Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi peramban dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan carousel berisi tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah antar tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah antar tiga slide sekaligus.
Dengan pengembangan material ultra-lunak baru untuk perangkat medis dan aplikasi biomedis, karakterisasi komprehensif sifat fisik dan mekaniknya menjadi penting dan menantang. Teknik nanoindentasi mikroskop gaya atom (AFM) yang dimodifikasi diterapkan untuk mengkarakterisasi modulus permukaan yang sangat rendah dari lensa kontak hidrogel silikon biomimetik lehfilcon A baru yang dilapisi dengan lapisan struktur sikat polimer bercabang. Metode ini memungkinkan penentuan titik kontak yang tepat tanpa efek ekstrusi viskos saat mendekati polimer bercabang. Selain itu, metode ini memungkinkan penentuan karakteristik mekanik elemen sikat individual tanpa efek poroelastisitas. Hal ini dicapai dengan memilih probe AFM dengan desain (ukuran ujung, geometri, dan laju pegas) yang sangat cocok untuk mengukur sifat material lunak dan sampel biologis. Metode ini meningkatkan sensitivitas dan akurasi untuk pengukuran akurat material lehfilcon A yang sangat lunak, yang memiliki modulus elastisitas yang sangat rendah pada area permukaan (hingga 2 kPa) dan elastisitas yang sangat tinggi di lingkungan air internal (hampir 100%). Hasil studi permukaan tidak hanya mengungkapkan sifat permukaan ultra-lunak dari lensa lehfilcon A, tetapi juga menunjukkan bahwa modulus sikat polimer bercabang sebanding dengan modulus substrat silikon-hidrogen. Teknik karakterisasi permukaan ini dapat diterapkan pada material ultra-lunak lainnya dan perangkat medis.
Sifat mekanik material yang dirancang untuk kontak langsung dengan jaringan hidup seringkali ditentukan oleh lingkungan biologis. Kesesuaian sempurna dari sifat material ini membantu mencapai karakteristik klinis material yang diinginkan tanpa menyebabkan respons seluler yang merugikan1,2,3. Untuk material homogen dalam jumlah besar, karakterisasi sifat mekanik relatif mudah karena tersedianya prosedur dan metode pengujian standar (misalnya, mikroindentasi4,5,6). Namun, untuk material ultra-lunak seperti gel, hidrogel, biopolimer, sel hidup, dll., metode pengujian ini umumnya tidak dapat diterapkan karena keterbatasan resolusi pengukuran dan ketidakhomogenan beberapa material7. Selama bertahun-tahun, metode indentasi tradisional telah dimodifikasi dan diadaptasi untuk mengkarakterisasi berbagai macam material lunak, tetapi banyak metode masih mengalami kekurangan serius yang membatasi penggunaannya8,9,10,11,12,13. Kurangnya metode pengujian khusus yang dapat secara akurat dan andal mengkarakterisasi sifat mekanik material superlunak dan lapisan permukaan sangat membatasi penggunaannya dalam berbagai aplikasi.
Dalam penelitian kami sebelumnya, kami memperkenalkan lensa kontak lehfilcon A (CL), material heterogen lunak dengan semua sifat permukaan ultra-lunak yang berasal dari desain biomimetik yang terinspirasi oleh permukaan kornea mata. Biomaterial ini dikembangkan dengan mencangkokkan lapisan polimer bercabang dan terikat silang dari poli(2-metakriloyloxietilfosforilkolin (MPC)) (PMPC) ke hidrogel silikon (SiHy) 15 yang dirancang untuk perangkat medis. Proses pencangkokan ini menciptakan lapisan di permukaan yang terdiri dari struktur sikat polimer bercabang yang sangat lunak dan sangat elastis. Penelitian kami sebelumnya telah mengkonfirmasi bahwa struktur biomimetik lehfilcon A CL memberikan sifat permukaan yang unggul seperti peningkatan pembasahan dan pencegahan pengotoran, peningkatan pelumasan, dan pengurangan adhesi sel dan bakteri15,16. Selain itu, penggunaan dan pengembangan material biomimetik ini juga menunjukkan perluasan lebih lanjut ke perangkat biomedis lainnya. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengkarakterisasi sifat permukaan material ultra-lunak ini dan memahami interaksi mekanisnya dengan mata untuk menciptakan basis pengetahuan yang komprehensif guna mendukung pengembangan dan aplikasi di masa mendatang. Sebagian besar lensa kontak SiHy yang tersedia secara komersial terdiri dari campuran homogen polimer hidrofilik dan hidrofobik yang membentuk struktur material yang seragam17. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk menyelidiki sifat mekanisnya menggunakan metode uji kompresi, tarik, dan mikroindentasi tradisional18,19,20,21. Namun, desain biomimetik baru dari lensa kontak lehfilcon A menjadikannya material heterogen yang unik di mana sifat mekanis struktur sikat polimer bercabang berbeda secara signifikan dari substrat dasar SiHy. Oleh karena itu, sangat sulit untuk mengukur sifat-sifat ini secara akurat menggunakan metode konvensional dan indentasi. Metode yang menjanjikan menggunakan metode pengujian nanoindentasi yang diimplementasikan dalam mikroskop gaya atom (AFM), metode yang telah digunakan untuk menentukan sifat mekanis material viskoelastik lunak seperti sel dan jaringan biologis, serta polimer lunak22,23,24,25. 26,27,28,29,30. Dalam nanoindentasi AFM, prinsip dasar pengujian nanoindentasi dikombinasikan dengan kemajuan terbaru dalam teknologi AFM untuk memberikan peningkatan sensitivitas pengukuran dan pengujian berbagai macam material yang secara inheren sangat lunak31,32,33,34,35,36. Selain itu, teknologi ini menawarkan keuntungan penting lainnya melalui penggunaan geometri indenter dan probe yang berbeda serta kemungkinan pengujian dalam berbagai media cair.
