Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi peramban dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan korsel tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus.
Dengan berkembangnya material ultra-lunak baru untuk perangkat medis dan aplikasi biomedis, karakterisasi komprehensif sifat fisik dan mekanisnya menjadi penting sekaligus menantang. Teknik nanoindentasi mikroskop gaya atom (AFM) yang dimodifikasi diterapkan untuk mengkarakterisasi modulus permukaan yang sangat rendah dari lensa kontak hidrogel silikon biomimetik Lehfilcon A baru yang dilapisi dengan lapisan struktur sikat polimer bercabang. Metode ini memungkinkan penentuan titik kontak yang presisi tanpa efek ekstrusi viskos saat mendekati polimer bercabang. Selain itu, metode ini memungkinkan penentuan karakteristik mekanis masing-masing elemen sikat tanpa efek poroelastisitas. Hal ini dicapai dengan memilih probe AFM dengan desain (ukuran ujung, geometri, dan laju pegas) yang sangat sesuai untuk mengukur sifat material lunak dan sampel biologis. Metode ini meningkatkan sensitivitas dan akurasi untuk pengukuran akurat material Lehfilcon A yang sangat lunak, yang memiliki modulus elastisitas yang sangat rendah pada luas permukaan (hingga 2 kPa) dan elastisitas yang sangat tinggi dalam lingkungan berair internal (hampir 100%). Hasil studi permukaan tidak hanya mengungkapkan sifat permukaan lensa lehfilcon A yang sangat lunak, tetapi juga menunjukkan bahwa modulus sikat polimer bercabang sebanding dengan modulus substrat silikon-hidrogen. Teknik karakterisasi permukaan ini dapat diterapkan pada material dan perangkat medis ultra-lunak lainnya.
Sifat mekanis material yang dirancang untuk kontak langsung dengan jaringan hidup seringkali ditentukan oleh lingkungan biologis. Kecocokan sempurna antara sifat-sifat material ini membantu mencapai karakteristik klinis material yang diinginkan tanpa menyebabkan respons seluler yang merugikan1,2,3. Untuk material homogen massal, karakterisasi sifat mekanis relatif mudah karena tersedianya prosedur dan metode uji standar (misalnya, mikroindentasi4,5,6). Namun, untuk material ultra-lunak seperti gel, hidrogel, biopolimer, sel hidup, dll., metode uji ini umumnya tidak berlaku karena keterbatasan resolusi pengukuran dan ketidakhomogenan beberapa material7. Selama bertahun-tahun, metode indentasi tradisional telah dimodifikasi dan diadaptasi untuk mengkarakterisasi berbagai macam material lunak, tetapi banyak metode masih memiliki kekurangan serius yang membatasi penggunaannya8,9,10,11,12,13. Kurangnya metode uji khusus yang dapat secara akurat dan andal mengkarakterisasi sifat mekanis material superlunak dan lapisan permukaan sangat membatasi penggunaannya dalam berbagai aplikasi.
Dalam penelitian kami sebelumnya, kami memperkenalkan lensa kontak lehfilcon A (CL), bahan heterogen yang lembut dengan semua sifat permukaan ultra-lembut yang berasal dari desain biomimetik yang terinspirasi oleh permukaan kornea mata. Biomaterial ini dikembangkan dengan mencangkokkan lapisan polimer bercabang dan berikatan silang dari poli(2-metakriloiloksietilfosforilkolin (MPC)) (PMPC) ke hidrogel silikon (SiHy) 15 yang dirancang untuk perangkat medis berbasis. Proses pencangkokan ini menciptakan lapisan pada permukaan yang terdiri dari struktur sikat polimer bercabang yang sangat lembut dan sangat elastis. Penelitian kami sebelumnya telah mengonfirmasi bahwa struktur biomimetik lehfilcon A CL memberikan sifat permukaan yang unggul seperti pencegahan pembasahan dan pengotoran yang lebih baik, peningkatan pelumasan, dan pengurangan adhesi sel dan bakteri15,16. Selain itu, penggunaan dan pengembangan bahan biomimetik ini juga menunjukkan perluasan lebih lanjut ke perangkat biomedis lainnya. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengkarakterisasi sifat permukaan material ultra-lunak ini dan memahami interaksi mekanisnya dengan mata guna menciptakan basis pengetahuan yang komprehensif untuk mendukung pengembangan dan aplikasi di masa mendatang. Sebagian besar lensa kontak SiHy yang tersedia secara komersial terdiri dari campuran homogen polimer hidrofilik dan hidrofobik yang membentuk struktur material yang seragam17. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk menyelidiki sifat mekanisnya menggunakan metode uji kompresi, tarik, dan mikroindentasi tradisional18,19,20,21. Namun, desain biomimetik baru lehfilcon A CL menjadikannya material heterogen yang unik dengan sifat mekanis struktur sikat polimer bercabang yang berbeda secara signifikan dari substrat dasar SiHy. Oleh karena itu, sangat sulit untuk mengkuantifikasi sifat-sifat ini secara akurat menggunakan metode konvensional dan indentasi. Sebuah metode yang menjanjikan menggunakan metode pengujian nanoindentasi yang diimplementasikan dalam mikroskopi gaya atom (AFM), sebuah metode yang telah digunakan untuk menentukan sifat mekanis material viskoelastis lunak seperti sel dan jaringan biologis, serta polimer lunak22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. Dalam nanoindentasi AFM, dasar-dasar pengujian nanoindentasi dipadukan dengan kemajuan terbaru dalam teknologi AFM untuk meningkatkan sensitivitas pengukuran dan pengujian berbagai material yang pada dasarnya superlunak31,32,33,34,35,36. Selain itu, teknologi ini menawarkan keunggulan penting lainnya melalui penggunaan geometri yang berbeda, indentor dan probe, serta kemungkinan pengujian dalam berbagai media cair.
