Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak s tri slajda odjednom. Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda odjednom ili upotrijebite klizače na kraju za pomicanje kroz tri slajda odjednom.
Razvojem novih ultra mekih materijala za medicinske uređaje i biomedicinske primjene, sveobuhvatna karakterizacija njihovih fizikalnih i mehaničkih svojstava je i važna i izazovna. Primijenjena je modificirana tehnika nanoindentacije atomskom silovnom mikroskopijom (AFM) za karakterizaciju izuzetno niskog površinskog modula nove biomimetičke silikonske hidrogel kontaktne leće lehfilcon A presvučene slojem razgranatih polimernih četkastih struktura. Ova metoda omogućuje precizno određivanje kontaktnih točaka bez učinaka viskozne ekstruzije pri približavanju razgranatim polimerima. Osim toga, omogućuje određivanje mehaničkih karakteristika pojedinačnih elemenata četke bez učinka poroelastičnosti. To se postiže odabirom AFM sonde s dizajnom (veličina vrha, geometrija i čvrstoća opruge) koji je posebno prikladan za mjerenje svojstava mekih materijala i bioloških uzoraka. Ova metoda poboljšava osjetljivost i točnost za točno mjerenje vrlo mekog materijala lehfilcon A, koji ima izuzetno nizak modul elastičnosti na površini (do 2 kPa) i izuzetno visoku elastičnost u unutarnjem (gotovo 100%) vodenom okruženju. Rezultati studije površine ne samo da su otkrili ultra meka površinska svojstva lehfilcon A leće, već su i pokazali da je modul razgranatih polimernih četkica usporediv s modulom silicij-vodikove podloge. Ova tehnika karakterizacije površine može se primijeniti na druge ultra mekane materijale i medicinske uređaje.
Mehanička svojstva materijala dizajniranih za izravan kontakt sa živim tkivom često su određena biološkim okruženjem. Savršeno usklađivanje tih svojstava materijala pomaže u postizanju željenih kliničkih karakteristika materijala bez izazivanja štetnih staničnih odgovora1,2,3. Za homogene materijale u rasutom stanju, karakterizacija mehaničkih svojstava je relativno jednostavna zbog dostupnosti standardnih postupaka i metoda ispitivanja (npr. mikroutiskivanje4,5,6). Međutim, za ultramekane materijale poput gelova, hidrogelova, biopolimera, živih stanica itd., ove metode ispitivanja općenito nisu primjenjive zbog ograničenja rezolucije mjerenja i nehomogenosti nekih materijala7. Tijekom godina, tradicionalne metode utiskivanja su modificirane i prilagođene kako bi se karakterizirao širok raspon mekih materijala, ali mnoge metode još uvijek pate od ozbiljnih nedostataka koji ograničavaju njihovu upotrebu8,9,10,11,12,13. Nedostatak specijaliziranih metoda ispitivanja koje mogu točno i pouzdano karakterizirati mehanička svojstva supermekanih materijala i površinskih slojeva ozbiljno ograničava njihovu upotrebu u raznim primjenama.
U našem prethodnom radu predstavili smo kontaktnu leću lehfilcon A (CL), mekani heterogeni materijal sa svim ultra-mekim površinskim svojstvima izvedenim iz potencijalno biomimetičkih dizajna inspiriranih površinom rožnice oka. Ovaj biomaterijal razvijen je cijepljenjem razgranatog, umreženog polimernog sloja poli(2-metakriloiloksietilfosforilkolina (MPC)) (PMPC) na silikonski hidrogel (SiHy) 15 dizajniran za medicinske uređaje na bazi. Ovaj proces cijepljenja stvara sloj na površini koji se sastoji od vrlo meke i visoko elastične razgranate polimerne četkaste strukture. Naš prethodni rad potvrdio je da biomimetička struktura lehfilcon A CL pruža vrhunska površinska svojstva kao što su poboljšano vlaženje i sprječavanje onečišćenja, povećana podmazivanje te smanjena adhezija stanica i bakterija 15,16. Osim toga, upotreba i razvoj ovog biomimetičkog materijala također sugerira daljnje širenje na druge biomedicinske uređaje. Stoga je ključno karakterizirati površinska svojstva ovog ultra-mekog materijala i razumjeti njegovu mehaničku interakciju s okom kako bi se stvorila sveobuhvatna baza znanja koja će podržati budući razvoj i primjenu. Većina komercijalno dostupnih SiHy kontaktnih leća sastoji se od homogene smjese hidrofilnih i hidrofobnih polimera koji tvore ujednačenu strukturu materijala17. Provedeno je nekoliko studija kako bi se istražila njihova mehanička svojstva korištenjem tradicionalnih metoda ispitivanja kompresije, vlačne čvrstoće i mikroudubljenja18,19,20,21. Međutim, novi biomimetički dizajn lehfilcon A CL čini ga jedinstvenim heterogenim materijalom u kojem se mehanička svojstva razgranatih polimernih četkastih struktura značajno razlikuju od svojstava SiHy osnovne podloge. Stoga je vrlo teško točno kvantificirati ta svojstva korištenjem konvencionalnih metoda i metoda udubljenja. Obećavajuća metoda koristi metodu ispitivanja nanoindentacijom implementiranu u mikroskopiji atomskih sila (AFM), metodu koja se koristi za određivanje mehaničkih svojstava mekih viskoelastičnih materijala kao što su biološke stanice i tkiva, kao i meki polimeri22,23,24,25, ,26,27,28,29,30. U AFM nanoindentaciji, osnove nanoindentacijskog ispitivanja kombiniraju se s najnovijim dostignućima u AFM tehnologiji kako bi se osigurala povećana osjetljivost mjerenja i ispitivanje širokog raspona inherentno supermekih materijala31,32,33,34,35,36. Osim toga, tehnologija nudi i druge važne prednosti korištenjem različitih geometrija utiskivača i sonde te mogućnošću ispitivanja u raznim tekućim medijima.