Nanoindentasi AFM dapat dibagi secara kondisional menjadi tiga komponen utama: (1) peralatan (sensor, detektor, probe, dll.); (2) parameter pengukuran (seperti gaya, perpindahan, kecepatan, ukuran ramp, dll.); (3) pemrosesan data (koreksi garis dasar, estimasi titik sentuh, pencocokan data, pemodelan, dll.). Masalah signifikan dengan metode ini adalah beberapa studi dalam literatur yang menggunakan nanoindentasi AFM melaporkan hasil kuantitatif yang sangat berbeda untuk jenis sampel/sel/material yang sama37,38,39,40,41. Misalnya, Lekka dkk. mempelajari dan membandingkan pengaruh geometri probe AFM terhadap modulus Young terukur dari sampel hidrogel homogen secara mekanis dan sel heterogen. Mereka melaporkan bahwa nilai modulus sangat bergantung pada pemilihan cantilever dan bentuk ujung, dengan nilai tertinggi untuk probe berbentuk piramida dan nilai terendah 42 untuk probe berbentuk bola. Demikian pula, Selhuber-Unkel dkk. Telah ditunjukkan bagaimana kecepatan indentor, ukuran indentor, dan ketebalan sampel poliakrilamida (PAAM) memengaruhi modulus Young yang diukur dengan nanoindentasi ACM43. Faktor rumit lainnya adalah kurangnya material uji modulus sangat rendah standar dan prosedur pengujian bebas. Hal ini membuat sangat sulit untuk mendapatkan hasil yang akurat dengan keyakinan. Namun, metode ini sangat berguna untuk pengukuran relatif dan evaluasi komparatif antara jenis sampel yang serupa, misalnya menggunakan nanoindentasi AFM untuk membedakan sel normal dari sel kanker 44, 45.
Saat menguji material lunak dengan nanoindentasi AFM, aturan umum yang berlaku adalah menggunakan probe dengan konstanta pegas rendah (k) yang sesuai dengan modulus sampel dan ujung berbentuk setengah bola/bulat sehingga probe pertama tidak menembus permukaan sampel pada kontak pertama dengan material lunak. Penting juga agar sinyal defleksi yang dihasilkan oleh probe cukup kuat untuk dideteksi oleh sistem detektor laser24,34,46,47. Dalam kasus sel, jaringan, dan gel heterogen ultra-lunak, tantangan lain adalah mengatasi gaya adhesi antara probe dan permukaan sampel untuk memastikan pengukuran yang dapat direproduksi dan andal48,49,50. Hingga saat ini, sebagian besar penelitian tentang nanoindentasi AFM berfokus pada studi perilaku mekanik sel biologis, jaringan, gel, hidrogel, dan biomolekul menggunakan probe bulat yang relatif besar, yang umumnya disebut sebagai probe koloid (CP). 47, 51, 52, 53, 54, 55. Ujung-ujung ini memiliki radius 1 hingga 50 µm dan umumnya terbuat dari kaca borosilikat, polimetil metakrilat (PMMA), polistirena (PS), silikon dioksida (SiO2), dan karbon mirip intan (DLC). Meskipun nanoindentasi CP-AFM sering menjadi pilihan pertama untuk karakterisasi sampel lunak, ia memiliki masalah dan keterbatasan tersendiri. Penggunaan ujung bulat berukuran mikron yang besar meningkatkan total area kontak ujung dengan sampel dan mengakibatkan hilangnya resolusi spasial yang signifikan. Untuk spesimen lunak dan tidak homogen, di mana sifat mekanik elemen lokal dapat berbeda secara signifikan dari rata-rata di area yang lebih luas, indentasi CP dapat menyembunyikan ketidakhomogenan sifat pada skala lokal52. Probe koloid biasanya dibuat dengan menempelkan bola koloid berukuran mikron ke kantilever tanpa ujung menggunakan perekat epoksi. Proses manufaktur itu sendiri penuh dengan banyak masalah dan dapat menyebabkan inkonsistensi dalam proses kalibrasi probe. Selain itu, ukuran dan massa partikel koloid secara langsung memengaruhi parameter kalibrasi utama cantilever, seperti frekuensi resonansi, kekakuan pegas, dan sensitivitas defleksi56,57,58. Dengan demikian, metode yang umum digunakan untuk probe AFM konvensional, seperti kalibrasi suhu, mungkin tidak memberikan kalibrasi yang akurat untuk CP, dan metode lain mungkin diperlukan untuk melakukan koreksi ini57, 59, 60, 61. Eksperimen indentasi CP tipikal menggunakan cantilever dengan deviasi besar untuk mempelajari sifat-sifat sampel lunak, yang menciptakan masalah lain ketika mengkalibrasi perilaku non-linier cantilever pada deviasi yang relatif besar62,63,64. Metode indentasi probe koloid modern biasanya memperhitungkan geometri cantilever yang digunakan untuk mengkalibrasi probe, tetapi mengabaikan pengaruh partikel koloid, yang menciptakan ketidakpastian tambahan dalam akurasi metode38,61. Demikian pula, modulus elastis yang dihitung dengan pemodelan kontak bergantung langsung pada geometri probe indentasi, dan ketidaksesuaian antara karakteristik ujung dan permukaan sampel dapat menyebabkan ketidakakuratan27, 65, 66, 67, 68. Beberapa penelitian terbaru oleh Spencer et al. menyoroti faktor-faktor yang harus diperhitungkan ketika mengkarakterisasi sikat polimer lunak menggunakan metode nanoindentasi CP-AFM. Mereka melaporkan bahwa retensi cairan kental dalam sikat polimer sebagai fungsi kecepatan menghasilkan peningkatan beban kepala dan karenanya pengukuran sifat yang bergantung pada kecepatan berbeda30,69,70,71.