Nanoindentasi AFM dapat dibagi secara kondisional menjadi tiga komponen utama: (1) peralatan (sensor, detektor, probe, dll.); (2) parameter pengukuran (seperti gaya, perpindahan, kecepatan, ukuran ramp, dll.); (3) Pemrosesan data (koreksi baseline, estimasi titik sentuh, pemasangan data, pemodelan, dll.). Masalah signifikan dengan metode ini adalah bahwa beberapa studi dalam literatur yang menggunakan nanoindentasi AFM melaporkan hasil kuantitatif yang sangat berbeda untuk jenis sampel/sel/material yang sama37,38,39,40,41. Misalnya, Lekka et al. Pengaruh geometri probe AFM pada modulus Young yang diukur dari sampel hidrogel homogen mekanis dan sel heterogen dipelajari dan dibandingkan. Mereka melaporkan bahwa nilai modulus sangat bergantung pada pemilihan kantilever dan bentuk ujung, dengan nilai tertinggi untuk probe berbentuk piramida dan nilai terendah 42 untuk probe bulat. Demikian pula, Selhuber-Unkel et al. Telah ditunjukkan bagaimana kecepatan indenter, ukuran indenter, dan ketebalan sampel poliakrilamida (PAAM) memengaruhi modulus Young yang diukur dengan nanoindentasi ACM43. Faktor lain yang mempersulit adalah kurangnya bahan uji modulus sangat rendah standar dan prosedur uji gratis. Hal ini menyulitkan untuk mendapatkan hasil yang akurat dan meyakinkan. Namun, metode ini sangat berguna untuk pengukuran relatif dan evaluasi komparatif antar jenis sampel yang serupa, misalnya menggunakan nanoindentasi AFM untuk membedakan sel normal dari sel kanker.
Saat menguji material lunak dengan nanoindentasi AFM, aturan umum yang umum adalah menggunakan probe dengan konstanta pegas rendah (k) yang sangat sesuai dengan modulus sampel dan ujung setengah bola/bulat sehingga probe pertama tidak menembus permukaan sampel pada kontak pertama dengan material lunak. Penting juga bahwa sinyal defleksi yang dihasilkan oleh probe cukup kuat untuk dideteksi oleh sistem detektor laser24,34,46,47. Dalam kasus sel, jaringan, dan gel heterogen ultra-lunak, tantangan lain adalah mengatasi gaya adhesif antara probe dan permukaan sampel untuk memastikan pengukuran yang dapat direproduksi dan andal48,49,50. Hingga saat ini, sebagian besar penelitian tentang nanoindentasi AFM berfokus pada studi perilaku mekanis sel biologis, jaringan, gel, hidrogel, dan biomolekul menggunakan probe bulat yang relatif besar, yang umumnya disebut sebagai probe koloid (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Ujung-ujung ini memiliki radius 1 hingga 50 µm dan umumnya terbuat dari kaca borosilikat, polimetil metakrilat (PMMA), polistirena (PS), silikon dioksida (SiO2) dan karbon seperti berlian (DLC). Meskipun nanoindentasi CP-AFM sering kali menjadi pilihan pertama untuk karakterisasi sampel lunak, ia memiliki masalah dan keterbatasannya sendiri. Penggunaan ujung bola berukuran mikron yang besar meningkatkan total area kontak ujung dengan sampel dan menghasilkan hilangnya resolusi spasial yang signifikan. Untuk spesimen lunak dan tidak homogen, di mana sifat mekanis elemen lokal mungkin berbeda secara signifikan dari rata-rata di area yang lebih luas, indentasi CP dapat menyembunyikan ketidakhomogenan apa pun dalam sifat pada skala lokal52. Probe koloid biasanya dibuat dengan menempelkan bola koloid berukuran mikron ke kantilever tanpa ujung menggunakan perekat epoksi. Proses manufaktur itu sendiri sarat dengan banyak masalah dan dapat menyebabkan inkonsistensi dalam proses kalibrasi probe. Selain itu, ukuran dan massa partikel koloid secara langsung memengaruhi parameter kalibrasi utama kantilever, seperti frekuensi resonansi, kekakuan pegas, dan sensitivitas defleksi56,57,58. Dengan demikian, metode yang umum digunakan untuk probe AFM konvensional, seperti kalibrasi suhu, mungkin tidak memberikan kalibrasi yang akurat untuk CP, dan metode lain mungkin diperlukan untuk melakukan koreksi ini57, 59, 60, 61. Eksperimen indentasi CP yang umum menggunakan deviasi kantilever yang besar untuk mempelajari sifat sampel lunak, yang menciptakan masalah lain ketika mengkalibrasi perilaku non-linier kantilever pada deviasi yang relatif besar62,63,64. Metode indentasi probe koloid modern biasanya memperhitungkan geometri kantilever yang digunakan untuk mengkalibrasi probe, tetapi mengabaikan pengaruh partikel koloid, yang menciptakan ketidakpastian tambahan dalam akurasi metode38,61. Demikian pula, modulus elastisitas yang dihitung dengan pemasangan model kontak bergantung langsung pada geometri probe indentasi, dan ketidaksesuaian antara karakteristik ujung dan permukaan sampel dapat menyebabkan ketidakakuratan27, 65, 66, 67, 68. Beberapa penelitian terbaru oleh Spencer dkk. menyoroti faktor-faktor yang perlu dipertimbangkan saat mengkarakterisasi sikat polimer lunak menggunakan metode nanoindentasi CP-AFM. Mereka melaporkan bahwa retensi fluida kental dalam sikat polimer sebagai fungsi kecepatan menghasilkan peningkatan beban kepala dan dengan demikian menghasilkan pengukuran yang berbeda terhadap sifat-sifat yang bergantung pada kecepatan30, 69, 70, 71.