AFM nanoindentacija se uvjetno može podijeliti na tri glavne komponente: (1) oprema (senzori, detektori, sonde itd.); (2) parametri mjerenja (kao što su sila, pomak, brzina, veličina rampe itd.); (3) obrada podataka (korekcija osnovne linije, procjena dodirne točke, prilagođavanje podataka, modeliranje itd.). Značajan problem s ovom metodom je taj što nekoliko studija u literaturi koje koriste AFM nanoindentaciju izvještavaju o vrlo različitim kvantitativnim rezultatima za isti uzorak/ćeliju/vrstu materijala37,38,39,40,41. Na primjer, Lekka i sur. proučavali su i uspoređivali utjecaj geometrije AFM sonde na izmjereni Youngov modul uzoraka mehanički homogenog hidrogela i heterogenih ćelija. Izvještavaju da su vrijednosti modula uvelike ovisne o odabiru konzole i obliku vrha, s najvećom vrijednošću za sondu u obliku piramide i najnižom vrijednošću od 42 za sfernu sondu. Slično tome, Selhuber-Unkel i sur. Pokazano je kako brzina utiskivanja, veličina utiskivača i debljina uzoraka poliakrilamida (PAAM) utječu na Youngov modul elastičnosti izmjeren ACM43 nanoindentacijom. Drugi komplicirajući faktor je nedostatak standardnih ispitnih materijala s izuzetno niskim modulom i besplatnih ispitnih postupaka. Zbog toga je vrlo teško dobiti točne rezultate s pouzdanjem. Međutim, metoda je vrlo korisna za relativna mjerenja i komparativne procjene između sličnih tipova uzoraka, na primjer korištenjem AFM nanoindentacije za razlikovanje normalnih stanica od stanica raka 44, 45.
Prilikom ispitivanja mekih materijala AFM nanoindentacijom, opće pravilo je koristiti sondu s niskom konstantom opruge (k) koja se blisko podudara s modulom uzorka i polukuglastim/okruglim vrhom tako da prva sonda ne probije površine uzorka pri prvom kontaktu s mekim materijalima. Također je važno da signal otklona koji generira sonda bude dovoljno jak da ga detektira laserski detektorski sustav24,34,46,47. U slučaju ultra mekih heterogenih stanica, tkiva i gelova, još jedan izazov je prevladavanje adhezivne sile između sonde i površine uzorka kako bi se osigurala ponovljiva i pouzdana mjerenja48,49,50. Do nedavno se većina radova na AFM nanoindentaciji usredotočila na proučavanje mehaničkog ponašanja bioloških stanica, tkiva, gelova, hidrogelova i biomolekula korištenjem relativno velikih sfernih sondi, obično nazvanih koloidnim sondama (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Ovi vrhovi imaju radijus od 1 do 50 µm i obično se izrađuju od borosilikatnog stakla, polimetil metakrilata (PMMA), polistirena (PS), silicijevog dioksida (SiO2) i dijamantnog ugljika (DLC). Iako je CP-AFM nanoindentacija često prvi izbor za karakterizaciju mekih uzoraka, ima svoje probleme i ograničenja. Korištenje velikih, mikronskih sfernih vrhova povećava ukupnu kontaktnu površinu vrha s uzorkom i rezultira značajnim gubitkom prostorne rezolucije. Za meke, nehomogene uzorke, gdje se mehanička svojstva lokalnih elemenata mogu značajno razlikovati od prosjeka na širem području, CP utiskivanje može sakriti svaku nehomogenost u svojstvima na lokalnoj skali52. Koloidne sonde obično se izrađuju pričvršćivanjem koloidnih sfera mikronske veličine na konzole bez vrhova pomoću epoksidnih ljepila. Sam proces proizvodnje prepun je mnogih problema i može dovesti do nedosljednosti u procesu kalibracije sonde. Osim toga, veličina i masa koloidnih čestica izravno utječu na glavne parametre kalibracije konzole, kao što su rezonantna frekvencija, krutost opruge i osjetljivost otklona56,57,58. Stoga, uobičajeno korištene metode za konvencionalne AFM sonde, poput kalibracije temperature, možda neće pružiti točnu kalibraciju za CP, te mogu biti potrebne druge metode za izvođenje tih korekcija57, 59, 60, 61. Tipični eksperimenti utiskivanja CP koriste konzolu s velikim odstupanjima za proučavanje svojstava mekih uzoraka, što stvara još jedan problem pri kalibraciji nelinearnog ponašanja konzole pri relativno velikim odstupanjima62,63,64. Moderne metode utiskivanja koloidnih sondi obično uzimaju u obzir geometriju konzole koja se koristi za kalibraciju sonde, ali zanemaruju utjecaj koloidnih čestica, što stvara dodatnu nesigurnost u točnosti metode38,61. Slično tome, elastični moduli izračunati prilagođavanjem kontaktnog modela izravno ovise o geometriji sonde za utiskivanje, a neusklađenost između karakteristika vrha i površine uzorka može dovesti do netočnosti27, 65, 66, 67, 68. Istaknuti su neki nedavni radovi Spencera i suradnika. Istaknuti su čimbenici koje treba uzeti u obzir pri karakterizaciji mekih polimernih četkica korištenjem CP-AFM metode nanoindentacije. Izvijestili su da zadržavanje viskozne tekućine u polimernim četkicama kao funkcija brzine rezultira povećanjem opterećenja glave i stoga različitim mjerenjima svojstava ovisnih o brzini30,69,70,71.