Dalam studi ini, kami telah mengkarakterisasi modulus permukaan material ultra-lunak dan sangat elastis lehfilcon A CL menggunakan metode nanoindentasi AFM yang dimodifikasi. Mengingat sifat dan struktur baru material ini, rentang sensitivitas metode indentasi tradisional jelas tidak cukup untuk mengkarakterisasi modulus material yang sangat lunak ini, sehingga perlu menggunakan metode nanoindentasi AFM dengan sensitivitas yang lebih tinggi dan tingkat sensitivitas yang lebih rendah. Setelah meninjau kekurangan dan masalah teknik nanoindentasi probe AFM koloid yang ada, kami menunjukkan mengapa kami memilih probe AFM yang lebih kecil dan dirancang khusus untuk menghilangkan sensitivitas, kebisingan latar belakang, titik kontak yang tepat, mengukur modulus kecepatan material heterogen lunak seperti ketergantungan retensi fluida, dan kuantifikasi yang akurat. Selain itu, kami dapat mengukur bentuk dan dimensi ujung indentasi secara akurat, memungkinkan kami untuk menggunakan model kecocokan kerucut-bola untuk menentukan modulus elastisitas tanpa menilai area kontak ujung dengan material. Dua asumsi implisit yang dikuantifikasi dalam penelitian ini adalah sifat material yang sepenuhnya elastis dan modulus yang tidak bergantung pada kedalaman indentasi. Dengan menggunakan metode ini, kami pertama-tama menguji standar ultra-lunak dengan modulus yang diketahui untuk mengkuantifikasi metode tersebut, dan kemudian menggunakan metode ini untuk mengkarakterisasi permukaan dua material lensa kontak yang berbeda. Metode karakterisasi permukaan nanoindentasi AFM dengan sensitivitas yang meningkat ini diharapkan dapat diterapkan pada berbagai material ultra-lunak heterogen biomimetik dengan potensi penggunaan dalam perangkat medis dan aplikasi biomedis.
Lensa kontak Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, AS) dan substrat hidrogel silikonnya dipilih untuk eksperimen nanoindentasi. Dudukan lensa yang dirancang khusus digunakan dalam eksperimen ini. Untuk memasang lensa untuk pengujian, lensa ditempatkan dengan hati-hati pada dudukan berbentuk kubah, memastikan tidak ada gelembung udara yang masuk ke dalam, dan kemudian difiksasi dengan tepinya. Sebuah lubang pada dudukan di bagian atas pen держак lensa memberikan akses ke pusat optik lensa untuk eksperimen nanoindentasi sambil menahan cairan di tempatnya. Ini menjaga lensa tetap terhidrasi sepenuhnya. 500 μl larutan kemasan lensa kontak digunakan sebagai larutan uji. Untuk memverifikasi hasil kuantitatif, hidrogel poliakrilamida (PAAM) non-aktif yang tersedia secara komersial disiapkan dari komposisi poliakrilamida-ko-metilen-bisakrilamida (cawan Petri Petrisoft 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, AS), dengan modulus elastisitas yang diketahui sebesar 1 kPa. Gunakan 4-5 tetes (sekitar 125 µl) larutan saline buffer fosfat (PBS dari Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) dan 1 tetes larutan lensa kontak OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA) pada antarmuka hidrogel-probe AFM.
Sampel Lehfilcon A CL dan substrat SiHy divisualisasikan menggunakan sistem Mikroskop Elektron Pemindaian Emisi Medan (FEG SEM) FEI Quanta 250 yang dilengkapi dengan detektor Mikroskop Elektron Transmisi Pemindaian (STEM). Untuk menyiapkan sampel, lensa terlebih dahulu dicuci dengan air dan dipotong menjadi irisan berbentuk segitiga. Untuk mencapai kontras diferensial antara komponen hidrofilik dan hidrofobik sampel, larutan RuO4 stabil 0,10% digunakan sebagai pewarna, di mana sampel direndam selama 30 menit. Pewarnaan RuO4 pada Lehfilcon A CL penting tidak hanya untuk mencapai kontras diferensial yang lebih baik, tetapi juga membantu mempertahankan struktur sikat polimer bercabang dalam bentuk aslinya, yang kemudian terlihat pada gambar STEM. Sampel kemudian dicuci dan didehidrasi dalam serangkaian campuran etanol/air dengan konsentrasi etanol yang meningkat. Sampel kemudian dicetak dengan epoksi EMBed 812/Araldite, yang dikeringkan semalaman pada suhu 70°C. Blok sampel yang diperoleh melalui polimerisasi resin dipotong dengan ultramikrotom, dan penampang tipis yang dihasilkan divisualisasikan dengan detektor STEM dalam mode vakum rendah pada tegangan percepatan 30 kV. Sistem SEM yang sama digunakan untuk karakterisasi rinci probe AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). Gambar SEM dari probe AFM diperoleh dalam mode vakum tinggi tipikal dengan tegangan percepatan 30 kV. Gambar diambil pada sudut dan perbesaran yang berbeda untuk merekam semua detail bentuk dan ukuran ujung probe AFM. Semua dimensi ujung yang relevan dalam gambar diukur secara digital.
Mikroskop gaya atom Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) dengan mode “PeakForce QNM in Fluid” digunakan untuk memvisualisasikan dan melakukan nanoindentasi pada sampel lehfilcon A CL, substrat SiHy, dan hidrogel PAAm. Untuk percobaan pencitraan, probe PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) dengan radius ujung nominal 1 nm digunakan untuk mengambil gambar resolusi tinggi dari sampel pada kecepatan pemindaian 0,50 Hz. Semua gambar diambil dalam larutan berair.