Dalam studi ini, kami telah mengkarakterisasi modulus permukaan material ultra-lunak yang sangat elastis lehfilcon A CL menggunakan metode nanoindentasi AFM yang dimodifikasi. Mengingat sifat dan struktur baru material ini, rentang sensitivitas metode indentasi tradisional jelas tidak cukup untuk mengkarakterisasi modulus material yang sangat lunak ini, sehingga perlu menggunakan metode nanoindentasi AFM dengan sensitivitas yang lebih tinggi dan tingkat sensitivitas yang lebih rendah. Setelah meninjau kekurangan dan masalah teknik nanoindentasi probe AFM koloid yang ada, kami menunjukkan mengapa kami memilih probe AFM yang lebih kecil dan dirancang khusus untuk menghilangkan sensitivitas, noise latar belakang, menentukan titik kontak, mengukur modulus kecepatan material heterogen yang lunak seperti ketergantungan retensi fluida. dan kuantifikasi yang akurat. Selain itu, kami dapat mengukur bentuk dan dimensi ujung indentasi secara akurat, yang memungkinkan kami untuk menggunakan model kecocokan kerucut-bola untuk menentukan modulus elastisitas tanpa menilai area kontak ujung dengan material. Dua asumsi implisit yang dikuantifikasi dalam penelitian ini adalah sifat material yang sepenuhnya elastis dan modulus yang tidak bergantung pada kedalaman lekukan. Dengan menggunakan metode ini, pertama-tama kami menguji standar ultra-lunak dengan modulus yang diketahui untuk mengkuantifikasi metode tersebut, kemudian menggunakan metode ini untuk mengkarakterisasi permukaan dua material lensa kontak yang berbeda. Metode karakterisasi permukaan nanoindentasi AFM dengan sensitivitas yang lebih tinggi ini diharapkan dapat diterapkan pada berbagai macam material ultra-lunak heterogen biomimetik dengan potensi penggunaan dalam perangkat medis dan aplikasi biomedis.
Lensa kontak Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, AS) dan substrat hidrogel silikonnya dipilih untuk eksperimen nanoindentasi. Dudukan lensa yang dirancang khusus digunakan dalam eksperimen ini. Untuk memasang lensa untuk pengujian, lensa ditempatkan dengan hati-hati pada dudukan berbentuk kubah, memastikan tidak ada gelembung udara yang masuk, dan kemudian difiksasi dengan tepinya. Sebuah lubang pada perlengkapan di bagian atas dudukan lensa menyediakan akses ke pusat optik lensa untuk eksperimen nanoindentasi sambil menahan cairan di tempatnya. Ini menjaga lensa tetap terhidrasi sepenuhnya. 500 μl larutan kemasan lensa kontak digunakan sebagai larutan uji. Untuk memverifikasi hasil kuantitatif, hidrogel poliakrilamida non-aktif (PAAM) yang tersedia secara komersial disiapkan dari komposisi poliakrilamida-ko-metilen-bisakrilamida (cawan Petrisoft Petri 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, AS), dengan modulus elastisitas yang diketahui sebesar 1 kPa. Gunakan 4-5 tetes (sekitar 125 µl) larutan penyangga fosfat (PBS dari Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, AS) dan 1 tetes larutan lensa kontak OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, AS). ) pada antarmuka hidrogel-probe AFM.
Sampel substrat Lehfilcon A CL dan SiHy divisualisasikan menggunakan sistem Mikroskop Elektron Pemindai Emisi Lapangan (FEG SEM) FEI Quanta 250 yang dilengkapi detektor Mikroskop Elektron Transmisi Pemindaian (STEM). Untuk mempersiapkan sampel, lensa dicuci terlebih dahulu dengan air dan dipotong menjadi irisan berbentuk pai. Untuk mencapai kontras diferensial antara komponen hidrofilik dan hidrofobik sampel, larutan RuO4 0,10% yang distabilkan digunakan sebagai pewarna, dan sampel direndam selama 30 menit. Pewarnaan RuO4 pada Lehfilcon A CL penting tidak hanya untuk mencapai kontras diferensial yang lebih baik, tetapi juga membantu mempertahankan struktur sikat polimer bercabang dalam bentuk aslinya, yang kemudian terlihat pada gambar STEM. Sikat-sikat tersebut kemudian dicuci dan didehidrasi dalam serangkaian campuran etanol/air dengan peningkatan konsentrasi etanol. Sampel kemudian dicetak dengan epoksi EMBed 812/Araldit, yang diawetkan semalaman pada suhu 70°C. Blok sampel yang diperoleh melalui polimerisasi resin dipotong dengan ultramikrotom, dan irisan tipis yang dihasilkan divisualisasikan dengan detektor STEM dalam mode vakum rendah dengan tegangan percepatan 30 kV. Sistem SEM yang sama digunakan untuk karakterisasi detail probe AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, AS). Citra SEM probe AFM diperoleh dalam mode vakum tinggi tipikal dengan tegangan percepatan 30 kV. Citra diperoleh pada berbagai sudut dan perbesaran untuk merekam semua detail bentuk dan ukuran ujung probe AFM. Semua dimensi ujung yang diinginkan dalam citra diukur secara digital.
Mikroskop gaya atom Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, AS) dengan mode "PeakForce QNM in Fluid" digunakan untuk memvisualisasikan dan mengindentasi nano sampel lehfilcon A CL, substrat SiHy, dan hidrogel PAAm. Untuk eksperimen pencitraan, probe PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) dengan radius ujung nominal 1 nm digunakan untuk menangkap gambar sampel beresolusi tinggi pada laju pemindaian 0,50 Hz. Semua gambar diambil dalam larutan air.
