione del fluido calcolata dalla sonda PFQNM-LC-A-CAL, che corrisponde alla sensibilità teorica al carico. è inferiore a 0,1 pN. Pertanto, questo metodo consente la misurazione di una forza di indentazione minima ≤ 0,1 pN senza alcuna componente di rumore periferico. Tuttavia, è quasi impossibile per un sistema AFM ridurre il rumore periferico a questo livello a causa di fattori quali le vibrazioni meccaniche e la fluidodinamica. Questi fattori limitano la sensibilità complessiva del metodo di nanoindentazione AFM e determinano anche un segnale di rumore di fondo di circa ≤ 10 pN. Per la caratterizzazione superficiale, i campioni di substrato di lehfilcon A CL e SiHy sono stati indentati in condizioni di completa idratazione utilizzando una sonda da 140 nm per la caratterizzazione SEM e le curve di forza risultanti sono state sovrapposte tra forza (pN) e pressione. Il grafico di separazione (µm) è mostrato in Figura 6a. Rispetto al substrato di base SiHy, la curva di forza di lehfilcon A CL mostra chiaramente una fase di transizione che inizia nel punto di contatto con la spazzola polimerica biforcuta e termina con una brusca variazione della pendenza che marca il contatto della punta con il materiale sottostante. Questa parte di transizione della curva di forza evidenzia il comportamento realmente elastico della spazzola polimerica ramificata sulla superficie, come evidenziato dalla curva di compressione che segue da vicino la curva di tensione e dal contrasto nelle proprietà meccaniche tra la struttura della spazzola e il materiale SiHy voluminoso. Confrontando lefilcon. La separazione della lunghezza media di una spazzola polimerica ramificata nell'immagine STEM del PCS (Fig. 3a) e la sua curva di forza lungo l'ascissa in Fig. 3a. 6a mostra che il metodo è in grado di rilevare la punta e il polimero ramificato che raggiungono la sommità della superficie. Contatto tra le strutture della spazzola. Inoltre, la stretta sovrapposizione delle curve di forza indica l'assenza di effetto di ritenzione del liquido. In questo caso, non vi è alcuna adesione tra l'ago e la superficie del campione. Le sezioni superiori delle curve di forza per i due campioni si sovrappongono, riflettendo la somiglianza delle proprietà meccaniche dei materiali del substrato.
(a) Curve di forza di nanoindentazione AFM per substrati lehfilcon A CL e substrati SiHy, (b) curve di forza che mostrano la stima del punto di contatto utilizzando il metodo della soglia del rumore di fondo.
Per studiare i dettagli più fini della curva di forza, la curva di tensione del campione di lehfilcon A CL viene ritracciata in Figura 6b con una forza massima di 50 pN lungo l'asse y. Questo grafico fornisce informazioni importanti sul rumore di fondo originale. Il rumore è compreso nell'intervallo di ±10 pN, che viene utilizzato per determinare con precisione il punto di contatto e calcolare la profondità di indentazione. Come riportato in letteratura, l'identificazione dei punti di contatto è fondamentale per valutare accuratamente le proprietà dei materiali come il modulo85. Un approccio che prevede l'elaborazione automatica dei dati della curva di forza ha mostrato un migliore adattamento tra l'adattamento dei dati e le misurazioni quantitative per materiali morbidi86. In questo lavoro, la nostra scelta dei punti di contatto è relativamente semplice e oggettiva, ma presenta i suoi limiti. Il nostro approccio conservativo alla determinazione del punto di contatto può comportare valori di modulo leggermente sovrastimati per profondità di indentazione inferiori (< 100 nm). L'uso del rilevamento dei punti di contatto basato su algoritmi e dell'elaborazione automatica dei dati potrebbe rappresentare