Eksperimen nanoindentasi AFM dilakukan menggunakan probe PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Probe AFM ini memiliki ujung silikon pada cantilever nitrida setebal 345 nm, panjang 54 µm, dan lebar 4,5 µm dengan frekuensi resonansi 45 kHz. Probe ini dirancang khusus untuk mengkarakterisasi dan melakukan pengukuran nanomekanik kuantitatif pada sampel biologis lunak. Sensor dikalibrasi secara individual di pabrik dengan pengaturan pegas yang telah dikalibrasi sebelumnya. Konstanta pegas probe yang digunakan dalam penelitian ini berada dalam kisaran 0,05–0,1 N/m. Untuk menentukan bentuk dan ukuran ujung secara akurat, probe dikarakterisasi secara detail menggunakan SEM. Gambar 1a menunjukkan mikrograf elektron pemindaian resolusi tinggi dengan perbesaran rendah dari probe PFQNM-LC-A-CAL, yang memberikan gambaran menyeluruh tentang desain probe. Gambar 1b menunjukkan tampilan yang diperbesar dari bagian atas ujung probe, memberikan informasi tentang bentuk dan ukuran ujungnya. Di ujung paling luar, jarum berbentuk setengah bola dengan diameter sekitar 140 nm (Gambar 1c). Di bawahnya, ujung meruncing menjadi bentuk kerucut, mencapai panjang terukur sekitar 500 nm. Di luar daerah yang meruncing, ujungnya berbentuk silinder dan berakhir dengan panjang ujung total 1,18 µm. Ini adalah bagian fungsional utama dari ujung probe. Selain itu, probe polistirena (PS) bulat besar (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, AS) dengan diameter ujung 45 µm dan konstanta pegas 2 N/m juga digunakan untuk pengujian sebagai probe koloid. dengan probe PFQNM-LC-A-CAL 140 nm untuk perbandingan.
Telah dilaporkan bahwa cairan dapat terperangkap antara probe AFM dan struktur sikat polimer selama nanoindentasi, yang akan memberikan gaya ke atas pada probe AFM sebelum benar-benar menyentuh permukaan69. Efek ekstrusi kental akibat retensi cairan ini dapat mengubah titik kontak yang tampak, sehingga memengaruhi pengukuran modulus permukaan. Untuk mempelajari pengaruh geometri probe dan kecepatan indentasi pada retensi cairan, kurva gaya indentasi diplot untuk sampel lehfilcon A CL menggunakan probe berdiameter 140 nm pada laju perpindahan konstan 1 µm/s dan 2 µm/s. Diameter probe 45 µm, pengaturan gaya tetap 6 nN dicapai pada 1 µm/s. Eksperimen dengan probe berdiameter 140 nm dilakukan pada kecepatan indentasi 1 µm/s dan gaya tetap 300 pN, yang dipilih untuk menciptakan tekanan kontak dalam kisaran fisiologis (1–8 kPa) kelopak mata atas. Tekanan 72. Sampel hidrogel PAA lunak siap pakai dengan tekanan 1 kPa diuji dengan gaya indentasi 50 pN pada kecepatan 1 μm/s menggunakan probe dengan diameter 140 nm.
Karena panjang bagian kerucut dari ujung probe PFQNM-LC-A-CAL kira-kira 500 nm, untuk kedalaman indentasi < 500 nm dapat diasumsikan dengan aman bahwa geometri probe selama indentasi akan tetap sesuai dengan bentuk kerucutnya. Selain itu, diasumsikan bahwa permukaan material yang diuji akan menunjukkan respons elastis reversibel, yang juga akan dikonfirmasi di bagian selanjutnya. Oleh karena itu, tergantung pada bentuk dan ukuran ujungnya, kami memilih model fitting kerucut-bola yang dikembangkan oleh Briscoe, Sebastian, dan Adams, yang tersedia dalam perangkat lunak vendor, untuk memproses eksperimen nanoindentasi AFM kami (NanoScope). Perangkat lunak analisis data pemisahan, Bruker) 73. Model ini menggambarkan hubungan gaya-perpindahan F(δ) untuk kerucut dengan cacat puncak berbentuk bola. Pada gambar. Gambar 2 menunjukkan geometri kontak selama interaksi kerucut kaku dengan ujung bulat, di mana R adalah jari-jari ujung bulat, a adalah jari-jari kontak, b adalah jari-jari kontak di ujung bulat, δ adalah jari-jari kontak, kedalaman indentasi, θ adalah setengah sudut kerucut. Gambar SEM dari probe ini jelas menunjukkan bahwa ujung bulat berdiameter 140 nm menyatu secara tangensial ke dalam kerucut, sehingga di sini b didefinisikan hanya melalui R, yaitu b = R cos θ. Perangkat lunak yang disediakan vendor memberikan hubungan kerucut-bola untuk menghitung nilai modulus Young (E) dari data pemisahan gaya dengan asumsi a > b. Hubungan:
di mana F adalah gaya indentasi, E adalah modulus Young, ν adalah rasio Poisson. Jari-jari kontak a dapat diperkirakan menggunakan:
Skema geometri kontak dari kerucut kaku dengan ujung bulat yang ditekan ke dalam material lensa kontak Lefilcon dengan lapisan permukaan berupa sikat polimer bercabang.
Jika a ≤ b, hubungan tersebut disederhanakan menjadi persamaan untuk indentor bulat konvensional;
Kami meyakini bahwa interaksi antara probe penekan dengan struktur bercabang dari lapisan polimer PMPC akan menyebabkan jari-jari kontak a lebih besar daripada jari-jari kontak bola b. Oleh karena itu, untuk semua pengukuran kuantitatif modulus elastisitas yang dilakukan dalam penelitian ini, kami menggunakan ketergantungan yang diperoleh untuk kasus a > b.