Percobaan nanoindentasi AFM dilakukan menggunakan probe PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Probe AFM memiliki ujung silikon pada kantilever nitrida setebal 345 nm, panjang 54 µm dan lebar 4,5 µm dengan frekuensi resonansi 45 kHz. Probe ini dirancang khusus untuk mengkarakterisasi dan melakukan pengukuran nanomekanis kuantitatif pada sampel biologis lunak. Sensor dikalibrasi secara individual di pabrik dengan pengaturan pegas yang telah dikalibrasi sebelumnya. Konstanta pegas probe yang digunakan dalam penelitian ini berada dalam kisaran 0,05–0,1 N/m. Untuk menentukan bentuk dan ukuran ujung secara akurat, probe dikarakterisasi secara detail menggunakan SEM. Pada gbr. Gambar 1a menunjukkan mikrograf elektron pemindaian beresolusi tinggi dan perbesaran rendah dari probe PFQNM-LC-A-CAL, yang memberikan pandangan holistik dari desain probe. Pada gbr. Gambar 1b menunjukkan tampilan bagian atas ujung probe yang diperbesar, memberikan informasi tentang bentuk dan ukuran ujungnya. Di ujung terluarnya, jarum berbentuk hemisfer dengan diameter sekitar 140 nm (Gbr. 1c). Di bawahnya, ujungnya meruncing menjadi bentuk kerucut, mencapai panjang terukur sekitar 500 nm. Di luar daerah meruncing, ujungnya berbentuk silinder dan berakhir dengan panjang total ujung 1,18 µm. Ini adalah bagian fungsional utama dari ujung probe. Selain itu, probe polistirena (PS) bulat besar (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, AS) dengan diameter ujung 45 µm dan konstanta pegas 2 N/m juga digunakan untuk pengujian sebagai probe koloid dengan probe PFQNM-LC-A-CAL 140 nm sebagai pembanding.
Telah dilaporkan bahwa cairan dapat terperangkap di antara probe AFM dan struktur sikat polimer selama nanoindentasi, yang akan memberikan gaya ke atas pada probe AFM sebelum benar-benar menyentuh permukaan69. Efek ekstrusi kental ini karena retensi cairan dapat mengubah titik kontak yang tampak, sehingga memengaruhi pengukuran modulus permukaan. Untuk mempelajari efek geometri probe dan kecepatan indentasi pada retensi cairan, kurva gaya indentasi diplot untuk sampel lehfilcon A CL menggunakan probe berdiameter 140 nm pada laju perpindahan konstan 1 µm/s dan 2 µm/s. diameter probe 45 µm, pengaturan gaya tetap 6 nN dicapai pada 1 µm/s. Eksperimen dengan probe berdiameter 140 nm dilakukan pada kecepatan indentasi 1 µm/s dan gaya tetap 300 pN, dipilih untuk menciptakan tekanan kontak dalam rentang fisiologis (1–8 kPa) kelopak mata atas. Sampel lunak hidrogel PAA siap pakai dengan tekanan 1 kPa diuji untuk gaya lekukan 50 pN pada kecepatan 1 μm/s menggunakan probe dengan diameter 140 nm.
Karena panjang bagian kerucut ujung probe PFQNM-LC-A-CAL kira-kira 500 nm, untuk setiap kedalaman lekukan < 500 nm, dapat diasumsikan dengan aman bahwa geometri probe selama lekukan akan tetap sesuai dengan bentuk kerucutnya. Selain itu, diasumsikan bahwa permukaan material yang diuji akan menunjukkan respons elastis reversibel, yang juga akan dikonfirmasi di bagian berikut. Oleh karena itu, tergantung pada bentuk dan ukuran ujungnya, kami memilih model pemasangan kerucut-bola yang dikembangkan oleh Briscoe, Sebastian, dan Adams, yang tersedia dalam perangkat lunak vendor, untuk memproses eksperimen nanoindentasi AFM kami (NanoScope). Perangkat lunak analisis data pemisahan, Bruker) 73. Model tersebut menggambarkan hubungan gaya-perpindahan F(δ) untuk kerucut dengan cacat puncak bola. Pada gambar. Gambar 2 menunjukkan geometri kontak selama interaksi kerucut kaku dengan ujung bola, dengan R adalah jari-jari ujung bola, a adalah jari-jari kontak, b adalah jari-jari kontak di ujung ujung bola, δ adalah jari-jari kontak, kedalaman lekukan, dan θ adalah setengah sudut kerucut. Citra SEM probe ini dengan jelas menunjukkan bahwa ujung bola berdiameter 140 nm menyatu secara tangensial ke dalam kerucut, sehingga di sini b didefinisikan hanya melalui R, yaitu b = R cos θ. Perangkat lunak yang disediakan vendor menyediakan hubungan kerucut-bola untuk menghitung nilai modulus Young (E) dari data pemisahan gaya dengan asumsi a > b. Hubungan:
dengan F adalah gaya indentasi, E adalah modulus Young, dan ν adalah rasio Poisson. Jari-jari kontak a dapat diperkirakan menggunakan:
Skema geometri kontak kerucut kaku dengan ujung bulat ditekan ke bahan lensa kontak Lefilcon dengan lapisan permukaan sikat polimer bercabang.
Jika a ≤ b, maka hubungannya disederhanakan menjadi persamaan untuk penekan bola konvensional;
Kami yakin bahwa interaksi probe indentasi dengan struktur bercabang sikat polimer PMPC akan menyebabkan radius kontak a lebih besar daripada radius kontak sferis b. Oleh karena itu, untuk semua pengukuran kuantitatif modulus elastisitas yang dilakukan dalam studi ini, kami menggunakan ketergantungan yang diperoleh untuk kasus a > b.