U ovoj studiji karakterizirali smo površinski modul ultra-mekog visokoelastičnog materijala lehfilcon A CL korištenjem modificirane AFM metode nanoindentacije. S obzirom na svojstva i novu strukturu ovog materijala, raspon osjetljivosti tradicionalne metode utiskivanja očito je nedovoljan za karakterizaciju modula ovog izuzetno mekog materijala, stoga je potrebno koristiti AFM metodu nanoindentacije s većom i nižom razinom osjetljivosti. Nakon pregleda nedostataka i problema postojećih tehnika nanoindentacije koloidnom AFM sondom, pokazujemo zašto smo odabrali manju, posebno dizajniranu AFM sondu kako bismo uklonili osjetljivost, pozadinsku buku, precizno odredili točku kontakta, izmjerili modul brzine mekih heterogenih materijala poput ovisnosti o zadržavanju fluida i točno kvantificirali. Osim toga, uspjeli smo točno izmjeriti oblik i dimenzije vrha utiskivanja, što nam je omogućilo korištenje modela konusno-sfernog prilagođavanja za određivanje modula elastičnosti bez procjene kontaktne površine vrha s materijalom. Dvije implicitne pretpostavke koje su kvantificirane u ovom radu su potpuno elastična svojstva materijala i modul neovisan o dubini utiskivanja. Koristeći ovu metodu, prvo smo testirali ultramekane standarde s poznatim modulom kako bismo kvantificirali metodu, a zatim smo je koristili za karakterizaciju površina dvaju različitih materijala kontaktnih leća. Očekuje se da će ova metoda karakterizacije AFM nanoindentacijskih površina s povećanom osjetljivošću biti primjenjiva na širok raspon biomimetičkih heterogenih ultramekanih materijala s potencijalnom primjenom u medicinskim uređajima i biomedicinskim primjenama.
Za eksperimente nanoindentacije odabrane su kontaktne leće Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, SAD) i njihove silikonske hidrogelne podloge. U eksperimentu je korišten posebno dizajniran nosač leće. Za postavljanje leće za testiranje, pažljivo je postavljena na stalak u obliku kupole, pazeći da unutra ne uđu mjehurići zraka, a zatim je fiksirana rubovima. Rupa u fiksatoru na vrhu držača leće omogućuje pristup optičkom središtu leće za eksperimente nanoindentacije, a istovremeno drži tekućinu na mjestu. To održava leće potpuno hidratiziranima. Kao otopina za ispitivanje korišteno je 500 μl otopine za pakiranje kontaktnih leća. Za provjeru kvantitativnih rezultata, komercijalno dostupni neaktivirani poliakrilamidni (PAAM) hidrogeli pripremljeni su od sastava poliakrilamid-ko-metilen-bisakrilamid (100 mm Petrisoft Petrijeve zdjelice, Matrigen, Irvine, CA, SAD), poznatog modula elastičnosti od 1 kPa. Upotrijebite 4-5 kapi (otprilike 125 µl) fosfatno puferirane fiziološke otopine (PBS tvrtke Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, SAD) i 1 kap otopine za kontaktne leće OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, SAD). ) na granici hidrogela i sonde AFM-a.
Uzorci Lehfilcon A CL i SiHy supstrata vizualizirani su pomoću FEI Quanta 250 sustava skenirajućeg elektronskog mikroskopa s emisijom polja (FEG SEM) opremljenog detektorom skenirajućeg transmisijskog elektronskog mikroskopa (STEM). Za pripremu uzoraka, leće su prvo isprane vodom i izrezane u klinove u obliku pite. Kako bi se postigao diferencijalni kontrast između hidrofilnih i hidrofobnih komponenti uzoraka, kao boja korištena je 0,10%-tna stabilizirana otopina RuO4, u koju su uzorci uronjeni 30 minuta. Bojenje lehfilcon A CL RuO4 važno je ne samo za postizanje poboljšanog diferencijalnog kontrasta, već i pomaže u očuvanju strukture razgranatih polimernih četkica u njihovom izvornom obliku, koje su zatim vidljive na STEM slikama. Zatim su oprani i dehidrirani u nizu smjesa etanola/vode s povećanjem koncentracije etanola. Uzorci su zatim izliveni s EMBed 812/Araldite epoksidom, koji se stvrdnuo preko noći na 70°C. Uzorci blokova dobiveni polimerizacijom smole izrezani su ultramikrotomom, a dobiveni tanki rezovi vizualizirani su STEM detektorom u načinu rada niskog vakuuma pri ubrzavajućem naponu od 30 kV. Isti SEM sustav korišten je za detaljnu karakterizaciju PFQNM-LC-A-CAL AFM sonde (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, SAD). SEM slike AFM sonde dobivene su u tipičnom načinu rada visokog vakuuma s ubrzavajućim naponom od 30 kV. Snimljene su slike pod različitim kutovima i uvećanjima kako bi se zabilježili svi detalji oblika i veličine vrha AFM sonde. Sve dimenzije vrha od interesa na slikama izmjerene su digitalno.
