Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Ön korlátozott CSS-támogatású böngészőverziót használ. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy frissítse böngészőjét (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Ezenkívül a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Három diából álló forgószalagot jelenít meg egyszerre. Az Előző és Következő gombokkal egyszerre három dián, vagy a végén található csúszkagombokkal egyszerre három dián lapozhat.
Az orvostechnikai eszközökhöz és biomedicinális alkalmazásokhoz kifejlesztett új, ultralágy anyagok fizikai és mechanikai tulajdonságaik átfogó jellemzése egyszerre fontos és kihívást jelentő. Módosított atomerő-mikroszkópos (AFM) nanoindentációs technikát alkalmaztak az új lehfilcon A biomimetikus szilikon-hidrogél kontaktlencse rendkívül alacsony felületi modulusának jellemzésére, amelyet elágazó polimer kefeszerkezet rétegével vontak be. Ez a módszer lehetővé teszi az érintkezési pontok pontos meghatározását a viszkózus extrudálás hatásai nélkül az elágazó polimerek megközelítése során. Ezenkívül lehetővé teszi az egyes kefeelemek mechanikai jellemzőinek meghatározását a poroelaszticitás hatása nélkül. Ezt úgy érik el, hogy egy olyan AFM-szondát választanak, amelynek kialakítása (hegyméret, geometria és rugóerő) különösen alkalmas a puha anyagok és biológiai minták tulajdonságainak mérésére. Ez a módszer javítja az érzékenységet és a pontosságot a nagyon puha lehfilcon A anyag pontos mérésében, amelynek rendkívül alacsony a rugalmassági modulusa a felületen (akár 2 kPa), és rendkívül nagy a rugalmassága a belső (szinte 100%-os) vizes környezetben. A felületvizsgálat eredményei nemcsak a lehfilcon A lencse ultralágy felületi tulajdonságait mutatták ki, hanem azt is, hogy az elágazó polimer kefék modulusa összehasonlítható a szilícium-hidrogén hordozó modulusával. Ez a felületjellemzési technika más ultralágy anyagokra és orvostechnikai eszközökre is alkalmazható.
Az élő szövetekkel való közvetlen érintkezésre tervezett anyagok mechanikai tulajdonságait gyakran a biológiai környezet határozza meg. Ezen anyagtulajdonságok tökéletes illeszkedése segít elérni az anyag kívánt klinikai jellemzőit anélkül, hogy káros sejtválaszokat okozna1,2,3. Tömeges homogén anyagok esetében a mechanikai tulajdonságok jellemzése viszonylag egyszerű a standard eljárások és vizsgálati módszerek (pl. mikrobenyomódás4,5,6) elérhetősége miatt. Azonban az ultralágy anyagok, például gélek, hidrogélek, biopolimerek, élő sejtek stb. esetében ezek a vizsgálati módszerek általában nem alkalmazhatók a mérési felbontás korlátai és egyes anyagok inhomogenitása miatt7. Az évek során a hagyományos benyomódási módszereket módosították és adaptálták a lágy anyagok széles skálájának jellemzésére, de sok módszer még mindig komoly hiányosságokkal küzd, amelyek korlátozzák alkalmazásukat8,9,10,11,12,13. A szuperlágy anyagok és felületi rétegek mechanikai tulajdonságait pontosan és megbízhatóan jellemezni képes speciális vizsgálati módszerek hiánya jelentősen korlátozza alkalmazásukat különböző alkalmazásokban.
Korábbi munkánkban bemutattuk a lehfilcon A (CL) kontaktlencsét, egy puha, heterogén anyagot, amelynek összes ultrapuha felületi tulajdonsága a szem szaruhártyájának felszíne által ihletett, potenciálisan biomimetikus mintákból származik. Ezt a bioanyagot úgy fejlesztették ki, hogy egy elágazó, térhálósított poli(2-metakriloiloxietil-foszforilkolin (MPC)) (PMPC) polimer réteget egy szilikon-hidrogélre (SiHy)15 oltottak, amelyet orvostechnikai eszközökhöz terveztek. Ez az oltási folyamat egy nagyon puha és nagy rugalmasságú, elágazó polimer kefeszerkezetből álló réteget hoz létre a felületen. Korábbi munkánk megerősítette, hogy a lehfilcon A CL biomimetikus szerkezete kiváló felületi tulajdonságokat biztosít, mint például a jobb nedvesedési és szennyeződésgátlás, a fokozott kenőképesség, valamint a csökkent sejt- és baktériumtapadás15,16. Ezenkívül ennek a biomimetikus anyagnak a használata és fejlesztése további kiterjesztését is sugallja más orvostechnikai eszközökre. Ezért kritikus fontosságú ennek az ultrapuha anyagnak a felületi tulajdonságainak jellemzése és a szemmel való mechanikai kölcsönhatásának megértése annak érdekében, hogy átfogó tudásbázist hozzunk létre a jövőbeli fejlesztések és alkalmazások támogatására. A legtöbb kereskedelmi forgalomban kapható SiHy kontaktlencse hidrofil és hidrofób polimerek homogén keverékéből áll, amelyek egységes anyagszerkezetet alkotnak17. Számos tanulmány készült mechanikai tulajdonságaik vizsgálatára hagyományos nyomó-, szakító- és mikrobenyomódásos vizsgálati módszerekkel18,19,20,21. A lehfilcon A CL újszerű biomimetikus kialakítása azonban egyedülálló heterogén anyaggá teszi, amelyben az elágazó polimer kefeszerkezetek mechanikai tulajdonságai jelentősen eltérnek a SiHy alapszubsztrát tulajdonságaitól. Ezért nagyon nehéz pontosan számszerűsíteni ezeket a tulajdonságokat hagyományos és benyomódásos módszerekkel. Egy ígéretes módszer az atomerő-mikroszkópiában (AFM) megvalósított nanobenyomódásos vizsgálati módszert alkalmazza, amely módszert lágy viszkoelasztikus anyagok, például biológiai sejtek és szövetek, valamint lágy polimerek mechanikai tulajdonságainak meghatározására használtak22,23,24,25.,26,27,28,29,30. Az AFM nanoindentációs vizsgálat során a nanoindentációs vizsgálat alapjait az AFM technológia legújabb fejlesztéseivel ötvözik, hogy fokozott mérési érzékenységet és széles körű, természetüknél fogva szuperlágy anyagok vizsgálatát biztosítsák31,32,33,34,35,36. Ezenkívül a technológia további fontos előnyöket is kínál a különböző geometriák, a behatolótest és a szonda használata, valamint a különféle folyékony közegekben történő vizsgálat lehetősége révén.