Bahan biomimetik ultralunak yang dipelajari dalam studi ini dicitrakan secara komprehensif menggunakan mikroskop elektron transmisi pemindaian (STEM) dari penampang sampel dan mikroskop gaya atom (AFM) permukaan. Karakterisasi permukaan terperinci ini dilakukan sebagai perluasan dari pekerjaan kami yang diterbitkan sebelumnya, di mana kami menentukan bahwa struktur sikat polimer bercabang dinamis dari permukaan lehfilcon A CL yang dimodifikasi PMPC menunjukkan sifat mekanis yang serupa dengan jaringan kornea asli 14 . Untuk alasan ini, kami menyebut permukaan lensa kontak sebagai bahan biomimetik14. Pada gbr. 3a,b menunjukkan penampang struktur sikat polimer PMPC bercabang pada permukaan substrat lehfilcon A CL dan substrat SiHy yang tidak dirawat, masing-masing. Permukaan kedua sampel dianalisis lebih lanjut menggunakan gambar AFM resolusi tinggi, yang selanjutnya mengonfirmasi hasil analisis STEM (Gbr. 3c, d). Secara keseluruhan, gambar-gambar ini memberikan perkiraan panjang struktur sikat polimer bercabang PMPC pada 300–400 nm, yang penting untuk menginterpretasi pengukuran nanoindentasi AFM. Observasi penting lainnya yang diperoleh dari gambar-gambar ini adalah bahwa struktur permukaan keseluruhan material biomimetik CL secara morfologis berbeda dari material substrat SiHy. Perbedaan morfologi permukaan ini dapat terlihat selama interaksi mekanisnya dengan probe AFM yang menjorok dan selanjutnya pada nilai modulus yang terukur.
Citra STEM penampang lintang (a) lehfilcon A CL dan (b) substrat SiHy. Skala batang, 500 nm. Citra AFM permukaan substrat lehfilcon A CL (c) dan substrat dasar SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polimer bioinspired dan struktur sikat polimer pada dasarnya lunak dan telah banyak dipelajari serta digunakan dalam berbagai aplikasi biomedis. Oleh karena itu, penting untuk menggunakan metode nanoindentasi AFM, yang dapat mengukur sifat mekaniknya secara akurat dan andal. Namun, pada saat yang sama, sifat unik dari material ultra-lunak ini, seperti modulus elastisitas yang sangat rendah, kandungan cairan yang tinggi, dan elastisitas yang tinggi, seringkali menyulitkan pemilihan material, bentuk, dan ukuran probe indentasi yang tepat. Hal ini penting agar indenter tidak menembus permukaan lunak sampel, yang dapat menyebabkan kesalahan dalam menentukan titik kontak dengan permukaan dan luas kontak.
Untuk itu, pemahaman komprehensif tentang morfologi material biomimetik ultra-lunak (lehfilcon A CL) sangat penting. Informasi tentang ukuran dan struktur sikat polimer bercabang yang diperoleh menggunakan metode pencitraan memberikan dasar untuk karakterisasi mekanis permukaan menggunakan teknik nanoindentasi AFM. Alih-alih menggunakan probe koloid sferis berukuran mikron, kami memilih probe silikon nitrida PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) dengan diameter ujung 140 nm, yang dirancang khusus untuk pemetaan kuantitatif sifat mekanis sampel biologis 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Alasan penggunaan probe yang relatif tajam dibandingkan dengan probe koloid konvensional dapat dijelaskan oleh fitur struktural material tersebut. Dengan membandingkan ukuran ujung probe (~140 nm) dengan sikat polimer bercabang pada permukaan CL lehfilcon A, yang ditunjukkan pada Gambar 3a, dapat disimpulkan bahwa ujungnya cukup besar untuk bersentuhan langsung dengan struktur sikat ini, sehingga mengurangi kemungkinan ujungnya menembus struktur tersebut. Untuk mengilustrasikan hal ini, pada Gambar 4 terdapat gambar STEM lehfilcon A CL dan ujung probe AFM yang menjorok (digambar sesuai skala).
Skema yang menunjukkan gambar STEM lehfilcon A CL dan probe lekukan ACM (digambar sesuai skala).
Selain itu, ukuran ujung 140 nm cukup kecil untuk menghindari risiko efek ekstrusi lengket yang sebelumnya dilaporkan untuk sikat polimer yang diproduksi oleh metode nanoindentasi CP-AFM69,71. Kami berasumsi bahwa karena bentuk kerucut-bola khusus dan ukuran ujung AFM yang relatif kecil (Gbr. 1), sifat kurva gaya yang dihasilkan oleh nanoindentasi lehfilcon A CL tidak akan bergantung pada kecepatan indentasi atau kecepatan pemuatan/pembongkaran. Oleh karena itu, tidak terpengaruh oleh efek poroelastis. Untuk menguji hipotesis ini, sampel lehfilcon A CL diindentasi pada gaya maksimum tetap menggunakan probe PFQNM-LC-A-CAL, tetapi pada dua kecepatan yang berbeda, dan kurva gaya tarik dan gaya retraksi yang dihasilkan digunakan untuk memplot gaya (nN) dalam pemisahan (µm) ditunjukkan pada Gambar 5a. Terlihat jelas bahwa kurva gaya selama pemuatan dan pembongkaran sepenuhnya tumpang tindih, dan tidak ada bukti yang jelas bahwa gaya geser pada kedalaman lekukan nol meningkat seiring dengan kecepatan lekukan pada gambar. Hal ini menunjukkan bahwa masing-masing elemen sikat dikarakterisasi tanpa efek poroelastis. Sebaliknya, efek retensi fluida (efek ekstrusi viskos dan poroelastisitas) terlihat jelas pada probe AFM berdiameter 45 µm pada kecepatan lekukan yang sama dan ditunjukkan oleh histeresis antara kurva regangan dan retraksi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5b. Hasil ini mendukung hipotesis dan menunjukkan bahwa probe berdiameter 140 nm merupakan pilihan yang baik untuk mengkarakterisasi permukaan lunak tersebut.