Za vizualizaciju i nanoindentaciju uzoraka lehfilcon A CL, SiHy supstrata i PAAm hidrogela korišten je atomski silovni mikroskop Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornija, SAD) s načinom rada „PeakForce QNM u fluidu“. Za eksperimente snimanja korištena je sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) s nominalnim radijusom vrha od 1 nm za snimanje slika visoke rezolucije uzorka brzinom skeniranja od 0,50 Hz. Sve slike snimljene su u vodenoj otopini.
Eksperimenti AFM nanoindentacije provedeni su pomoću PFQNM-LC-A-CAL sonde (Bruker). AFM sonda ima silicijski vrh na nitridnoj konzoli debljine 345 nm, duljine 54 µm i širine 4,5 µm s rezonantnom frekvencijom od 45 kHz. Posebno je dizajnirana za karakterizaciju i izvođenje kvantitativnih nanomehaničkih mjerenja na mekim biološkim uzorcima. Senzori su pojedinačno kalibrirani u tvornici s prethodno kalibriranim postavkama opruga. Konstante opruge sondi korištenih u ovoj studiji bile su u rasponu od 0,05–0,1 N/m. Kako bi se točno odredio oblik i veličina vrha, sonda je detaljno karakterizirana pomoću SEM-a. Na sl. 1a prikazana je skenirajuća elektronska mikrografija visoke rezolucije i malog povećanja sonde PFQNM-LC-A-CAL, koja pruža holistički pogled na dizajn sonde. Na sl. 1b prikazan je uvećani pogled na vrh vrha sonde, koji pruža informacije o obliku i veličini vrha. Na krajnjem kraju, igla je polukugla promjera oko 140 nm (slika 1c). Ispod toga, vrh se sužava u konusni oblik, dosežući izmjerenu duljinu od približno 500 nm. Izvan područja sužavanja, vrh je cilindričan i završava ukupnom duljinom vrha od 1,18 µm. Ovo je glavni funkcionalni dio vrha sonde. Osim toga, za testiranje je korištena i velika sferična polistirenska (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, SAD) s promjerom vrha od 45 µm i konstantom opruge od 2 N/m kao koloidna sonda, s PFQNM-LC-A-CAL sondom od 140 nm za usporedbu.
Izviješteno je da se tekućina može zarobiti između AFM sonde i strukture polimerne četke tijekom nanoindentacije, što će djelovati silom prema gore na AFM sondu prije nego što ona stvarno dodirne površinu69. Ovaj viskozni ekstruzijski učinak zbog zadržavanja tekućine može promijeniti prividnu točku kontakta, čime utječe na mjerenja modula površine. Kako bi se proučio utjecaj geometrije sonde i brzine utiskivanja na zadržavanje tekućine, krivulje sile utiskivanja nacrtane su za uzorke lehfilcon A CL korištenjem sonde promjera 140 nm pri konstantnim brzinama pomaka od 1 µm/s i 2 µm/s. Promjer sonde 45 µm, fiksna postavka sile 6 nN postignuta je pri 1 µm/s. Eksperimenti sa sondom promjera 140 nm provedeni su pri brzini utiskivanja od 1 µm/s i postavljenoj sili od 300 pN, odabranoj za stvaranje kontaktnog tlaka unutar fiziološkog raspona (1–8 kPa) gornjeg kapka. tlak 72. Meki gotovi uzorci PAA hidrogela s tlakom od 1 kPa ispitani su na silu utiskivanja od 50 pN pri brzini od 1 μm/s pomoću sonde promjera 140 nm.
Budući da je duljina konusnog dijela vrha sonde PFQNM-LC-A-CAL približno 500 nm, za bilo koju dubinu utiskivanja < 500 nm može se sa sigurnošću pretpostaviti da će geometrija sonde tijekom utiskivanja ostati vjerna svom konusnom obliku. Osim toga, pretpostavlja se da će površina ispitivanog materijala pokazivati ​​reverzibilni elastični odziv, što će također biti potvrđeno u sljedećim odjeljcima. Stoga smo, ovisno o obliku i veličini vrha, odabrali model prilagođavanja konusa i sfere koji su razvili Briscoe, Sebastian i Adams, a koji je dostupan u softveru dobavljača, za obradu naših AFM eksperimenata nanoindentacije (NanoScope). Softver za analizu podataka o separaciji, Bruker) 73. Model opisuje odnos sile i pomaka F(δ) za konus sa sfernim defektom na vrhu. Na sl. Slika 2 prikazuje geometriju kontakta tijekom interakcije krutog konusa sa sfernim vrhom, gdje je R polumjer sfernog vrha, a je polumjer kontakta, b je polumjer kontakta na kraju sfernog vrha, δ je polumjer kontakta. θ je dubina udubljenja, a je polukut konusa. SEM slika ove sonde jasno pokazuje da se sferni vrh promjera 140 nm tangencijalno stapa u konus, pa je ovdje b definiran samo kroz R, tj. b = R cos θ. Softver koji isporučuje dobavljač pruža odnos konusa i sfere za izračun vrijednosti Youngovog modula (E) iz podataka o razdvajanju sila pod pretpostavkom da je a > b. Odnos:
gdje je F sila utiskivanja, E je Youngov modul, ν je Poissonov omjer. Kontaktni radijus a može se procijeniti pomoću:
Shema kontaktne geometrije krutog konusa sa sfernim vrhom utisnutim u materijal Lefilcon kontaktne leće s površinskim slojem razgranatih polimernih četkica.