Az AFM nanoindenzáció feltételesen három fő összetevőre osztható: (1) berendezések (érzékelők, detektorok, szondák stb.); (2) mérési paraméterek (például erő, elmozdulás, sebesség, rámpaméret stb.); (3) Adatfeldolgozás (alapvonal-korrekció, érintkezési pont becslése, adatillesztés, modellezés stb.). Ennek a módszernek egy jelentős problémája, hogy az AFM nanoindenzációt alkalmazó szakirodalmi tanulmányok közül több is nagyon eltérő kvantitatív eredményeket közöl ugyanazon minta/cella/anyagtípus esetében37,38,39,40,41. Például Lekka és munkatársai vizsgálták és összehasonlították az AFM szonda geometriájának a mechanikailag homogén hidrogél és heterogén sejtek mintáinak mért Young-modulusára gyakorolt ​​hatását. Azt írják, hogy a modulusértékek nagymértékben függenek a konzol kiválasztásától és a hegy alakjától, a legmagasabb érték egy piramis alakú szonda, a legalacsonyabb 42-es érték pedig egy gömb alakú szonda esetében figyelhető meg. Hasonlóképpen, Selhuber-Unkel és munkatársai... Kimutatták, hogy a poliakrilamid (PAAM) minták behatolósebessége, behatolómérete és vastagsága hogyan befolyásolja az ACM43 nanoindenzációval mért Young-modulust. További bonyolító tényező a szabványos, rendkívül alacsony modulusú tesztanyagok és az ingyenes vizsgálati eljárások hiánya. Ez nagyon megnehezíti a pontos eredmények megbízható elérését. A módszer azonban nagyon hasznos relatív mérésekhez és hasonló mintatípusok összehasonlító értékeléséhez, például AFM nanoindenzáció alkalmazásával a normál sejtek és a rákos sejtek megkülönböztetésére 44, 45.
Lágy anyagok AFM nanoindenzációval történő vizsgálatakor általános szabály, hogy alacsony rugóállandójú (k) szondát kell használni, amely szorosan illeszkedik a minta modulusához, és félgömb alakú/kerek hegyű szondát, hogy az első szonda ne szúrja át a minta felületét a puha anyagokkal való első érintkezéskor. Fontos az is, hogy a szonda által generált eltérítési jel elég erős legyen ahhoz, hogy a lézeres detektor rendszer érzékelje azt24,34,46,47. Ultralágy heterogén sejtek, szövetek és gélek esetében egy másik kihívás a szonda és a minta felülete közötti tapadóerő leküzdése a reprodukálható és megbízható mérések biztosítása érdekében48,49,50. A közelmúltig az AFM nanoindenzációval kapcsolatos munka nagy része a biológiai sejtek, szövetek, gélek, hidrogélek és biomolekulák mechanikai viselkedésének vizsgálatára összpontosított viszonylag nagy gömb alakú szondák, amelyeket általában kolloid szondáknak (CP) neveznek, segítségével. , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Ezeknek a hegyeknek a sugarú köre 1-50 µm, és általában boroszilikát üvegből, polimetil-metakrilátból (PMMA), polisztirolból (PS), szilícium-dioxidból (SiO2) és gyémántszerű szénből (DLC) készülnek. Bár a CP-AFM nanoindentáció gyakran az elsődleges választás a lágy minták jellemzésére, megvannak a maga problémái és korlátai. A nagy, mikron méretű gömb alakú hegyek használata növeli a hegy és a minta teljes érintkezési felületét, és a térbeli felbontás jelentős csökkenését eredményezi. Lágy, inhomogén minták esetén, ahol a lokális elemek mechanikai tulajdonságai jelentősen eltérhetnek az átlagtól egy szélesebb területen, a CP bemélyedés elrejtheti a tulajdonságok bármilyen inhomogenitását lokális léptékben52. A kolloid próbákat jellemzően úgy készítik, hogy mikron méretű kolloid gömböket rögzítenek hegy nélküli konzolokhoz epoxi ragasztók segítségével. Maga a gyártási folyamat számos problémával jár, és következetlenségekhez vezethet a próbák kalibrálási folyamatában. Ezenkívül a kolloid részecskék mérete és tömege közvetlenül befolyásolja a konzol fő kalibrációs paramétereit, mint például a rezonanciafrekvenciát, a rugó merevségét és az elhajlásérzékenységet56,57,58. Így a hagyományos AFM szondákhoz általánosan használt módszerek, mint például a hőmérséklet-kalibrálás, nem biztos, hogy pontos kalibrációt biztosítanak a CP számára, és más módszerekre lehet szükség ezen korrekciók elvégzéséhez57, 59, 60, 61. A tipikus CP benyomódási kísérletek nagy eltérésű konzolt használnak a lágy minták tulajdonságainak vizsgálatára, ami további problémát okoz a konzol nemlineáris viselkedésének kalibrálásakor viszonylag nagy eltérések esetén62,63,64. A modern kolloid szondás benyomódási módszerek általában figyelembe veszik a szonda kalibrálásához használt konzol geometriáját, de figyelmen kívül hagyják a kolloid részecskék hatását, ami további bizonytalanságot okoz a módszer pontosságában38,61. Hasonlóképpen, a kontaktmodell-illesztéssel számított rugalmassági modulusok közvetlenül függenek a bemélyedéses szonda geometriájától, és a hegy és a minta felületi jellemzői közötti eltérés pontatlanságokhoz vezethet27, 65, 66, 67, 68. Spencer és munkatársai néhány újabb munkája kiemeli azokat a tényezőket, amelyeket figyelembe kell venni a lágy polimer kefék CP-AFM nanoindenzációs módszerrel történő jellemzésekor. Arról számoltak be, hogy a viszkózus folyadék polimer kefékban való visszatartása a sebesség függvényében a fej terhelésének növekedését eredményezi, és így a sebességfüggő tulajdonságok eltérő méréseit30,69,70,71.