una continuazione di questo lavoro in futuro per migliorare ulteriormente il nostro metodo. Pertanto, per un rumore di fondo intrinseco dell'ordine di ±10 pN, definiamo il punto di contatto come il primo punto dati sull'asse x nella Figura 6b con un valore ≥10 pN. Quindi, in base alla soglia di rumore di 10 pN, una linea verticale a livello di ~0,27 µm segna il punto di contatto con la superficie, dopodiché la curva di stiramento continua fino a quando il substrato incontra la profondità di indentazione di ~270 nm. È interessante notare che, in base alle dimensioni delle caratteristiche della spazzola polimerica ramificata (300-400 nm) misurate utilizzando il metodo di imaging, la profondità di indentazione del campione di CL lehfilcon A osservato utilizzando il metodo della soglia del rumore di fondo è di circa 270 nm, che è molto vicina alla dimensione di misurazione con STEM. Questi risultati confermano ulteriormente la compatibilità e l'applicabilità della forma e delle dimensioni della punta della sonda AFM per l'indentazione di questa struttura a spazzola polimerica ramificata molto morbida e altamente elastica. Questi dati forniscono anche solide prove a supporto del nostro metodo di utilizzo del rumore di fondo come soglia per l'individuazione dei punti di contatto. Pertanto, qualsiasi risultato quantitativo ottenuto dalla modellazione matematica e dall'adattamento della curva di forza dovrebbe essere relativamente accurato.
Le misurazioni quantitative mediante metodi di nanoindentazione AFM dipendono completamente dai modelli matematici utilizzati per la selezione dei dati e la successiva analisi. Pertanto, è importante considerare tutti i fattori relativi alla scelta dell'indentatore, alle proprietà del materiale e alla meccanica della loro interazione prima di scegliere un modello specifico. In questo caso, la geometria della punta è stata accuratamente caratterizzata utilizzando micrografie SEM (Fig. 1) e, in base ai risultati, la sonda di nanoindentazione AFM da 140 nm di diametro con un cono rigido e una geometria della punta sferica è una buona scelta per caratterizzare i campioni di lehfilcon A CL79. Un altro fattore importante che deve essere attentamente valutato è l'elasticità del materiale polimerico in esame. Sebbene i dati iniziali di nanoindentazione (Fig. 5a e 6a) delineino chiaramente le caratteristiche della sovrapposizione delle curve di tensione e compressione, ovvero il completo recupero elastico del materiale, è estremamente importante confermare la natura puramente elastica dei contatti. A tal fine, sono state eseguite due indentazioni successive nello stesso punto sulla superficie del campione di lehfilcon A CL a una velocità di indentazione di 1 µm/s in condizioni di piena idratazione. I dati della curva di forza risultante sono mostrati in figura 7 e, come previsto, le curve di espansione e compressione delle due impronte sono pressoché identiche, evidenziando l'elevata elasticità della struttura ramificata del pennello polimerico.
Due curve della forza di indentazione nello stesso punto sulla superficie del lehfilcon A CL indicano l'elasticità ideale della superficie della lente.
Sulla base delle informazioni ottenute dalle immagini SEM e STEM rispettivamente della punta della sonda e della superficie del CL di lehfilcon A, il modello cono-sfera è una rappresentazione matematica ragionevole dell'interazione tra la punta della sonda AFM e il materiale polimerico morbido in fase di test. Inoltre, per questo modello cono-sfera, le ipotesi fondamentali sulle proprietà elastiche del materiale impresso sono valide anche per questo nuovo materiale biomimetico e vengono utilizzate per quantificare il modulo elastico.