Ako je a ≤ b, relacija se svodi na jednadžbu za konvencionalni sferni utiskivač;
Vjerujemo da će interakcija sonde za utiskivanje s razgranatom strukturom PMPC polimerne četke uzrokovati da kontaktni radijus a bude veći od sfernog kontaktnog radijusa b. Stoga smo za sva kvantitativna mjerenja modula elastičnosti provedena u ovoj studiji koristili ovisnost dobivenu za slučaj a > b.
Ultramekani biomimetički materijali proučavani u ovoj studiji sveobuhvatno su snimljeni pomoću skenirajuće transmisijske elektronske mikroskopije (STEM) presjeka uzorka i mikroskopije atomskih sila (AFM) površine. Ova detaljna karakterizacija površine provedena je kao proširenje našeg prethodno objavljenog rada, u kojem smo utvrdili da dinamički razgranata polimerna četkasta struktura površine PMPC-modificiranog lehfilcon A CL pokazuje slična mehanička svojstva kao i nativna tkiva rožnice 14. Iz tog razloga površine kontaktnih leća nazivamo biomimetičkim materijalima 14. Na slikama 3a i 3b prikazani su presjeci razgranatih PMPC polimernih četkastih struktura na površini lehfilcon A CL podloge odnosno netretirane SiHy podloge. Površine oba uzorka dalje su analizirane pomoću AFM slika visoke rezolucije, što je dodatno potvrdilo rezultate STEM analize (slika 3c i d). Zajedno, ove slike daju približnu duljinu PMPC razgranate polimerne četkaste strukture na 300–400 nm, što je ključno za interpretaciju AFM nanoindentacijskih mjerenja. Još jedno ključno zapažanje izvedeno iz slika jest da se ukupna površinska struktura CL biomimetičkog materijala morfološki razlikuje od strukture SiHy supstratnog materijala. Ta razlika u njihovoj površinskoj morfologiji može postati očita tijekom njihove mehaničke interakcije s AFM sondom za utiskivanje, a potom i u izmjerenim vrijednostima modula.
Presječne STEM slike (a) lehfilcon A CL i (b) SiHy podloge. Mjerilo, 500 nm. AFM slike površine lehfilcon A CL podloge (c) i osnovne SiHy podloge (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirirani polimeri i polimerne četkaste strukture su inherentno mekani te su široko proučavani i korišteni u raznim biomedicinskim primjenama74,75,76,77. Stoga je važno koristiti AFM metodu nanoindentacije, koja može točno i pouzdano izmjeriti njihova mehanička svojstva. No istovremeno, jedinstvena svojstva ovih ultra-mekih materijala, poput izuzetno niskog modula elastičnosti, visokog sadržaja tekućine i visoke elastičnosti, često otežavaju odabir pravog materijala, oblika i veličine sonde za utiskivanje. To je važno kako utiskivač ne bi probio meku površinu uzorka, što bi dovelo do pogrešaka u određivanju točke kontakta s površinom i područja kontakta.
Za to je ključno sveobuhvatno razumijevanje morfologije ultra-mekih biomimetičkih materijala (lehfilcon A CL). Informacije o veličini i strukturi razgranatih polimernih četkica dobivenih metodom snimanja pružaju osnovu za mehaničku karakterizaciju površine korištenjem AFM tehnika nanoindentacije. Umjesto sferičnih koloidnih sondi mikronske veličine, odabrali smo PFQNM-LC-A-CAL silicij-nitridnu sondu (Bruker) s promjerom vrha od 140 nm, posebno dizajniranu za kvantitativno mapiranje mehaničkih svojstava bioloških uzoraka 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Razlog korištenja relativno oštrih sondi u usporedbi s konvencionalnim koloidnim sondama može se objasniti strukturnim značajkama materijala. Uspoređujući veličinu vrha sonde (~140 nm) s razgranatim polimernim četkicama na površini CL lehfilcon A, prikazanim na slici 3a, može se zaključiti da je vrh dovoljno velik da dođe u izravan kontakt s tim strukturama četkica, što smanjuje mogućnost da ih vrh probije. Za ilustraciju ove točke, na slici 4 je STEM slika lehfilcon A CL i uvlačećeg vrha AFM sonde (nacrtano u mjerilu).
Shematski prikaz STEM slike lehfilcon A CL i ACM indentacijske sonde (nacrtano u mjerilu).
Osim toga, veličina vrha od 140 nm dovoljno je mala da se izbjegne rizik od bilo kojeg od učinaka ljepljive ekstruzije koji su prethodno zabilježeni za polimerne četke proizvedene CP-AFM metodom nanoindentacije69,71. Pretpostavljamo da zbog posebnog konusno-sferičnog oblika i relativno male veličine ovog AFM vrha (slika 1), priroda krivulje sile generirane lehfilcon A CL nanoindentacijom neće ovisiti o brzini utiskivanja ili brzini utovara/istovara. Stoga na nju ne utječu poroelastični učinci. Kako bi se testirala ova hipoteza, uzorci lehfilcon A CL utisnuti su fiksnom maksimalnom silom pomoću PFQNM-LC-A-CAL sonde, ali pri dvije različite brzine, a rezultirajuće krivulje sile vlačne i uvlačeće sile korištene su za crtanje sile (nN) u razmaku (µm) prikazanom na slici 5a. Jasno je da se krivulje sile tijekom opterećenja i rasterećenja potpuno preklapaju, te nema jasnih dokaza da se sila smicanja pri nultoj dubini utiskivanja povećava s brzinom utiskivanja na slici, što sugerira da su pojedinačni elementi četke karakterizirani bez poroelastičnog učinka. Nasuprot tome, učinci zadržavanja fluida (viskozna ekstruzija i učinci poroelastičnosti) vidljivi su za AFM sondu promjera 45 µm pri istoj brzini utiskivanja i istaknuti su histerezom između krivulja istezanja i uvlačenja, kao što je prikazano na slici 5b. Ovi rezultati podupiru hipotezu i sugeriraju da su sonde promjera 140 nm dobar izbor za karakterizaciju takvih mekih površina.