Material biomimetik ultralunak yang dipelajari dalam penelitian ini divisualisasikan secara komprehensif menggunakan mikroskopi elektron transmisi pemindaian (STEM) pada penampang sampel dan mikroskopi gaya atom (AFM) pada permukaannya. Karakterisasi permukaan yang detail ini dilakukan sebagai perluasan dari karya kami yang telah dipublikasikan sebelumnya, di mana kami menentukan bahwa struktur sikat polimer bercabang dinamis dari permukaan lensa kontak lehfilcon A yang dimodifikasi PMPC menunjukkan sifat mekanik yang mirip dengan jaringan kornea asli 14. Karena alasan ini, kami menyebut permukaan lensa kontak sebagai material biomimetik14. Pada Gambar 3a,b menunjukkan penampang struktur sikat polimer PMPC bercabang pada permukaan substrat lensa kontak lehfilcon A dan substrat SiHy yang tidak diolah, masing-masing. Permukaan kedua sampel selanjutnya dianalisis menggunakan citra AFM resolusi tinggi, yang selanjutnya mengkonfirmasi hasil analisis STEM (Gambar 3c, d). Secara keseluruhan, gambar-gambar ini memberikan perkiraan panjang struktur sikat polimer bercabang PMPC pada 300–400 nm, yang sangat penting untuk menginterpretasikan pengukuran nanoindentasi AFM. Pengamatan penting lainnya yang diperoleh dari gambar-gambar tersebut adalah bahwa struktur permukaan keseluruhan material biomimetik CL secara morfologis berbeda dari material substrat SiHy. Perbedaan morfologi permukaan ini dapat terlihat selama interaksi mekanisnya dengan probe AFM yang melakukan indentasi dan selanjutnya pada nilai modulus yang diukur.
Gambar STEM penampang melintang dari (a) lehfilcon A CL dan (b) substrat SiHy. Skala bar, 500 nm. Gambar AFM permukaan substrat lehfilcon A CL (c) dan substrat dasar SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polimer yang terinspirasi secara biologis dan struktur sikat polimer pada dasarnya lunak dan telah banyak dipelajari dan digunakan dalam berbagai aplikasi biomedis74,75,76,77. Oleh karena itu, penting untuk menggunakan metode nanoindentasi AFM, yang dapat mengukur sifat mekaniknya secara akurat dan andal. Namun pada saat yang sama, sifat unik dari material ultra-lunak ini, seperti modulus elastisitas yang sangat rendah, kandungan cairan yang tinggi, dan elastisitas yang tinggi, seringkali menyulitkan pemilihan material, bentuk, dan ukuran probe indentasi yang tepat. Hal ini penting agar indenter tidak menembus permukaan lunak sampel, yang akan menyebabkan kesalahan dalam menentukan titik kontak dengan permukaan dan area kontak.
Untuk itu, pemahaman komprehensif tentang morfologi material biomimetik ultra-lunak (lehfilcon A CL) sangat penting. Informasi tentang ukuran dan struktur sikat polimer bercabang yang diperoleh menggunakan metode pencitraan memberikan dasar untuk karakterisasi mekanik permukaan menggunakan teknik nanoindentasi AFM. Alih-alih probe koloid bulat berukuran mikron, kami memilih probe silikon nitrida PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) dengan diameter ujung 140 nm, yang dirancang khusus untuk pemetaan kuantitatif sifat mekanik sampel biologis 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Alasan penggunaan probe yang relatif tajam dibandingkan dengan probe koloid konvensional dapat dijelaskan oleh fitur struktural material tersebut. Dengan membandingkan ukuran ujung probe (~140 nm) dengan sikat polimer bercabang pada permukaan CL lehfilcon A, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, dapat disimpulkan bahwa ujung probe cukup besar untuk bersentuhan langsung dengan struktur sikat ini, yang mengurangi kemungkinan ujung probe menembus struktur tersebut. Untuk mengilustrasikan hal ini, pada Gambar 4 terdapat gambar STEM dari lehfilcon A CL dan ujung probe AFM yang menekan (digambar sesuai skala).
Diagram skematik yang menunjukkan citra STEM dari lehfilcon A CL dan probe indentasi ACM (digambar sesuai skala).
Selain itu, ukuran ujung 140 nm cukup kecil untuk menghindari risiko efek ekstrusi lengket yang sebelumnya dilaporkan untuk sikat polimer yang dihasilkan oleh metode nanoindentasi CP-AFM69,71. Kami berasumsi bahwa karena bentuk kerucut-bola khusus dan ukuran ujung AFM yang relatif kecil (Gambar 1), sifat kurva gaya yang dihasilkan oleh nanoindentasi lehfilcon A CL tidak akan bergantung pada kecepatan indentasi atau kecepatan pemuatan/pelepasan. Oleh karena itu, tidak dipengaruhi oleh efek poroelastis. Untuk menguji hipotesis ini, sampel lehfilcon A CL diindentasi pada gaya maksimum tetap menggunakan probe PFQNM-LC-A-CAL, tetapi pada dua kecepatan yang berbeda, dan kurva gaya tarik dan tarik balik yang dihasilkan digunakan untuk memplot gaya (nN) dalam pemisahan (µm) yang ditunjukkan pada Gambar 5a. Jelas bahwa kurva gaya selama pemuatan dan pelepasan sepenuhnya tumpang tindih, dan tidak ada bukti jelas bahwa gaya geser pada kedalaman indentasi nol meningkat dengan kecepatan indentasi pada gambar, menunjukkan bahwa elemen sikat individual dikarakterisasi tanpa efek poroelastis. Sebaliknya, efek retensi fluida (ekstrusi viskos dan efek poroelastisitas) terlihat jelas untuk probe AFM berdiameter 45 µm pada kecepatan indentasi yang sama dan ditunjukkan oleh histeresis antara kurva peregangan dan penarikan, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5b. Hasil ini mendukung hipotesis dan menunjukkan bahwa probe berdiameter 140 nm adalah pilihan yang baik untuk mengkarakterisasi permukaan lunak tersebut.