Ebben a tanulmányban egy módosított AFM nanoindentációs módszerrel jellemeztük az ultrapuha, nagy rugalmasságú lehfilcon A CL anyag felületi modulusát. Az anyag tulajdonságait és új szerkezetét tekintve a hagyományos benyomódási módszer érzékenységi tartománya egyértelműen nem elegendő ennek a rendkívül puha anyagnak a modulusának jellemzésére, ezért egy nagyobb érzékenységű és egy alacsonyabb érzékenységű AFM nanoindentációs módszert kell alkalmazni. Miután áttekintettük a meglévő kolloidális AFM szondás nanoindentációs technikák hiányosságait és problémáit, bemutatjuk, miért választottunk egy kisebb, egyedi tervezésű AFM szondát az érzékenység, a háttérzaj kiküszöbölésére, az érintkezési pont pontos meghatározására, a puha heterogén anyagok sebességmodulusának mérésére, például a folyadékretenciótól való függőség mérésére és a pontos számszerűsítésre. Ezenkívül pontosan meg tudtuk mérni a benyomódási hegy alakját és méreteit, ami lehetővé tette számunkra, hogy a kúp-gömb illesztési modellt használjuk a rugalmassági modulus meghatározására anélkül, hogy a hegy és az anyag érintkezési területének felmérésére kerülne sor. A munkában számszerűsített két implicit feltételezés a teljesen rugalmas anyagtulajdonságok és a benyomódási mélységtől független modulus. Ezzel a módszerrel először ismert modulusú ultralágy standardokat teszteltünk a módszer számszerűsítésére, majd ezt a módszert két különböző kontaktlencse-anyag felületének jellemzésére használtuk. Az AFM nanoindentációs felületek fokozott érzékenységű jellemzésére szolgáló módszer várhatóan széles körű biomimetikus heterogén ultralágy anyagokra alkalmazható lesz, potenciális felhasználással orvostechnikai eszközökben és biomedicinális alkalmazásokban.
A nanoindentációs kísérletekhez Lehfilcon A kontaktlencséket (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) és azok szilikon-hidrogél szubsztrátjait választottuk. A kísérletben egy speciálisan tervezett lencsefoglalatot használtunk. A lencsét a teszteléshez óvatosan helyeztük a kupola alakú állványra, ügyelve arra, hogy ne kerüljenek légbuborékok, majd a széleivel rögzítettük. A lencsetartó tetején lévő rögzítőelemen lévő lyuk hozzáférést biztosít a lencse optikai középpontjához a nanoindentációs kísérletek során, miközben a folyadékot a helyén tartjuk. Ezáltal a lencsék teljesen hidratáltak maradnak. Tesztoldatként 500 μl kontaktlencse-csomagoló oldatot használtunk. A kvantitatív eredmények ellenőrzéséhez kereskedelmi forgalomban kapható, nem aktivált poliakrilamid (PAAM) hidrogéleket készítettünk poliakrilamid-ko-metilén-biszakrilamid összetételből (100 mm-es Petrisoft Petri-csészék, Matrigen, Irvine, CA, USA), amelynek ismert rugalmassági modulusa 1 kPa. Használjon 4-5 csepp (kb. 125 µl) foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS a Corning Life Sciences-től, Tewkesbury, MA, USA) és 1 csepp OPTI-FREE Puremoist kontaktlencse-oldatot (Alcon, Vaud, TX, USA) az AFM hidrogél-szonda interfészen.
A Lehfilcon A CL és SiHy szubsztrátok mintáit FEI Quanta 250 téremissziós pásztázó elektronmikroszkóp (FEG SEM) rendszerrel vizualizáltuk, amely pásztázó transzmissziós elektronmikroszkóp (STEM) detektorral volt felszerelve. A minták előkészítéséhez a lencséket először vízzel mostuk, majd pite alakú ékekre vágtuk. A minták hidrofil és hidrofób komponensei közötti eltérő kontraszt elérése érdekében 0,10%-os stabilizált RuO4-oldatot használtunk festékként, amelybe a mintákat 30 percig merítettük. A lehfilcon A CL RuO4 festés nemcsak a jobb eltérő kontraszt elérése érdekében fontos, hanem az elágazó polimer ecsetek szerkezetének eredeti formájukban való megőrzésében is, amelyek ezután láthatók a STEM képeken. Ezután etanol/víz elegyek sorozatában mostuk és dehidratáltuk, növekvő etanolkoncentrációval. A mintákat ezután EMBed 812/Araldite epoxigyantával öntöttük, amelyet egy éjszakán át 70°C-on keményítettünk. A gyantapolimerizációval kapott mintablokkokat ultramikrotómmal vágtuk ki, és a kapott vékony metszeteket STEM detektorral vizualizáltuk alacsony vákuum módban, 30 kV gyorsítófeszültségen. Ugyanezt a SEM rendszert használtuk a PFQNM-LC-A-CAL AFM szonda (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) részletes jellemzésére is. Az AFM szonda SEM képeit tipikus nagy vákuum módban, 30 kV gyorsítófeszültséggel készítettük. Különböző szögekből és nagyításokból készítettünk képeket, hogy rögzítsük az AFM szonda hegyének alakjának és méretének minden részletét. A képeken szereplő összes érdekes hegyméretet digitálisan mértük.