lehfilcon A CL krivulje sile utiskivanja korištenjem ACM-a; (a) korištenjem sonde promjera 140 nm pri dvije brzine opterećenja, što pokazuje odsutnost poroelastičnog učinka tijekom površinskog utiskivanja; (b) korištenjem sondi promjera 45 µm i 140 nm. s prikazuju učinke viskozne ekstruzije i poroelastičnosti za velike sonde u usporedbi s manjim sondama.
Za karakterizaciju ultramekih površina, AFM metode nanoindentacije moraju imati najbolju sondu za proučavanje svojstava proučavanog materijala. Osim oblika i veličine vrha, osjetljivost AFM detektorskog sustava, osjetljivost na otklon vrha u ispitnom okruženju i krutost konzole igraju važnu ulogu u određivanju točnosti i pouzdanosti mjerenja nanoindentacije. Za naš AFM sustav, granica detekcije pozicijsko osjetljivog detektora (PSD) je približno 0,5 mV i temelji se na prethodno kalibriranoj čvrstoći opruge i izračunatoj osjetljivosti otklona fluida sonde PFQNM-LC-A-CAL, što odgovara teorijskoj osjetljivosti opterećenja. je manja od 0,1 pN. Stoga ova metoda omogućuje mjerenje minimalne sile utiskivanja ≤ 0,1 pN bez ikakve periferne komponente šuma. Međutim, gotovo je nemoguće da AFM sustav smanji periferni šum na ovu razinu zbog čimbenika kao što su mehaničke vibracije i dinamika fluida. Ovi čimbenici ograničavaju ukupnu osjetljivost AFM metode nanoindentacije i također rezultiraju signalom pozadinskog šuma od približno ≤ 10 pN. Za karakterizaciju površine, uzorci lehfilcon A CL i SiHy supstrata utisnuti su u potpuno hidratizirane uvjete korištenjem sonde od 140 nm za SEM karakterizaciju, a rezultirajuće krivulje sile superponirane su između sile (pN) i tlaka. Dijagram odvajanja (µm) prikazan je na slici 6a. U usporedbi s osnovnom SiHy supstratom, krivulja sile lehfilcon A CL jasno pokazuje prijelaznu fazu koja počinje u točki kontakta s viličastom polimernom četkom i završava oštrom promjenom nagiba koja označava kontakt vrha s podložnim materijalom. Ovaj prijelazni dio krivulje sile ističe istinski elastično ponašanje razgranate polimerne četke na površini, što dokazuje krivulja kompresije koja blisko prati krivulju napetosti i kontrast u mehaničkim svojstvima između strukture četke i glomaznog SiHy materijala. Pri usporedbi lefilcona. Odvajanje prosječne duljine razgranate polimerne četke na STEM slici PCS-a (slika 3a) i njezine krivulje sile duž apscise na slici 3a. Slika 6a pokazuje da metoda može detektirati vrh i razgranati polimer koji dosežu sam vrh površine. Kontakt između struktura četkica. Osim toga, blisko preklapanje krivulja sile ukazuje na odsutnost učinka zadržavanja tekućine. U ovom slučaju, nema apsolutno nikakvog prianjanja između igle i površine uzorka. Najgornji dijelovi krivulja sile za dva uzorka preklapaju se, što odražava sličnost mehaničkih svojstava materijala podloge.
(a) Krivulje sile AFM nanoindentacije za lehfilcon A CL podloge i SiHy podloge, (b) krivulje sile koje prikazuju procjenu kontaktne točke korištenjem metode praga pozadinske buke.
Kako bi se proučili finiji detalji krivulje sile, krivulja napetosti uzorka lehfilcon A CL ponovno je prikazana na slici 6b s maksimalnom silom od 50 pN duž y-osi. Ovaj graf pruža važne informacije o izvornoj pozadinskoj buci. Buka je u rasponu od ±10 pN, što se koristi za točno određivanje kontaktne točke i izračun dubine udubljenja. Kao što je navedeno u literaturi, identifikacija kontaktnih točaka ključna je za točnu procjenu svojstava materijala kao što je modul85. Pristup koji uključuje automatsku obradu podataka krivulje sile pokazao je poboljšano usklađivanje između prilagođavanja podataka i kvantitativnih mjerenja za meke materijale86. U ovom radu, naš izbor kontaktnih točaka je relativno jednostavan i objektivan, ali ima svoja ograničenja. Naš konzervativni pristup određivanju kontaktne točke može rezultirati malo precijenjenim vrijednostima modula za manje dubine udubljenja (< 100 nm). Korištenje detekcije dodirnih točaka temeljene na algoritmu i automatizirane obrade podataka moglo bi biti nastavak ovog rada u budućnosti kako bi se dodatno poboljšala naša metoda. Dakle, za intrinzičnu pozadinsku buku reda veličine ±10 pN, definiramo kontaktnu točku kao prvu podatkovnu točku na x-osi na slici 6b s vrijednošću ≥10 pN. Zatim, u skladu s pragom buke od 10 pN, okomita linija na razini od ~0,27 µm označava točku kontakta s površinom, nakon čega se krivulja istezanja nastavlja sve dok podloga ne dosegne dubinu udubljenja od ~270 nm. Zanimljivo je da, na temelju veličine značajki razgranate polimerne četke (300–400 nm) izmjerene metodom snimanja, dubina udubljenja uzorka CL lehfilcon A promatrana metodom praga pozadinske buke iznosi oko 270 nm, što je vrlo blizu veličini mjerenja STEM-om. Ovi rezultati dodatno potvrđuju kompatibilnost i primjenjivost oblika i veličine vrha AFM sonde za utiskivanje ove vrlo mekane i vrlo elastične strukture razgranate polimerne četke. Ovi podaci također pružaju snažne dokaze koji podupiru našu metodu korištenja pozadinske buke kao praga za precizno određivanje kontaktnih točaka. Stoga bi svi kvantitativni rezultati dobiveni matematičkim modeliranjem i prilagođavanjem krivulje sile trebali biti relativno točni.