Kurva gaya indentasi lehfilcon A CL menggunakan ACM; (a) menggunakan probe dengan diameter 140 nm pada dua laju pembebanan, menunjukkan tidak adanya efek poroelastis selama indentasi permukaan; (b) menggunakan probe dengan diameter 45 µm dan 140 nm. Grafik menunjukkan efek ekstrusi viskos dan poroelastisitas untuk probe besar dibandingkan dengan probe yang lebih kecil.
Untuk mengkarakterisasi permukaan ultralunak, metode nanoindentasi AFM harus memiliki probe terbaik untuk mempelajari sifat-sifat material yang diteliti. Selain bentuk dan ukuran ujung probe, sensitivitas sistem detektor AFM, sensitivitas terhadap defleksi ujung probe di lingkungan pengujian, dan kekakuan kantilever memainkan peran penting dalam menentukan akurasi dan keandalan pengukuran nanoindentasi. Untuk sistem AFM kami, batas deteksi Position Sensitive Detector (PSD) adalah sekitar 0,5 mV dan didasarkan pada laju pegas yang telah dikalibrasi sebelumnya dan sensitivitas defleksi fluida yang dihitung dari probe PFQNM-LC-A-CAL, yang sesuai dengan sensitivitas beban teoritis kurang dari 0,1 pN. Oleh karena itu, metode ini memungkinkan pengukuran gaya indentasi minimum ≤ 0,1 pN tanpa komponen noise periferal. Namun, hampir tidak mungkin bagi sistem AFM untuk mengurangi noise periferal hingga tingkat ini karena faktor-faktor seperti getaran mekanis dan dinamika fluida. Faktor-faktor ini membatasi sensitivitas keseluruhan metode nanoindentasi AFM dan juga menghasilkan sinyal noise latar belakang sekitar ≤ 10 pN. Untuk karakterisasi permukaan, sampel lehfilcon A CL dan substrat SiHy diindentasi dalam kondisi terhidrasi penuh menggunakan probe 140 nm untuk karakterisasi SEM, dan kurva gaya yang dihasilkan ditumpangkan antara gaya (pN) dan tekanan. Plot pemisahan (µm) ditunjukkan pada Gambar 6a. Dibandingkan dengan substrat dasar SiHy, kurva gaya lehfilcon A CL jelas menunjukkan fase transisi yang dimulai pada titik kontak dengan sikat polimer bercabang dan berakhir dengan perubahan kemiringan yang tajam yang menandai kontak ujung dengan material di bawahnya. Bagian transisi dari kurva gaya ini menyoroti perilaku elastis sejati dari sikat polimer bercabang di permukaan, sebagaimana dibuktikan oleh kurva kompresi yang mengikuti kurva tegangan dan kontras dalam sifat mekanik antara struktur sikat dan material SiHy yang besar. Saat membandingkan lehfilcon. Pemisahan panjang rata-rata sikat polimer bercabang pada citra STEM PCS (Gambar 3a) dan kurva gayanya sepanjang absis pada Gambar 3a. 6a menunjukkan bahwa metode ini mampu mendeteksi ujung dan polimer bercabang yang mencapai bagian paling atas permukaan. Kontak antara struktur sikat. Selain itu, tumpang tindih yang erat dari kurva gaya menunjukkan tidak adanya efek retensi cairan. Dalam hal ini, sama sekali tidak ada adhesi antara jarum dan permukaan sampel. Bagian paling atas dari kurva gaya untuk kedua sampel tumpang tindih, mencerminkan kesamaan sifat mekanik bahan substrat.
(a) Kurva gaya nanoindentasi AFM untuk substrat lehfilcon A CL dan substrat SiHy, (b) kurva gaya yang menunjukkan estimasi titik kontak menggunakan metode ambang batas kebisingan latar belakang.
Untuk mempelajari detail yang lebih halus dari kurva gaya, kurva tegangan sampel lehfilcon A CL diplot ulang pada Gambar 6b ​​dengan gaya maksimum 50 pN di sepanjang sumbu y. Grafik ini memberikan informasi penting tentang noise latar belakang asli. Noise berada dalam kisaran ±10 pN, yang digunakan untuk secara akurat menentukan titik kontak dan menghitung kedalaman indentasi. Seperti yang dilaporkan dalam literatur, identifikasi titik kontak sangat penting untuk secara akurat menilai sifat material seperti modulus85. Pendekatan yang melibatkan pemrosesan otomatis data kurva gaya telah menunjukkan peningkatan kesesuaian antara pencocokan data dan pengukuran kuantitatif untuk material lunak86. Dalam pekerjaan ini, pilihan titik kontak kami relatif sederhana dan objektif, tetapi memiliki keterbatasan. Pendekatan konservatif kami dalam menentukan titik kontak dapat menghasilkan nilai modulus yang sedikit dilebih-lebihkan untuk kedalaman indentasi yang lebih kecil (< 100 nm). Penggunaan deteksi titik sentuh berbasis algoritma dan pemrosesan data otomatis dapat menjadi kelanjutan dari pekerjaan ini di masa mendatang untuk lebih meningkatkan metode kami. Dengan demikian, untuk kebisingan latar belakang intrinsik sekitar ±10 pN, kita mendefinisikan titik kontak sebagai titik data pertama pada sumbu x pada Gambar 6b ​​dengan nilai ≥10 pN. Kemudian, sesuai dengan ambang batas kebisingan 10 pN, garis vertikal pada level ~0,27 µm menandai titik kontak dengan permukaan, setelah itu kurva peregangan berlanjut hingga substrat mencapai kedalaman indentasi ~270 nm. Menariknya, berdasarkan ukuran fitur sikat polimer bercabang (300–400 nm) yang diukur menggunakan metode pencitraan, kedalaman indentasi sampel CL lehfilcon A yang diamati menggunakan metode ambang batas kebisingan latar belakang adalah sekitar 270 nm, yang sangat dekat dengan ukuran pengukuran dengan STEM. Hasil ini semakin menegaskan kompatibilitas dan penerapan bentuk dan ukuran ujung probe AFM untuk indentasi struktur sikat polimer bercabang yang sangat lunak dan sangat elastis ini. Data ini juga memberikan bukti kuat untuk mendukung metode kami dalam menggunakan kebisingan latar belakang sebagai ambang batas untuk menentukan titik kontak. Dengan demikian, setiap hasil kuantitatif yang diperoleh dari pemodelan matematika dan penyesuaian kurva gaya seharusnya relatif akurat.