Egy Dimension FastScan Bio Icon atomerő mikroszkópot (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) használtunk „PeakForce QNM in Fluid” móddal a lehfilcon A CL, a SiHy szubsztrát és a PAAm hidrogél minták vizualizálására és nano-dentálására. A képalkotó kísérletekhez egy 1 nm névleges hegysugarú PEAKFORCE-HIRS-FA szondát (Bruker) használtunk a minta nagy felbontású képeinek rögzítésére 0,50 Hz pásztázási sebességgel. Minden képet vizes oldatban készítettünk.
Az AFM nanoindentációs kísérleteket PFQNM-LC-A-CAL szondával (Bruker) végezték. Az AFM szonda szilícium hegye egy 345 nm vastag, 54 µm hosszú és 4,5 µm széles nitrid konzolon található, 45 kHz rezonanciafrekvenciával. Kifejezetten lágy biológiai minták jellemzésére és kvantitatív nanomechanikai mérések elvégzésére tervezték. Az érzékelőket egyenként kalibrálják a gyárban előre kalibrált rugóbeállításokkal. A vizsgálatban használt szondák rugóállandói 0,05–0,1 N/m tartományban voltak. A hegy alakjának és méretének pontos meghatározásához a szondát részletesen jellemezték SEM segítségével. Az 1a. ábrán a PFQNM-LC-A-CAL szonda nagy felbontású, alacsony nagyítású pásztázó elektronmikroszkópos felvétele látható, amely holisztikus képet ad a szonda kialakításáról. Az 1b. ábra a szonda hegyének tetejének kinagyított nézete látható, amely információt nyújt a hegy alakjáról és méretéről. A tű legszélső végén egy körülbelül 140 nm átmérőjű félgömb alakú tű található (1c. ábra). Ez alatt a hegy kúpos alakúra szűkül, körülbelül 500 nm mért hosszúságot elérve. Az elkeskenyedő részen kívül a hegy hengeres, és teljes hegyhossza 1,18 µm. Ez a szonda hegyének fő funkcionális része. Ezenkívül egy nagy, gömb alakú polisztirol (PS) szondát (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) is használtak kolloidális próbaként a teszteléshez, amelynek hegyátmérője 45 µm, rugóállandója pedig 2 N/m, összehasonlításképpen PFQNM-LC-A-CAL 140 nm-es szondával.
Jelentések szerint a nanoindentáció során folyadék csapdába eshet az AFM szonda és a polimer kefeszerkezet között, ami felfelé irányuló erőt fejt ki az AFM szondára, mielőtt az ténylegesen megérintené a felületet69. Ez a folyadék-visszatartás miatti viszkózus extrudálási hatás megváltoztathatja a látszólagos érintkezési pontot, ezáltal befolyásolva a felületi modulus méréseit. A szonda geometriájának és a benyomódási sebességnek a folyadék-visszatartásra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához lehfilcon A CL minták benyomódási erő görbéit ábrázolták egy 140 nm átmérőjű szondával, állandó 1 µm/s és 2 µm/s elmozdulási sebességgel. A szonda átmérője 45 µm, fix erőbeállítás 6 nN, 1 µm/s sebességgel elérve. A kísérleteket egy 140 nm átmérőjű szondával végezték 1 µm/s benyomódási sebességgel és 300 pN beállított erővel, amelyet úgy választottak meg, hogy a felső szemhéj fiziológiai tartományán (1–8 kPa) belüli érintkezési nyomást hozzanak létre. 72-es nyomás. 1 kPa nyomáson PAA hidrogél lágy, kész mintáit 50 pN benyomódási erővel, 1 μm/s sebességgel vizsgálták egy 140 nm átmérőjű szonda segítségével.
Mivel a PFQNM-LC-A-CAL szonda hegyének kúpos részének hossza körülbelül 500 nm, bármilyen 500 nm-nél kisebb benyomódási mélység esetén biztonságosan feltételezhető, hogy a szonda geometriája a benyomódás során hű marad kúp alakjához. Ezenkívül feltételezzük, hogy a vizsgált anyag felülete reverzibilis rugalmas választ mutat, amelyet a következő szakaszokban szintén megerősítünk. Ezért a hegy alakjától és méretétől függően a Briscoe, Sebastian és Adams által kifejlesztett kúp-gömb illesztési modellt választottuk, amely a gyártó szoftverében elérhető, az AFM nanoindentációs kísérleteink (NanoScope) feldolgozásához. Elválasztási adatelemző szoftver, Bruker) 73. A modell az F(δ) erő-elmozdulás összefüggést írja le egy gömb alakú csúcshibával rendelkező kúp esetén. Az ábrán A 2. ábra egy merev kúp és egy gömb alakú csúcs kölcsönhatása során fellépő érintkezési geometriát mutatja, ahol R a gömb alakú csúcs sugara, a az érintkezési sugár, b a gömb alakú csúcs végének érintkezési sugara, δ az érintkezési sugár. bemélyedési mélység, θ a kúp félszöge. A szonda pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe jól mutatja, hogy a 140 nm átmérőjű gömb alakú csúcs tangenciálisan illeszkedik egy kúpba, tehát itt b csak R-en keresztül van definiálva, azaz b = R cos θ. A gyártó által biztosított szoftver egy kúp-gömb összefüggést biztosít a Young-modulus (E) értékek kiszámításához az erőszétválási adatokból, feltételezve, hogy a > b. Kapcsolat:
ahol F a benyomódási erő, E a Young-modulus, ν a Poisson-tényező. Az érintkezési sugár a a következőképpen becsülhető:
Egy elágazó polimer kefék felületi rétegével ellátott Lefilcon kontaktlencse anyagába préselt gömb alakú hegyű merev kúp kontaktgeometriájának vázlata.