Kvantitativna mjerenja metodama AFM nanoindentacije u potpunosti ovise o matematičkim modelima korištenim za odabir podataka i naknadnu analizu. Stoga je važno uzeti u obzir sve čimbenike povezane s izborom utiskivača, svojstvima materijala i mehanikom njihove interakcije prije odabira određenog modela. U ovom slučaju, geometrija vrha pažljivo je karakterizirana pomoću SEM mikrografija (slika 1), a na temelju rezultata, AFM nanoindentacijska sonda promjera 140 nm s tvrdim konusom i sfernom geometrijom vrha dobar je izbor za karakterizaciju uzoraka lehfilcon A CL79. Drugi važan čimbenik koji treba pažljivo procijeniti je elastičnost polimernog materijala koji se testira. Iako početni podaci nanoindentacije (slike 5a i 6a) jasno ocrtavaju značajke preklapanja krivulja napetosti i kompresije, tj. potpuni elastični oporavak materijala, izuzetno je važno potvrditi isključivo elastičnu prirodu kontakata. U tu svrhu, dva uzastopna utiskivanja su izvedena na istom mjestu na površini uzorka lehfilcon A CL brzinom utiskivanja od 1 µm/s pod uvjetima pune hidratacije. Rezultirajući podaci krivulje sile prikazani su na sl. 7 i, kao što se i očekivalo, krivulje širenja i kompresije dvaju otiska su gotovo identične, što ističe visoku elastičnost razgranate strukture polimerne četke.
Dvije krivulje sile udubljenja na istom mjestu na površini lehfilcon A CL pokazuju idealnu elastičnost površine leće.
Na temelju informacija dobivenih iz SEM i STEM slika vrha sonde i površine lehfilcon A CL, model konusa i sfere je razuman matematički prikaz interakcije između vrha AFM sonde i mekog polimernog materijala koji se testira. Osim toga, za ovaj model konusa i sfere, temeljne pretpostavke o elastičnim svojstvima otisnutog materijala vrijede za ovaj novi biomimetički materijal i koriste se za kvantificiranje modula elastičnosti.
Nakon sveobuhvatne evaluacije AFM metode nanoindentacije i njezinih komponenti, uključujući svojstva sonde za utiskivanje (oblik, veličina i krutost opruge), osjetljivost (pozadinska buka i procjena kontaktne točke) i modele prilagođavanja podataka (mjerenja kvantitativnog modula), korištena je metoda. za karakterizaciju komercijalno dostupnih ultra mekih uzoraka radi provjere kvantitativnih rezultata. Komercijalni poliakrilamidni (PAAM) hidrogel s modulom elastičnosti od 1 kPa testiran je u hidratiziranim uvjetima pomoću sonde od 140 nm. Pojedinosti o testiranju modula i izračunima nalaze se u Dodatnim informacijama. Rezultati su pokazali da je prosječni izmjereni modul bio 0,92 kPa, a %RSD i postotak (%) odstupanja od poznatog modula bili su manji od 10%. Ovi rezultati potvrđuju točnost i ponovljivost AFM metode nanoindentacije korištene u ovom radu za mjerenje modula ultra mekih materijala. Površine uzoraka lehfilcon A CL i SiHy osnovne podloge dodatno su karakterizirane korištenjem iste AFM metode nanoindentacije kako bi se proučio prividni kontaktni modul ultrameke površine kao funkcija dubine udubljenja. Krivulje razdvajanja sile udubljenja generirane su za tri uzorka svake vrste (n = 3; jedno udubljenje po uzorku) pri sili od 300 pN, brzini od 1 µm/s i potpunoj hidrataciji. Krivulja raspodjele sile udubljenja aproksimirana je korištenjem modela konus-sfera. Kako bi se dobio modul ovisan o dubini udubljenja, dio krivulje sile širine 40 nm postavljen je na svaki korak od 20 nm počevši od točke kontakta, a izmjerene su vrijednosti modula u svakom koraku krivulje sile. Spin Cy i sur. Sličan pristup korišten je za karakterizaciju gradijenta modula polimernih četkica poli(lauril metakrilata) (P12MA) korištenjem koloidne AFM nanoindentacije sondom, a oni su u skladu s podacima korištenjem Hertzovog kontaktnog modela. Ovaj pristup pruža dijagram prividnog kontaktnog modula (kPa) u odnosu na dubinu udubljenja (nm), kao što je prikazano na slici 8, koja ilustrira gradijent prividnog kontaktnog modula/dubine. Izračunati modul elastičnosti uzorka CL lehfilcon A je u rasponu od 2-3 kPa unutar gornjih 100 nm uzorka, nakon čega počinje rasti s dubinom. S druge strane, pri ispitivanju SiHy osnovne podloge bez filma nalik četkici na površini, maksimalna dubina udubljenja postignuta pri sili od 300 pN je manja od 50 nm, a vrijednost modula dobivena iz podataka je oko 400 kPa, što je usporedivo s vrijednostima Youngovog modula za rasute materijale.