Kurva gaya lekukan CL lehfilcon A menggunakan ACM; (a) menggunakan probe dengan diameter 140 nm pada dua laju pembebanan, menunjukkan tidak adanya efek poroelastis selama lekukan permukaan; (b) menggunakan probe dengan diameter 45 µm dan 140 nm. menunjukkan efek ekstrusi kental dan poroelastisitas untuk probe besar dibandingkan dengan probe yang lebih kecil.
Untuk mengkarakterisasi permukaan ultralunak, metode nanoindentasi AFM harus memiliki probe terbaik untuk mempelajari sifat-sifat material yang diteliti. Selain bentuk dan ukuran ujung, sensitivitas sistem detektor AFM, sensitivitas terhadap defleksi ujung di lingkungan pengujian, dan kekakuan kantilever memainkan peran penting dalam menentukan akurasi dan keandalan pengukuran nanoindentasi. Untuk sistem AFM kami, batas deteksi Position Sensitive Detector (PSD) kira-kira 0,5 mV dan didasarkan pada laju pegas pra-kalibrasi dan sensitivitas defleksi fluida terhitung dari probe PFQNM-LC-A-CAL, yang sesuai dengan sensitivitas beban teoritis. kurang dari 0,1 pN. Oleh karena itu, metode ini memungkinkan pengukuran gaya indentasi minimum ≤ 0,1 pN tanpa komponen derau periferal. Akan tetapi, hampir mustahil bagi sistem AFM untuk mengurangi derau periferal ke tingkat ini karena faktor-faktor seperti getaran mekanis dan dinamika fluida. Faktor-faktor ini membatasi sensitivitas keseluruhan metode nanoindentasi AFM dan juga menghasilkan sinyal derau latar belakang sekitar ≤ 10 pN. Untuk karakterisasi permukaan, sampel lehfilcon A CL dan substrat SiHy diindentasi dalam kondisi terhidrasi penuh menggunakan probe 140 nm untuk karakterisasi SEM, dan kurva gaya yang dihasilkan ditumpangkan antara gaya (pN) dan tekanan. Plot pemisahan (µm) ditunjukkan pada Gambar 6a. Dibandingkan dengan substrat dasar SiHy, kurva gaya lehfilcon A CL dengan jelas menunjukkan fase transisi yang dimulai pada titik kontak dengan sikat polimer bercabang dan berakhir dengan perubahan tajam pada kemiringan yang menandai kontak ujung dengan material di bawahnya. Bagian transisi dari kurva gaya ini menyoroti perilaku elastis sikat polimer bercabang yang sebenarnya di permukaan, sebagaimana dibuktikan oleh kurva kompresi yang mengikuti kurva tegangan dan kontras dalam sifat mekanis antara struktur sikat dan material SiHy yang besar. Saat membandingkan lefilcon. Pemisahan panjang rata-rata sikat polimer bercabang pada citra STEM PCS (Gambar 3a) dan kurva gaya sepanjang sumbu absis pada Gambar 3a. 6a menunjukkan bahwa metode ini mampu mendeteksi ujung dan polimer bercabang yang mencapai bagian paling atas permukaan. Kontak antar struktur sikat. Selain itu, tumpang tindih yang rapat pada kurva gaya menunjukkan tidak adanya efek retensi cairan. Dalam hal ini, sama sekali tidak ada adhesi antara jarum dan permukaan sampel. Bagian paling atas kurva gaya untuk kedua sampel saling tumpang tindih, mencerminkan kesamaan sifat mekanis material substrat.
(a) Kurva gaya nanoindentasi AFM untuk substrat lehfilcon A CL dan substrat SiHy, (b) kurva gaya yang menunjukkan estimasi titik kontak menggunakan metode ambang batas kebisingan latar belakang.
Untuk mempelajari detail kurva gaya yang lebih halus, kurva tegangan sampel lehfilcon A CL diplot ulang pada Gambar 6b ​​dengan gaya maksimum 50 pN sepanjang sumbu y. Grafik ini memberikan informasi penting tentang derau latar belakang asli. Derau tersebut berada dalam rentang ±10 pN, yang digunakan untuk menentukan titik kontak secara akurat dan menghitung kedalaman indentasi. Sebagaimana dilaporkan dalam literatur, identifikasi titik kontak sangat penting untuk menilai sifat material seperti modulus secara akurat85. Pendekatan yang melibatkan pemrosesan otomatis data kurva gaya telah menunjukkan kesesuaian yang lebih baik antara pencocokan data dan pengukuran kuantitatif untuk material lunak86. Dalam penelitian ini, pilihan titik kontak kami relatif sederhana dan objektif, tetapi memiliki keterbatasan. Pendekatan konservatif kami dalam menentukan titik kontak dapat menghasilkan nilai modulus yang sedikit terlalu tinggi untuk kedalaman indentasi yang lebih kecil (< 100 nm). Penggunaan deteksi titik sentuh berbasis algoritma dan pemrosesan data otomatis dapat menjadi kelanjutan dari penelitian ini di masa mendatang untuk lebih meningkatkan metode kami. Dengan demikian, untuk derau latar belakang intrinsik pada orde ±10 pN, kami mendefinisikan titik kontak sebagai titik data pertama pada sumbu-x pada Gambar 6b ​​dengan nilai ≥10 pN. Kemudian, sesuai dengan ambang batas derau 10 pN, garis vertikal pada level ~0,27 µm menandai titik kontak dengan permukaan, setelah itu kurva peregangan berlanjut hingga substrat memenuhi kedalaman lekukan ~270 nm. Menariknya, berdasarkan ukuran fitur sikat polimer bercabang (300–400 nm) yang diukur menggunakan metode pencitraan, kedalaman lekukan sampel CL lehfilcon A yang diamati menggunakan metode ambang batas derau latar belakang adalah sekitar 270 nm, yang sangat dekat dengan ukuran pengukuran dengan STEM. Hasil ini selanjutnya mengonfirmasi kompatibilitas dan penerapan bentuk dan ukuran ujung probe AFM untuk lekukan struktur sikat polimer bercabang yang sangat lembut dan sangat elastis ini. Data ini juga memberikan bukti kuat yang mendukung metode kami dalam menggunakan derau latar belakang sebagai ambang batas untuk menentukan titik kontak. Dengan demikian, hasil kuantitatif apa pun yang diperoleh dari pemodelan matematika dan pencocokan kurva gaya seharusnya relatif akurat.