Ha a ≤ b, akkor a kapcsolat a hagyományos gömb alakú bemélyedés egyenletére redukálódik;
Úgy véljük, hogy a bemélyítő szonda és a PMPC polimer kefe elágazó szerkezetének kölcsönhatása miatt az a érintkezési sugár nagyobb lesz, mint a gömb alakú érintkezési sugár b. Ezért a rugalmassági modulus összes kvantitatív méréséhez, amelyet ebben a vizsgálatban végeztünk, az a > b esetre kapott függőséget használtuk.
A tanulmányban vizsgált ultralágy biomimetikus anyagokat átfogóan képalkotó eljárással vizsgáltuk pásztázó transzmissziós elektronmikroszkópiával (STEM) a minta keresztmetszetéről és atomerő-mikroszkópiával (AFM) a felületről. Ezt a részletes felületi jellemzést korábban publikált munkánk kiterjesztéseként végeztük, amelyben megállapítottuk, hogy a PMPC-vel módosított lehfilcon A CL felület dinamikusan elágazó polimer kefeszerkezete hasonló mechanikai tulajdonságokat mutat, mint a natív szaruhártya-szövet 14. Emiatt a kontaktlencse-felületeket biomimetikus anyagoknak nevezzük 14. A 3a. és 3b. ábrán elágazó PMPC polimer kefeszerkezetek keresztmetszetei láthatók egy lehfilcon A CL szubsztrát, illetve egy kezeletlen SiHy szubsztrát felületén. Mindkét minta felületét nagy felbontású AFM képekkel tovább elemeztük, amelyek megerősítették a STEM elemzés eredményeit (3c. és 3d. ábra). Összefoglalva, ezek a képek a PMPC elágazó polimer kefeszerkezetének hozzávetőleges hosszát adják 300–400 nm-en, ami kritikus fontosságú az AFM nanoindentációs mérések értelmezéséhez. A képekből származó másik fontos megfigyelés, hogy a CL biomimetikus anyag teljes felületi szerkezete morfológiailag eltér a SiHy szubsztrát anyagétól. Ez a felületi morfológiai különbség a bemélyítő AFM szondával való mechanikai kölcsönhatásuk során, majd ezt követően a mért modulusértékekben is nyilvánvalóvá válik.
(a) lehfilcon A CL és (b) SiHy szubsztrát keresztmetszeti STEM képei. Léptéksáv, 500 nm. A lehfilcon A CL szubsztrát (c) és az alap SiHy szubsztrát (d) felületének AFM képei (3 µm × 3 µm).
A bioinspirált polimerek és a polimer kefeszerkezetek eredendően puhák, és széles körben tanulmányozták és használták őket különféle biomedicinális alkalmazásokban74,75,76,77. Ezért fontos az AFM nanoindentációs módszer alkalmazása, amely pontosan és megbízhatóan képes mérni mechanikai tulajdonságaikat. Ugyanakkor ezeknek az ultrapuha anyagoknak az egyedi tulajdonságai, mint például a rendkívül alacsony rugalmassági modulus, a magas folyadéktartalom és a nagy rugalmasság, gyakran megnehezítik a megfelelő anyag, alak és a bemélyítő szonda méretének kiválasztását. Ez azért fontos, hogy a bemélyítő ne szúrja át a minta puha felületét, ami hibákhoz vezetne a felülettel való érintkezési pont és az érintkezési terület meghatározásában.
Ehhez elengedhetetlen az ultralágy biomimetikus anyagok (lehfilcon A CL) morfológiájának átfogó ismerete. A képalkotó módszerrel kapott elágazó polimer kefék méretére és szerkezetére vonatkozó információk alapul szolgálnak a felület AFM nanoindenzációs technikákkal történő mechanikai jellemzéséhez. A mikron méretű gömb alakú kolloid próbák helyett a 140 nm-es hegyátmérőjű PFQNM-LC-A-CAL szilícium-nitrid próbát (Bruker) választottuk, amelyet kifejezetten biológiai minták mechanikai tulajdonságainak kvantitatív feltérképezésére terveztek 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. A hagyományos kolloid próbákhoz képest viszonylag éles próbák használatának indoka az anyag szerkezeti jellemzőivel magyarázható. A próbák hegyének méretét (~140 nm) összehasonlítva a CL lehfilcon A felületén lévő elágazó polimer kefékkel, amelyeket a 3a. ábra mutat, megállapítható, hogy a hegy elég nagy ahhoz, hogy közvetlenül érintkezzen ezekkel a kefeszerkezetekkel, ami csökkenti annak esélyét, hogy a hegy átszúrja azokat. Ennek szemléltetésére a 4. ábra a lehfilcon A CL és az AFM szonda bemélyedő hegyének STEM-képét mutatja (méretarányosan).
A lehfilcon A CL és egy ACM bemélyedéses szonda STEM képét bemutató vázlat (méretarányos rajz).
Ezenkívül a 140 nm-es hegyméret elég kicsi ahhoz, hogy elkerülhető legyen a CP-AFM nanoindenzációs módszerrel előállított polimer ecseteknél korábban jelentett ragadós extrudálási hatások kockázata69,71. Feltételezzük, hogy az AFM hegy speciális kúpgömb alakja és viszonylag kis mérete miatt (1. ábra) a lehfilcon A CL nanoindenzáció által generált erőgörbe jellege nem függ sem a benyomódási sebességtől, sem a be-/kirakodási sebességtől. Ezért azt nem befolyásolják a poroelasztikus hatások. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez a lehfilcon A CL mintákat rögzített maximális erővel benyomták egy PFQNM-LC-A-CAL szonda segítségével, de két különböző sebességgel, és a kapott húzó- és visszahúzóerő-görbéket használták fel az erő (nN) ábrázolására a távolságban (µm), amint az az 5a. ábrán látható. Jól látható, hogy a be- és kirakodás során az erőgörbék teljesen átfedésben vannak, és az ábrán nincs egyértelmű bizonyíték arra, hogy a nulla benyomódási mélységnél fellépő erő-nyírás a benyomódási sebességgel együtt növekedne, ami arra utal, hogy az egyes kefeelemeket poroelasztikus hatás nélkül jellemezték. Ezzel szemben a 45 µm átmérőjű AFM szonda esetében azonos benyomódási sebesség mellett folyadék-visszatartási hatások (viszkózus extrudálás és poroelaszticitási hatások) figyelhetők meg, amelyeket a nyújtási és visszahúzási görbék közötti hiszterézis kiemel, amint az az 5b. ábrán látható. Ezek az eredmények alátámasztják a hipotézist, és arra utalnak, hogy a 140 nm átmérőjű szondák jó választást jelentenek az ilyen puha felületek jellemzésére.