Dopo una valutazione completa del metodo di nanoindentazione AFM e dei suoi componenti, tra cui le proprietà della sonda di indentazione (forma, dimensione e rigidità della molla), la sensibilità (rumore di fondo e stima del punto di contatto) e i modelli di adattamento dei dati (misurazioni quantitative del modulo), il metodo è stato utilizzato per caratterizzare campioni ultra-morbidi disponibili in commercio per verificare i risultati quantitativi. Un idrogel di poliacrilammide (PAAM) commerciale con un modulo elastico di 1 kPa è stato testato in condizioni di idratazione utilizzando una sonda da 140 nm. I dettagli dei test e dei calcoli del modulo sono forniti nelle Informazioni Supplementari. I risultati hanno mostrato che il modulo medio misurato era di 0,92 kPa e che la deviazione %RSD e percentuale (%) dal modulo noto erano inferiori al 10%. Questi risultati confermano l'accuratezza e la riproducibilità del metodo di nanoindentazione AFM utilizzato in questo lavoro per misurare i moduli dei materiali ultra-morbidi. Le superfici dei campioni di lehfilcon A CL e del substrato di base SiHy sono state ulteriormente caratterizzate utilizzando lo stesso metodo di nanoindentazione AFM per studiare il modulo di contatto apparente della superficie ultrasoffice in funzione della profondità di indentazione. Curve di separazione della forza di indentazione sono state generate per tre campioni di ciascun tipo (n = 3; una indentazione per campione) a una forza di 300 pN, una velocità di 1 µm/s e idratazione completa. La curva di condivisione della forza di indentazione è stata approssimata utilizzando un modello cono-sfera. Per ottenere il modulo dipendente dalla profondità di indentazione, una porzione di 40 nm di larghezza della curva di forza è stata impostata a ogni incremento di 20 nm a partire dal punto di contatto e i valori del modulo sono stati misurati a ogni passo della curva di forza. Spin Cy et al. Un approccio simile è stato utilizzato per caratterizzare il gradiente di modulo di spazzole polimeriche in poli(laurilmetacrilato) (P12MA) utilizzando la nanoindentazione con sonda AFM colloidale, e i risultati sono coerenti con i dati ottenuti utilizzando il modello di contatto di Hertz. Questo approccio fornisce un grafico del modulo di contatto apparente (kPa) in funzione della profondità di indentazione (nm), come mostrato in Figura 8, che illustra il gradiente modulo di contatto apparente/profondità. Il modulo elastico calcolato del campione di CL lehfilcon A è compreso tra 2 e 3 kPa entro i primi 100 nm del campione, oltre i quali inizia ad aumentare con la profondità. D'altra parte, testando il substrato di base SiHy senza un film a pennello sulla superficie, la profondità di indentazione massima raggiunta con una forza di 300 pN è inferiore a 50 nm e il valore del modulo ottenuto dai dati è di circa 400 kPa, che è paragonabile ai valori del modulo di Young per materiali sfusi.
Modulo di contatto apparente (kPa) rispetto alla profondità di indentazione (nm) per substrati lehfilcon A CL e SiHy utilizzando il metodo di nanoindentazione AFM con geometria cono-sfera per misurare il modulo.
La superficie superiore della nuova struttura a spazzola polimerica ramificata biomimetica presenta un modulo di elasticità estremamente basso (2-3 kPa). Questo corrisponde all'estremità libera della spazzola polimerica biforcuta, come mostrato nell'immagine STEM. Sebbene vi siano alcune prove di un gradiente di modulo sul bordo esterno del CL, il substrato principale ad alto modulo è più influente. Tuttavia, i primi 100 nm della superficie rientrano nel 20% della lunghezza totale della spazzola polimerica ramificata, quindi è ragionevole supporre che i valori misurati del modulo in questo intervallo di profondità di indentazione siano relativamente accurati e non dipendano fortemente dall'effetto dell'oggetto inferiore.