Pengukuran kuantitatif dengan metode nanoindentasi AFM sepenuhnya bergantung pada model matematika yang digunakan untuk pemilihan data dan analisis selanjutnya. Oleh karena itu, penting untuk mempertimbangkan semua faktor yang terkait dengan pemilihan indentor, sifat material, dan mekanika interaksinya sebelum memilih model tertentu. Dalam hal ini, geometri ujung probe dikarakterisasi dengan cermat menggunakan mikrograf SEM (Gambar 1), dan berdasarkan hasilnya, probe nanoindentasi AFM berdiameter 140 nm dengan kerucut keras dan geometri ujung bulat merupakan pilihan yang baik untuk mengkarakterisasi sampel lehfilcon A CL79. Faktor penting lain yang perlu dievaluasi dengan cermat adalah elastisitas material polimer yang diuji. Meskipun data awal nanoindentasi (Gambar 5a dan 6a) dengan jelas menggambarkan fitur tumpang tindih kurva tegangan dan kompresi, yaitu, pemulihan elastis material secara lengkap, sangat penting untuk mengkonfirmasi sifat elastis murni dari kontak tersebut. Untuk tujuan ini, dua indentasi berturut-turut dilakukan pada lokasi yang sama di permukaan sampel lehfilcon A CL dengan laju indentasi 1 µm/s dalam kondisi hidrasi penuh. Data kurva gaya yang dihasilkan ditunjukkan pada Gambar 7 dan, seperti yang diharapkan, kurva ekspansi dan kompresi dari kedua cetakan hampir identik, menyoroti elastisitas tinggi dari struktur sikat polimer bercabang.
Dua kurva gaya indentasi pada lokasi yang sama di permukaan lensa kontak lehfilcon A menunjukkan elastisitas ideal permukaan lensa.
Berdasarkan informasi yang diperoleh dari citra SEM dan STEM dari ujung probe dan permukaan lehfilcon A CL, masing-masing, model kerucut-bola merupakan representasi matematis yang masuk akal dari interaksi antara ujung probe AFM dan material polimer lunak yang sedang diuji. Selain itu, untuk model kerucut-bola ini, asumsi mendasar tentang sifat elastis material yang dicetak berlaku untuk material biomimetik baru ini dan digunakan untuk mengukur modulus elastisitas.
Setelah evaluasi komprehensif terhadap metode nanoindentasi AFM dan komponen-komponennya, termasuk sifat-sifat probe indentasi (bentuk, ukuran, dan kekakuan pegas), sensitivitas (kebisingan latar belakang dan estimasi titik kontak), dan model pencocokan data (pengukuran modulus kuantitatif), metode ini digunakan untuk mengkarakterisasi sampel ultra-lunak yang tersedia secara komersial untuk memverifikasi hasil kuantitatif. Hidrogel poliakrilamida (PAAM) komersial dengan modulus elastis 1 kPa diuji dalam kondisi terhidrasi menggunakan probe 140 nm. Detail pengujian modulus dan perhitungannya diberikan dalam Informasi Tambahan. Hasil menunjukkan bahwa modulus rata-rata yang diukur adalah 0,92 kPa, dan %RSD serta persentase (%) deviasi dari modulus yang diketahui kurang dari 10%. Hasil ini mengkonfirmasi akurasi dan reproduktivitas metode nanoindentasi AFM yang digunakan dalam penelitian ini untuk mengukur modulus material ultra-lunak. Permukaan sampel lehfilcon A CL dan substrat dasar SiHy selanjutnya dikarakterisasi menggunakan metode nanoindentasi AFM yang sama untuk mempelajari modulus kontak semu permukaan ultralunak sebagai fungsi kedalaman indentasi. Kurva pemisahan gaya indentasi dihasilkan untuk tiga spesimen dari setiap jenis (n = 3; satu indentasi per spesimen) pada gaya 300 pN, kecepatan 1 µm/s, dan hidrasi penuh. Kurva pembagian gaya indentasi didekati menggunakan model kerucut-bola. Untuk mendapatkan modulus yang bergantung pada kedalaman indentasi, bagian kurva gaya selebar 40 nm diatur pada setiap peningkatan 20 nm mulai dari titik kontak, dan nilai modulus yang diukur pada setiap langkah kurva gaya. Spin Cy dkk. Pendekatan serupa telah digunakan untuk mengkarakterisasi gradien modulus sikat polimer poli(lauril metakrilat) (P12MA) menggunakan nanoindentasi probe AFM koloid, dan hasilnya konsisten dengan data yang menggunakan model kontak Hertz. Pendekatan ini memberikan plot modulus kontak semu (kPa) terhadap kedalaman indentasi (nm), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8, yang menggambarkan gradien modulus kontak/kedalaman semu. Modulus elastis yang dihitung dari sampel CL lehfilcon A berada dalam kisaran 2–3 kPa dalam 100 nm bagian atas sampel, di luar itu mulai meningkat seiring kedalaman. Di sisi lain, ketika menguji substrat dasar SiHy tanpa lapisan seperti sikat pada permukaannya, kedalaman indentasi maksimum yang dicapai pada gaya 300 pN kurang dari 50 nm, dan nilai modulus yang diperoleh dari data tersebut sekitar 400 kPa, yang sebanding dengan nilai modulus Young untuk material curah.