lehfilcon A CL benyomódási erő görbék ACM felhasználásával; (a) 140 nm átmérőjű szonda használata két terhelési sebességnél, amely a poroelasztikus hatás hiányát mutatja a felületi benyomódás során; (b) 45 µm és 140 nm átmérőjű szondák használata. Az ábrák a viszkózus extrudálás és a poroelaszticitás hatásait mutatják nagy szondák esetén a kisebb szondákhoz képest.
Az ultralágy felületek jellemzéséhez az AFM nanoindentációs módszereknek a legjobb szondával kell rendelkezniük a vizsgált anyag tulajdonságainak tanulmányozásához. A hegy alakja és mérete mellett az AFM detektorrendszer érzékenysége, a hegy elhajlására való érzékenység a vizsgálati környezetben, valamint a konzol merevsége is fontos szerepet játszik a nanoindentációs mérések pontosságának és megbízhatóságának meghatározásában. AFM rendszerünk esetében a pozícióérzékeny detektor (PSD) detektálási határa körülbelül 0,5 mV, és az előre kalibrált rugóállandón alapul, valamint a PFQNM-LC-A-CAL szonda számított folyadékelhajlási érzékenysége kisebb, mint 0,1 pN, ami megfelel az elméleti terhelésérzékenységnek. Ezért ez a módszer lehetővé teszi a ≤ 0,1 pN minimális benyomódási erő mérését perifériás zajkomponens nélkül. Azonban egy AFM rendszer számára szinte lehetetlen a perifériás zajt erre a szintre csökkenteni olyan tényezők miatt, mint a mechanikai rezgés és a folyadékdinamika. Ezek a tényezők korlátozzák az AFM nanoindentációs módszer teljes érzékenységét, és körülbelül ≤ 10 pN háttérzajjelet eredményeznek. A felület jellemzéséhez a lehfilcon A CL és SiHy szubsztrát mintákat teljesen hidratált körülmények között benyomták egy 140 nm-es SEM-szondával, és a kapott erőgörbéket az erő (pN) és a nyomás között egymásra helyezték. Az elválasztási diagram (µm) a 6a. ábrán látható. A SiHy alapszubsztráthoz képest a lehfilcon A CL erőgörbéje egyértelműen mutat egy átmeneti fázist, amely a villás polimer ecsettel való érintkezési ponttól kezdődik, és a hegy és az alatta lévő anyag közötti lejtőjelölés éles változásával végződik. Az erőgörbe ezen átmeneti része kiemeli az elágazó polimer kefe valóban rugalmas viselkedését a felületen, amint azt a feszültséggörbét szorosan követő kompressziós görbe, valamint a kefeszerkezet és a terjedelmes SiHy anyag mechanikai tulajdonságainak kontrasztja is bizonyítja. A lefilcon összehasonlításakor. Az elágazó polimer kefe átlagos hosszának szétválasztása a PCS STEM-képén (3a. ábra) és az abszcissza mentén látható erőgörbéje a 3a. ábrán. A 6a. ábra azt mutatja, hogy a módszer képes detektálni a hegy és az elágazó polimer elérését a felület legtetején. Érintkezés az ecsetszerkezetek között. Ezenkívül az erőgörbék szoros átfedése folyadék-visszatartási hatás hiányát jelzi. Ebben az esetben a tű és a minta felülete között egyáltalán nincs tapadás. A két minta erőgörbéinek legfelső szakaszai átfedik egymást, ami az aljzatanyagok mechanikai tulajdonságainak hasonlóságát tükrözi.
(a) Lehfilcon A CL és SiHy szubsztrátok AFM nanoindentációs erőgörbéi, (b) a háttérzaj küszöbérték módszerével becsült érintkezési pontot mutató erőgörbék.
Az erőgörbe finomabb részleteinek tanulmányozása érdekében a lehfilcon A CL minta húzógörbéjét a 6b. ábrán újra ábrázoltuk, 50 pN maximális erővel az y tengely mentén. Ez a grafikon fontos információkat nyújt az eredeti háttérzajról. A zaj ±10 pN tartományban van, amelyet az érintkezési pont pontos meghatározására és a bemélyedési mélység kiszámítására használnak. A szakirodalomban leírtak szerint az érintkezési pontok azonosítása kritikus fontosságú az anyagtulajdonságok, például a modulus pontos értékeléséhez85. Az erőgörbe-adatok automatikus feldolgozását magában foglaló megközelítés jobb illeszkedést mutatott az adatillesztés és a lágy anyagok kvantitatív mérései között86. Ebben a munkában az érintkezési pontok kiválasztása viszonylag egyszerű és objektív, de vannak korlátai. Az érintkezési pont meghatározására vonatkozó konzervatív megközelítésünk kissé túlbecsült modulusértékeket eredményezhet kisebb bemélyedési mélységek (< 100 nm) esetén. Az algoritmusalapú érintkezési pont-érzékelés és az automatizált adatfeldolgozás alkalmazása a munka folytatása lehet a jövőben a módszerünk további fejlesztése érdekében. Így a ±10 pN nagyságrendű belső háttérzaj esetén a 6b. ábrán az x tengely első adatpontjaként definiáljuk az érintkezési pontot, amelynek értéke ≥10 pN. Ezután a 10 pN zajküszöbnek megfelelően egy ~0,27 µm szintű függőleges vonal jelzi a felülettel való érintkezési pontot, amely után a nyújtási görbe addig folytatódik, amíg az aljzat el nem éri a ~270 nm-es bemélyedési mélységet. Érdekes módon, az elágazó polimer kefe jellemzőinek képalkotó módszerrel mért mérete (300–400 nm) alapján a CL lehfilcon A minta háttérzaj küszöbérték módszerrel megfigyelt bemélyedési mélysége körülbelül 270 nm, ami nagyon közel van a STEM-mel mért mérethez. Ezek az eredmények tovább erősítik az AFM szonda hegyének alakjának és méretének kompatibilitását és alkalmazhatóságát ennek a nagyon puha és nagy rugalmasságú elágazó polimer kefeszerkezetnek a bemélyedéséhez. Ezek az adatok szintén erős bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy alátámasztjuk a módszerünket, amely szerint a háttérzajt küszöbértékként használjuk az érintkezési pontok pontos meghatározásához. Így a matematikai modellezésből és az erőgörbe-illesztésből származó kvantitatív eredményeknek viszonylag pontosnak kell lenniük.