Pengukuran kuantitatif dengan metode nanoindentasi AFM sepenuhnya bergantung pada model matematika yang digunakan untuk pemilihan data dan analisis selanjutnya. Oleh karena itu, penting untuk mempertimbangkan semua faktor yang terkait dengan pilihan indentor, sifat material dan mekanika interaksi mereka sebelum memilih model tertentu. Dalam hal ini, geometri ujung dikarakterisasi dengan hati-hati menggunakan mikrograf SEM (Gbr. 1), dan berdasarkan hasilnya, probe nanoindentasi AFM berdiameter 140 nm dengan kerucut keras dan geometri ujung bulat adalah pilihan yang baik untuk mengkarakterisasi sampel lehfilcon A CL79. Faktor penting lain yang perlu dievaluasi dengan hati-hati adalah elastisitas bahan polimer yang diuji. Meskipun data awal nanoindentasi (Gbr. 5a dan 6a) dengan jelas menguraikan fitur tumpang tindih kurva tegangan dan kompresi, yaitu, pemulihan elastis lengkap material, sangat penting untuk mengkonfirmasi sifat elastis murni dari kontak. Untuk tujuan ini, dua indentasi berturut-turut dilakukan pada lokasi yang sama pada permukaan sampel lehfilcon A CL dengan laju indentasi 1 µm/detik dalam kondisi hidrasi penuh. Data kurva gaya yang dihasilkan ditunjukkan pada Gambar 7 dan, seperti yang diharapkan, kurva ekspansi dan kompresi kedua cetakan hampir identik, yang menunjukkan elastisitas tinggi struktur sikat polimer bercabang.
Dua kurva gaya lekukan pada lokasi yang sama pada permukaan lehfilcon A CL menunjukkan elastisitas permukaan lensa yang ideal.
Berdasarkan informasi yang diperoleh dari gambar SEM dan STEM ujung probe dan permukaan CL lehfilcon A, model kerucut-bola merupakan representasi matematis yang memadai dari interaksi antara ujung probe AFM dan material polimer lunak yang diuji. Selain itu, untuk model kerucut-bola ini, asumsi dasar tentang sifat elastis material yang dicetak berlaku untuk material biomimetik baru ini dan digunakan untuk mengkuantifikasi modulus elastisitas.
Bahasa Indonesia: Setelah evaluasi menyeluruh terhadap metode nanoindentasi AFM dan komponen-komponennya, termasuk properti probe indentasi (bentuk, ukuran, dan kekakuan pegas), sensitivitas (estimasi noise latar belakang dan titik kontak), dan model pemasangan data (pengukuran modulus kuantitatif), metode tersebut digunakan. mengkarakterisasi sampel ultra-lunak yang tersedia secara komersial untuk memverifikasi hasil kuantitatif. Hidrogel poliakrilamida (PAAM) komersial dengan modulus elastisitas 1 kPa diuji dalam kondisi terhidrasi menggunakan probe 140 nm. Rincian pengujian dan perhitungan modul disediakan dalam Informasi Tambahan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa modulus rata-rata yang diukur adalah 0,92 kPa, dan %RSD dan persentase (%) deviasi dari modulus yang diketahui kurang dari 10%. Hasil-hasil ini mengonfirmasi keakuratan dan reproduktifitas metode nanoindentasi AFM yang digunakan dalam pekerjaan ini untuk mengukur modulus material ultralunak. Permukaan sampel lehfilcon A CL dan substrat dasar SiHy selanjutnya dikarakterisasi menggunakan metode nanoindentasi AFM yang sama untuk mempelajari modulus kontak nyata dari permukaan ultralunak sebagai fungsi kedalaman indentasi. Kurva pemisahan gaya indentasi dibuat untuk tiga spesimen dari setiap jenis (n = 3; satu indentasi per spesimen) pada gaya 300 pN, kecepatan 1 µm/s, dan hidrasi penuh. Kurva pembagian gaya indentasi didekati menggunakan model kerucut-bola. Untuk mendapatkan modulus yang bergantung pada kedalaman indentasi, sebagian kurva gaya selebar 40 nm ditetapkan pada setiap kenaikan 20 nm mulai dari titik kontak, dan nilai modulus yang diukur pada setiap langkah kurva gaya. Pendekatan serupa telah digunakan untuk mengkarakterisasi gradien modulus sikat polimer poli(lauril metakrilat) (P12MA) menggunakan nanoindentasi probe AFM koloid, dan hasilnya konsisten dengan data yang menggunakan model kontak Hertz. Pendekatan ini menghasilkan plot modulus kontak semu (kPa) versus kedalaman indentasi (nm), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8, yang mengilustrasikan gradien modulus/kedalaman kontak semu. Modulus elastisitas terhitung dari sampel CL lehfilcon A berada dalam rentang 2–3 kPa dalam 100 nm teratas sampel, di luar itu modulus mulai meningkat seiring bertambahnya kedalaman. Di sisi lain, saat menguji substrat dasar SiHy tanpa lapisan film seperti sikat di permukaan, kedalaman indentasi maksimum yang dicapai pada gaya 300 pN kurang dari 50 nm, dan nilai modulus yang diperoleh dari data tersebut sekitar 400 kPa, yang sebanding dengan nilai modulus Young untuk material curah.