Modulus kontak semu (kPa) vs. kedalaman indentasi (nm) untuk lehfilcon A CL dan substrat SiHy menggunakan metode nanoindentasi AFM dengan geometri kerucut-bola untuk mengukur modulus.
Permukaan paling atas dari struktur sikat polimer bercabang biomimetik baru ini menunjukkan modulus elastisitas yang sangat rendah (2–3 kPa). Ini akan sesuai dengan ujung bebas dari sikat polimer bercabang seperti yang ditunjukkan pada gambar STEM. Meskipun ada beberapa bukti gradien modulus di tepi luar CL, substrat modulus tinggi utama lebih berpengaruh. Namun, 100 nm bagian atas permukaan berada dalam 20% dari total panjang sikat polimer bercabang, sehingga masuk akal untuk berasumsi bahwa nilai modulus yang diukur dalam rentang kedalaman indentasi ini relatif akurat dan tidak terlalu bergantung pada pengaruh objek di bawahnya.
Karena desain biomimetik unik dari lensa kontak lefilcon A, yang terdiri dari struktur sikat polimer PMPC bercabang yang dicangkokkan ke permukaan substrat SiHy, sangat sulit untuk mengkarakterisasi sifat mekanik struktur permukaannya secara andal menggunakan metode pengukuran tradisional. Di sini kami menyajikan metode nanoindentasi AFM canggih untuk mengkarakterisasi secara akurat material ultra-lunak seperti lefilcon A dengan kandungan air tinggi dan elastisitas yang sangat tinggi. Metode ini didasarkan pada penggunaan probe AFM yang ukuran dan geometri ujungnya dipilih dengan cermat agar sesuai dengan dimensi struktural fitur permukaan ultra-lunak yang akan dicetak. Kombinasi dimensi antara probe dan struktur ini memberikan peningkatan sensitivitas, memungkinkan kita untuk mengukur modulus rendah dan sifat elastis inheren dari elemen sikat polimer bercabang, terlepas dari efek poroelastis. Hasilnya menunjukkan bahwa sikat polimer PMPC bercabang yang unik yang menjadi ciri permukaan lensa memiliki modulus elastis yang sangat rendah (hingga 2 kPa) dan elastisitas yang sangat tinggi (hampir 100%) ketika diuji dalam lingkungan berair. Hasil nanoindentasi AFM juga memungkinkan kami untuk mengkarakterisasi gradien modulus kontak/kedalaman (30 kPa/200 nm) yang tampak pada permukaan lensa biomimetik. Gradien ini mungkin disebabkan oleh perbedaan modulus antara sikat polimer bercabang dan substrat SiHy, atau struktur/kepadatan bercabang dari sikat polimer, atau kombinasi keduanya. Namun, studi mendalam lebih lanjut diperlukan untuk sepenuhnya memahami hubungan antara struktur dan sifat, terutama pengaruh percabangan sikat pada sifat mekanik. Pengukuran serupa dapat membantu mengkarakterisasi sifat mekanik permukaan material ultra-lunak lainnya dan perangkat medis.
Kumpulan data yang dihasilkan dan/atau dianalisis selama penelitian ini tersedia dari masing-masing penulis atas permintaan yang wajar.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. dan Haugen, HJ. Reaksi biologis terhadap sifat fisik dan kimia permukaan biomaterial. Masyarakat Kimia. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM dan Liu, X. Peningkatan biomaterial turunan manusia untuk rekayasa jaringan. pemrograman. polimer. ilmu pengetahuan. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. dkk. Desain, implementasi klinis, dan respons imun biomaterial dalam pengobatan regeneratif. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK dan Farr GM Metode yang disempurnakan untuk menentukan kekerasan dan modulus elastisitas menggunakan eksperimen indentasi dengan pengukuran beban dan perpindahan. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Asal-usul historis pengujian kekerasan indentasi. alma mater. ilmu pengetahuan. teknologi. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Pengukuran Kekerasan Indentasi pada Skala Makro, Mikro, dan Nano: Tinjauan Kritis. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD dan Clapperich, SM Kesalahan deteksi permukaan menyebabkan estimasi modulus yang berlebihan dalam nanoindentasi material lunak. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR dan Yahya M.Yu. Evaluasi metode nanoindentasi untuk menentukan karakteristik mekanik nanokomposit heterogen menggunakan metode eksperimental dan komputasi. Ilmu pengetahuan. Rumah 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, dan Owart, TS. Karakterisasi mekanik gel viskoelastik lunak dengan indentasi dan analisis elemen hingga invers berbasis optimasi. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J dan Chaneler D. Optimasi penentuan viskoelastisitas menggunakan sistem pengukuran yang kompatibel. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. dan Pellillo, E. Nanoindentasi permukaan polimer. J. Fisika. D. Aplikasi untuk fisika. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. dan Van Vliet KJ. Karakterisasi sifat mekanik viskoelastik polimer yang sangat elastis dan jaringan biologis menggunakan indentasi kejut. Jurnal Biomaterial. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluasi modulus elastisitas dan kerja adhesi material lunak menggunakan metode Borodich-Galanov (BG) yang diperluas dan indentasi dalam. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. dkk. Morfologi skala nano dan sifat mekanik permukaan polimer biomimetik lensa kontak hidrogel silikon. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).