Az AFM nanoindentációs módszerekkel végzett kvantitatív mérések teljes mértékben függenek az adatkiválasztáshoz és a későbbi elemzéshez használt matematikai modellektől. Ezért fontos figyelembe venni a bemélyítő kiválasztásával, az anyagtulajdonságokkal és kölcsönhatásuk mechanikájával kapcsolatos összes tényezőt, mielőtt egy adott modellt választanánk. Ebben az esetben a hegy geometriáját gondosan jellemeztük SEM mikrográfok segítségével (1. ábra), és az eredmények alapján a 140 nm átmérőjű, kemény kúpos és gömb alakú hegy geometriájú AFM nanoindentációs szonda jó választás a lehfilcon A CL79 minták jellemzésére. Egy másik fontos tényező, amelyet gondosan értékelni kell, a vizsgált polimer anyag rugalmassága. Bár a nanoindentáció kezdeti adatai (5a. és 6a. ábra) egyértelműen kirajzolják a feszültség- és nyomógörbék átfedésének jellemzőit, azaz az anyag teljes rugalmas visszaalakulását, rendkívül fontos megerősíteni az érintkezések tisztán rugalmas jellegét. Ennek érdekében két egymást követő bemélyítést végeztünk ugyanazon a helyen a lehfilcon A CL minta felületén 1 µm/s bemélyedési sebességgel, teljes hidratáltsági körülmények között. A kapott erőgörbe-adatokat a 7. ábra mutatja, és a várakozásoknak megfelelően a két nyomat tágulási és összenyomódási görbéi szinte azonosak, ami kiemeli az elágazó polimer kefeszerkezet nagy rugalmasságát.
A lehfilcon A CL felületén azonos helyen látható két benyomódási erő görbe a lencsefelület ideális rugalmasságát jelzi.
A szondacsúcs és a lehfilcon A CL felület SEM és STEM képeiből származó információk alapján a kúp-gömb modell az AFM szondacsúcs és a vizsgált lágy polimer anyag közötti kölcsönhatás ésszerű matematikai ábrázolása. Ezenkívül ennél a kúp-gömb modellnél a nyomtatott anyag rugalmas tulajdonságaira vonatkozó alapvető feltételezések igazak erre az új biomimetikus anyagra is, és ezeket használják a rugalmassági modulus számszerűsítésére.
Az AFM nanoindentációs módszer és összetevőinek átfogó értékelése után, beleértve a benyomódási szonda tulajdonságait (alak, méret és rugómerevség), az érzékenységet (háttérzaj és érintkezési pont becslése) és az adatillesztési modelleket (kvantitatív modulus mérések), a módszert alkalmazták. A kereskedelmi forgalomban kapható ultralágy minták jellemzésére került sor a kvantitatív eredmények ellenőrzése érdekében. Egy kereskedelmi forgalomban kapható, 1 kPa rugalmassági modulusú poliakrilamid (PAAM) hidrogélt teszteltek hidratált körülmények között egy 140 nm-es szondával. A modultesztelés és a számítások részletei a Kiegészítő Információkban találhatók. Az eredmények azt mutatták, hogy a mért átlagos modulus 0,92 kPa volt, az ismert modulustól való %RSD és százalékos (%) eltérés pedig kevesebb, mint 10%. Ezek az eredmények megerősítik az ebben a munkában alkalmazott AFM nanoindentációs módszer pontosságát és reprodukálhatóságát az ultralágy anyagok modulusának mérésére. A lehfilcon A CL minták és a SiHy alapszubsztrát felületeit tovább jellemezték ugyanazzal az AFM nanoindentációs módszerrel, hogy tanulmányozzák az ultralágy felület látszólagos érintkezési modulusát a benyomódási mélység függvényében. Három-három mintára (n = 3; mintánként egy benyomódás) 300 pN erővel, 1 µm/s sebességgel és teljes hidratáció mellett benyomódási erő megosztási görbét generáltak. A benyomódási erő megosztási görbét kúp-gömb modellel közelítették. A benyomódási mélységtől függő modulus meghatározásához az erőgörbe egy 40 nm széles szakaszát 20 nm-enként beállították az érintkezési ponttól kezdve, és az erőgörbe minden egyes lépésénél megmérték a modulus értékeit. Spin Cy és munkatársai. Hasonló megközelítést alkalmaztak a poli(lauril-metakrilát) (P12MA) polimer ecsetek modulusgradiensének jellemzésére kolloid AFM szonda nanoindenzációjával, és ezek összhangban vannak a Hertz érintkezési modell használatával kapott adatokkal. Ez a megközelítés a látszólagos érintkezési modulus (kPa) és a benyomódási mélység (nm) közötti összefüggést ábrázolja, amint az a 8. ábrán látható, amely a látszólagos érintkezési modulus/mélységgradiens értéket szemlélteti. A CL lehfilcon A minta számított rugalmassági modulusa a minta felső 100 nm-én belül 2–3 kPa tartományba esik, amely felett a mélységgel növekedni kezd. Másrészt, ha a SiHy alapú hordozót ecsetszerű film nélkül vizsgáljuk a felületén, a 300 pN erővel elért maximális benyomódási mélység kisebb, mint 50 nm, az adatokból kapott modulusérték pedig körülbelül 400 kPa, ami összehasonlítható a tömbi anyagok Young-modulusának értékeivel.