A causa dell'esclusivo design biomimetico delle lenti a contatto in lefilcon A, costituite da strutture a spazzola in polimero PMPC ramificato innestate sulla superficie di substrati SiHy, è molto difficile caratterizzare in modo affidabile le proprietà meccaniche delle loro strutture superficiali utilizzando metodi di misurazione tradizionali. In questo articolo presentiamo un metodo avanzato di nanoindentazione AFM per caratterizzare accuratamente materiali ultra-morbidi come il lefilcon A, ad alto contenuto d'acqua e con un'elasticità estremamente elevata. Questo metodo si basa sull'utilizzo di una sonda AFM la cui dimensione della punta e geometria sono accuratamente scelte per adattarsi alle dimensioni strutturali delle caratteristiche superficiali ultra-morbide da imprimere. Questa combinazione di dimensioni tra sonda e struttura fornisce una maggiore sensibilità, consentendoci di misurare il basso modulo e le proprietà elastiche intrinseche degli elementi a spazzola in polimero ramificato, indipendentemente dagli effetti poroelastici. I risultati hanno mostrato che le esclusive spazzole in polimero PMPC ramificato caratteristiche della superficie della lente presentavano un modulo elastico estremamente basso (fino a 2 kPa) e un'elasticità molto elevata (quasi il 100%) quando testate in ambiente acquoso. I risultati della nanoindentazione AFM ci hanno anche permesso di caratterizzare il gradiente apparente modulo di contatto/profondità (30 kPa/200 nm) della superficie della lente biomimetica. Questo gradiente potrebbe essere dovuto alla differenza di modulo tra le spazzole polimeriche ramificate e il substrato SiHy, o alla struttura ramificata/densità delle spazzole polimeriche, o a una combinazione di questi fattori. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi approfonditi per comprendere appieno la relazione tra struttura e proprietà, in particolare l'effetto della ramificazione delle spazzole sulle proprietà meccaniche. Misurazioni simili possono aiutare a caratterizzare le proprietà meccaniche della superficie di altri materiali ultra-morbidi e dispositivi medici.
I set di dati generati e/o analizzati durante lo studio attuale sono disponibili presso i rispettivi autori su richiesta ragionevole.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. e Haugen, HJ Reazioni biologiche alle proprietà fisiche e chimiche delle superfici dei biomateriali. Chemical Society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM e Liu, X. Miglioramento dei biomateriali di origine umana per l'ingegneria tissutale. programmazione. polimero. la scienza. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Progettazione, implementazione clinica e risposta immunitaria di biomateriali nella medicina rigenerativa. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK e Farr GM Un metodo migliorato per determinare la durezza e il modulo elastico utilizzando esperimenti di indentazione con misurazioni di carico e spostamento. J. Alma mater. serbatoio di stoccaggio. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Origini storiche delle prove di durezza per indentazione. alma mater. la scienza. tecnologie. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Misurazioni della durezza di indentazione su scala macro, micro e nano: una revisione critica. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD e Clapperich, SM Errori di rilevamento della superficie portano a una sovrastima del modulo nella nanoindentazione di materiali morbidi. J. Mecha. Comportamento. Scienze biomediche. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR e Yahya M.Yu. Valutazione del metodo di nanoindentazione per la determinazione delle caratteristiche meccaniche di nanocompositi eterogenei utilizzando metodi sperimentali e computazionali. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR e Owart, TS Caratterizzazione meccanica di gel viscoelastici morbidi mediante indentazione e analisi inversa degli elementi finiti basata sull'ottimizzazione. J. Mecha. Comportamento. Scienze biomediche. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J e Chaneler D. Ottimizzazione della determinazione della viscoelasticità utilizzando sistemi di misura compatibili. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. e Pellillo, E. Nanoindentazione di superfici polimeriche. J. Fisica. D. Applica per la fisica. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. e Van Vliet KJ Caratterizzazione delle proprietà meccaniche viscoelastiche di polimeri altamente elastici e tessuti biologici mediante indentazione d'urto. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Valutazione del modulo elastico e del lavoro di adesione di materiali morbidi utilizzando il metodo esteso di Borodich-Galanov (BG) e l'indentazione profonda. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Morfologia su scala nanometrica e proprietà meccaniche delle superfici polimeriche biomimetiche delle lenti a contatto in silicone idrogel. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).