Prividni kontaktni modul (kPa) u odnosu na dubinu utiskivanja (nm) za lehfilcon A CL i SiHy podloge korištenjem AFM metode nanoindentacije s geometrijom konusa i sfere za mjerenje modula.
Najgornja površina nove biomimetičke strukture razgranate polimerne četke pokazuje izuzetno nizak modul elastičnosti (2–3 kPa). To će odgovarati slobodno visećem kraju rašljaste polimerne četke kao što je prikazano na STEM slici. Iako postoje neki dokazi o gradijentu modula na vanjskom rubu CL-a, glavni supstrat visokog modula ima veći utjecaj. Međutim, gornjih 100 nm površine nalazi se unutar 20% ukupne duljine razgranate polimerne četke, pa je razumno pretpostaviti da su izmjerene vrijednosti modula u ovom rasponu dubine udubljenja relativno točne i ne ovise snažno o učinku donjeg objekta.
Zbog jedinstvenog biomimetičkog dizajna kontaktnih leća lehfilcon A, koje se sastoje od razgranatih PMPC polimernih četkastih struktura cijepljenih na površinu SiHy podloga, vrlo je teško pouzdano karakterizirati mehanička svojstva njihovih površinskih struktura korištenjem tradicionalnih metoda mjerenja. Ovdje predstavljamo naprednu AFM metodu nanoindentacije za preciznu karakterizaciju ultra mekih materijala poput lefilcona A s visokim udjelom vode i izuzetno visokom elastičnošću. Ova metoda temelji se na korištenju AFM sonde čija su veličina i geometrija vrha pažljivo odabrane kako bi odgovarale strukturnim dimenzijama ultra mekih površinskih značajki koje se otiskuju. Ova kombinacija dimenzija između sonde i strukture pruža povećanu osjetljivost, omogućujući nam mjerenje niskog modula i inherentnih elastičnih svojstava elemenata razgranatih polimernih četkastih elemenata, bez obzira na poroelastične učinke. Rezultati su pokazali da jedinstvene razgranate PMPC polimerne četke karakteristične za površinu leće imaju izuzetno nizak modul elastičnosti (do 2 kPa) i vrlo visoku elastičnost (gotovo 100%) kada se testiraju u vodenom okruženju. Rezultati AFM nanoindentacije također su nam omogućili karakterizaciju prividnog gradijenta kontaktnog modula/dubine (30 kPa/200 nm) površine biomimetičke leće. Ovaj gradijent može biti posljedica razlike u modulu između razgranatih polimernih četkica i SiHy podloge ili razgranate strukture/gustoće polimernih četkica ili njihove kombinacije. Međutim, potrebna su daljnja dubinska istraživanja kako bi se u potpunosti razumio odnos između strukture i svojstava, posebno utjecaj grananja četkice na mehanička svojstva. Slična mjerenja mogu pomoći u karakterizaciji mehaničkih svojstava površine drugih ultra mekih materijala i medicinskih uređaja.
Skupovi podataka generirani i/ili analizirani tijekom tekuće studije dostupni su od odgovarajućih autora na razuman zahtjev.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Biološke reakcije na fizikalna i kemijska svojstva površina biomaterijala. Chemical society. Ur. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Poboljšanje biomaterijala ljudskog podrijetla za tkivno inženjerstvo. programiranje. polimer. znanost. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. i dr. Dizajn, klinička primjena i imunološki odgovor biomaterijala u regenerativnoj medicini. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Poboljšana metoda za određivanje tvrdoće i modula elastičnosti korištenjem eksperimenata utiskivanja s mjerenjima opterećenja i pomaka. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Povijesni podrijetlo ispitivanja tvrdoće udubljenjem. alma mater. znanost. tehnologije. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Mjerenja tvrdoće udubljenjem na makro, mikro i nanoskali: Kritički pregled. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Pogreške u detekciji površine dovode do precjenjivanja modula pri nanoindentaciji mekih materijala. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu. Evaluacija metode nanoindentacije za određivanje mehaničkih karakteristika heterogenih nanokompozita korištenjem eksperimentalnih i računalnih metoda. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR i Owart, TS Mehanička karakterizacija mekih viskoelastičnih gelova utiskivanjem i optimizacijom temeljenom inverznom analizom konačnih elemenata. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optimizacija određivanja viskoelastičnosti korištenjem kompatibilnih mjernih sustava. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentacija polimernih površina. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Karakterizacija viskoelastičnih mehaničkih svojstava visokoelastičnih polimera i bioloških tkiva korištenjem udarnog utiskivanja. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Procjena modula elastičnosti i rada adhezije mekih materijala korištenjem proširene Borodich-Galanovljeve (BG) metode i dubokog utiskivanja. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. i dr. Nanoskalna morfologija i mehanička svojstva biomimetičkih polimernih površina kontaktnih leća od silikonskog hidrogela. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).