Modulus kontak nyata (kPa) vs. kedalaman lekukan (nm) untuk substrat lehfilcon A CL dan SiHy menggunakan metode nanoindentasi AFM dengan geometri kerucut-bola untuk mengukur modulus.
Permukaan paling atas struktur sikat polimer bercabang biomimetik yang baru menunjukkan modulus elastisitas yang sangat rendah (2–3 kPa). Nilai ini akan sama dengan ujung sikat polimer bercabang yang menggantung bebas seperti yang ditunjukkan pada gambar STEM. Meskipun terdapat beberapa bukti gradien modulus di tepi luar CL, substrat modulus tinggi utama lebih berpengaruh. Namun, 100 nm teratas permukaan berada dalam rentang 20% ​​dari total panjang sikat polimer bercabang, sehingga cukup masuk akal untuk berasumsi bahwa nilai modulus terukur dalam rentang kedalaman indentasi ini relatif akurat dan tidak terlalu bergantung pada pengaruh objek di bawahnya.
Karena desain biomimetik lensa kontak Lehfilcon A yang unik, yang terdiri dari struktur sikat polimer PMPC bercabang yang dicangkokkan ke permukaan substrat SiHy, sangat sulit untuk mengkarakterisasi sifat mekanis struktur permukaannya secara andal menggunakan metode pengukuran tradisional. Di sini, kami menyajikan metode nanoindentasi AFM canggih untuk mengkarakterisasi material ultra-lunak seperti Lefilcon A dengan kadar air tinggi dan elastisitas yang sangat tinggi secara akurat. Metode ini didasarkan pada penggunaan probe AFM yang ukuran dan geometri ujung-ujungnya dipilih secara cermat agar sesuai dengan dimensi struktural fitur permukaan ultra-lunak yang akan dicetak. Kombinasi dimensi antara probe dan struktur ini memberikan sensitivitas yang lebih tinggi, memungkinkan kami untuk mengukur modulus rendah dan sifat elastis inheren dari elemen sikat polimer bercabang, terlepas dari efek poroelastisnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sikat polimer PMPC bercabang yang unik, karakteristik permukaan lensa, memiliki modulus elastisitas yang sangat rendah (hingga 2 kPa) dan elastisitas yang sangat tinggi (hampir 100%) ketika diuji dalam lingkungan berair. Hasil nanoindentasi AFM juga memungkinkan kami untuk mengkarakterisasi gradien modulus kontak/kedalaman semu (30 kPa/200 nm) permukaan lensa biomimetik. Gradien ini mungkin disebabkan oleh perbedaan modulus antara sikat polimer bercabang dan substrat SiHy, atau struktur/densitas sikat polimer yang bercabang, atau kombinasi keduanya. Namun, studi lebih lanjut yang mendalam diperlukan untuk memahami sepenuhnya hubungan antara struktur dan sifat, terutama pengaruh percabangan sikat terhadap sifat mekanis. Pengukuran serupa dapat membantu mengkarakterisasi sifat mekanis permukaan material ultra-lunak dan perangkat medis lainnya.
Kumpulan data yang dihasilkan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari masing-masing penulis berdasarkan permintaan yang wajar.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K., dan Haugen, HJ. Reaksi biologis terhadap sifat fisik dan kimia permukaan biomaterial. Chemical Society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM dan Liu, X. Peningkatan biomaterial turunan manusia untuk rekayasa jaringan. pemrograman. polimer. sains. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. dkk. Desain, implementasi klinis, dan respons imun biomaterial dalam pengobatan regeneratif. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK dan Farr GM. Metode yang disempurnakan untuk menentukan kekerasan dan modulus elastisitas menggunakan eksperimen indentasi dengan pengukuran beban dan perpindahan. J. Alma mater. tangki penyimpanan. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Asal usul historis pengujian kekerasan lekukan. Almamater. Ilmu pengetahuan. Teknologi. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Pengukuran Kekerasan Indentasi pada Skala Makro, Mikro, dan Nano: Tinjauan Kritis. suku. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD dan Clapperich, SM. Kesalahan deteksi permukaan menyebabkan overestimasi modulus dalam nanoindentasi material lunak. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. Almamater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR, dan Yahya M.Yu. Evaluasi metode nanoindentasi untuk menentukan karakteristik mekanis nanokomposit heterogen menggunakan metode eksperimen dan komputasi. Sains. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, dan Owart, TS. Karakterisasi mekanis gel viskoelastis lunak dengan analisis elemen hingga invers berbasis indentasi dan optimasi. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. Almamater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J, dan Chaneler D. Optimasi penentuan viskoelastisitas menggunakan sistem pengukuran yang kompatibel. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. dan Pellillo, E. Nanoindentasi permukaan polimer. J. Fisika. D. Terapkan untuk fisika. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D., dan Van Vliet KJ. Karakterisasi sifat mekanik viskoelastis polimer dan jaringan biologis yang sangat elastis menggunakan indentasi kejut. Jurnal Biomaterial. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluasi modulus elastisitas dan kerja adhesi bahan lunak menggunakan metode Borodich-Galanov (BG) yang diperluas dan lekukan dalam. bulu. almamater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. dkk. Morfologi skala nano dan sifat mekanik permukaan polimer biomimetik lensa kontak hidrogel silikon. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).