Látszólagos érintkezési modulus (kPa) a benyomódási mélység (nm) függvényében lehfilcon A CL és SiHy hordozók esetén AFM nanoindentációs módszerrel, kúp-gömb geometriával a modulus mérésére.
Az új biomimetikus, elágazó polimer kefeszerkezet legfelső felülete rendkívül alacsony rugalmassági modulussal rendelkezik (2–3 kPa). Ez megegyezik a villás polimer kefe szabadon lógó végével, ahogy az a STEM képen is látható. Bár a CL külső szélén vannak bizonyítékok a modulusgradiensre, a fő nagy modulusú hordozó nagyobb hatással bír. A felület felső 100 nm-e azonban az elágazó polimer kefe teljes hosszának 20%-án belül van, így ésszerű feltételezni, hogy a modulus mért értékei ebben a bemélyedési mélységtartományban viszonylag pontosak, és nem függenek erősen az alsó tárgy hatásától.
A lehfilcon A kontaktlencsék egyedi biomimetikus kialakítása miatt, amelyek SiHy szubsztrátok felületére oltott elágazó PMPC polimer kefeszerkezetekből állnak, nagyon nehéz megbízhatóan jellemezni felületi szerkezeteik mechanikai tulajdonságait hagyományos mérési módszerekkel. Itt egy fejlett AFM nanoindentációs módszert mutatunk be az olyan ultralágy anyagok, mint a magas víztartalmú és rendkívül nagy rugalmasságú lefilcon A pontos jellemzésére. Ez a módszer egy AFM szonda használatán alapul, amelynek hegyének méretét és geometriáját gondosan választják meg, hogy illeszkedjenek a nyomtatandó ultralágy felületi jellemzők szerkezeti méreteihez. A szonda és a szerkezet közötti méretek ezen kombinációja fokozott érzékenységet biztosít, lehetővé téve számunkra az elágazó polimer kefeelemek alacsony modulusának és inherens rugalmassági tulajdonságainak mérését, függetlenül a poroelasztikus hatásoktól. Az eredmények azt mutatták, hogy a lencsefelületre jellemző egyedi elágazó PMPC polimer kefék rendkívül alacsony rugalmassági modulussal (akár 2 kPa) és nagyon nagy rugalmassággal (közel 100%) rendelkeztek vizes környezetben tesztelve. Az AFM nanoindentáció eredményei lehetővé tették számunkra a biomimetikus lencsefelület látszólagos érintkezési modulusának/mélységgradiensének (30 kPa/200 nm) jellemzését is. Ez a gradiens az elágazó polimer kefék és a SiHy szubsztrát közötti moduluskülönbségnek, vagy a polimer kefék elágazó szerkezetének/sűrűségének, vagy ezek kombinációjának tudható be. Azonban további mélyreható vizsgálatokra van szükség a szerkezet és a tulajdonságok közötti kapcsolat teljes megértéséhez, különösen a kefeelágazás mechanikai tulajdonságokra gyakorolt ​​hatásának megértéséhez. Hasonló mérések segíthetnek más ultralágy anyagok és orvostechnikai eszközök felületének mechanikai tulajdonságainak jellemzésében is.
A jelenlegi tanulmány során keletkezett és/vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőktől elérhetők.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. és Haugen, HJ Biológiai reakciók bioanyagok felületeinek fizikai és kémiai tulajdonságaira. Chemical. Society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM és Liu, X. Emberi eredetű bioanyagok fejlesztése szövetmérnökséghez. Programming. Polymer. The Science. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. és munkatársai. Bioanyagok tervezése, klinikai megvalósítása és immunválasza a regeneratív gyógyászatban. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK és Farr GM: Továbbfejlesztett módszer a keménység és a rugalmassági modulus meghatározására benyomódási kísérletek segítségével terhelés- és elmozdulásmérésekkel. J. Alma mater. tárolótartály. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM A benyomódásos keménységvizsgálat történelmi eredete. alma mater. the science. technologies. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Benyomódási keménység mérése makro-, mikro- és nanoskálán: kritikai áttekintés. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD és Clapperich, SM A felületdetektálási hibák a modulus túlbecsléséhez vezetnek lágy anyagok nanobenyomódása esetén. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR és Yahya M.Yu. A heterogén nanokompozitok mechanikai jellemzőinek meghatározására szolgáló nanoindentációs módszer értékelése kísérleti és számítógépes módszerekkel. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, és Owart, TS Lágy viszkoelasztikus gélek mechanikai jellemzése benyomódáson és optimalizáláson alapuló inverz végeselemes analízissel. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J és Chaneler D. A viszkoelaszticitás meghatározásának optimalizálása kompatibilis mérőrendszerek használatával. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. és Pellillo, E. Polimer felületek nanobemélyedései. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. és Van Vliet KJ: Nagy rugalmasságú polimerek és biológiai szövetek viszkoelasztikus mechanikai tulajdonságainak jellemzése lökésszerű benyomódásos vizsgálattal. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Lágy anyagok rugalmassági modulusának és tapadási munkájának értékelése a kiterjesztett Borodich-Galanov (BG) módszerrel és mély benyomódásos vizsgálattal. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. és munkatársai. Szilikon-hidrogél kontaktlencsék biomimetikus polimer felületeinek nanoskálájú morfológiája és mechanikai tulajdonságai. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).