Grazas por visitar Nature.com. Estás a usar unha versión do navegador con compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez. Usa os botóns Anterior e Seguinte para moverte por tres diapositivas á vez ou usa os botóns deslizantes do final para moverte por tres diapositivas á vez.
Co desenvolvemento de novos materiais ultrabrandos para dispositivos médicos e aplicacións biomédicas, a caracterización exhaustiva das súas propiedades físicas e mecánicas é importante e desafiante. Aplicouse unha técnica de nanoindentación por microscopía de forza atómica modificada (AFM) para caracterizar o módulo superficial extremadamente baixo da nova lente de contacto de hidrogel de silicona biomimética lehfilcon A recuberta cunha capa de estruturas de cepillo de polímero ramificado. Este método permite a determinación precisa dos puntos de contacto sen os efectos da extrusión viscosa ao achegarse a polímeros ramificados. Ademais, permite determinar as características mecánicas dos elementos individuais do cepillo sen o efecto da poroelasticidade. Isto conséguese seleccionando unha sonda AFM cun deseño (tamaño da punta, xeometría e taxa de resorte) que é particularmente axeitado para medir as propiedades de materiais brandos e mostras biolóxicas. Este método mellora a sensibilidade e a precisión para a medición precisa do material moi brando lehfilcon A, que ten un módulo de elasticidade extremadamente baixo na superficie (ata 2 kPa) e unha elasticidade extremadamente alta no ambiente acuoso interno (case o 100%). Os resultados do estudo superficial non só revelaron as propiedades superficiais ultrabrandas da lente lehfilcon A, senón que tamén mostraron que o módulo das escobillas de polímero ramificado era comparable ao do substrato de silicio-hidróxeno. Esta técnica de caracterización superficial pódese aplicar a outros materiais ultrabrandos e dispositivos médicos.
As propiedades mecánicas dos materiais deseñados para o contacto directo con tecidos vivos adoitan estar determinadas polo ambiente biolóxico. A combinación perfecta destas propiedades do material axuda a acadar as características clínicas desexadas do material sen causar respostas celulares adversas1,2,3. Para materiais homoxéneos a granel, a caracterización das propiedades mecánicas é relativamente sinxela debido á dispoñibilidade de procedementos e métodos de ensaio estándar (por exemplo, microindentación4,5,6). Non obstante, para materiais ultrabrandos como xeles, hidroxeles, biopolímeros, células vivas, etc., estes métodos de ensaio xeralmente non son aplicables debido ás limitacións de resolución de medición e á inhomoxeneidade dalgúns materiais7. Ao longo dos anos, os métodos de indentación tradicionais modificáronse e adaptáronse para caracterizar unha ampla gama de materiais brandos, pero moitos métodos aínda padecen graves deficiencias que limitan o seu uso8,9,10,11,12,13. A falta de métodos de ensaio especializados que poidan caracterizar con precisión e fiabilidade as propiedades mecánicas dos materiais superbrandos e as capas superficiais limita gravemente o seu uso en diversas aplicacións.
No noso traballo anterior, presentamos a lente de contacto lehfilcon A (CL), un material heteroxéneo brando con todas as propiedades superficiais ultrabraves derivadas de deseños potencialmente biomiméticos inspirados na superficie da córnea do ollo. Este biomaterial foi desenvolvido enxertando unha capa de polímero ramificada e reticulada de poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) sobre un hidrogel de silicona (SiHy) 15 deseñado para dispositivos médicos baseados en. Este proceso de enxerto crea unha capa na superficie que consiste nunha estrutura de cepillo polimérico ramificado moi suave e altamente elástica. O noso traballo anterior confirmou que a estrutura biomimética de lehfilcon A CL proporciona propiedades superficiais superiores, como unha mellora da prevención da molladura e a incrustación, unha maior lubricidade e unha redución da adhesión celular e bacteriana 15,16. Ademais, o uso e desenvolvemento deste material biomimético tamén suxire unha maior expansión a outros dispositivos biomédicos. Polo tanto, é fundamental caracterizar as propiedades superficiais deste material ultrabrando e comprender a súa interacción mecánica co ollo para crear unha base de coñecemento completa que apoie futuros desenvolvementos e aplicacións. A maioría das lentes de contacto de SiHy dispoñibles comercialmente están compostas por unha mestura homoxénea de polímeros hidrófilos e hidrófobos que forman unha estrutura de material uniforme17. Realizáronse varios estudos para investigar as súas propiedades mecánicas utilizando métodos tradicionais de ensaio de compresión, tracción e microindentación18,19,20,21. Non obstante, o novo deseño biomimético do lehfilcon A CL convérteo nun material heteroxéneo único no que as propiedades mecánicas das estruturas de cepillo de polímero ramificado difiren significativamente das do substrato base de SiHy. Polo tanto, é moi difícil cuantificar con precisión estas propiedades utilizando métodos convencionais e de indentación. Un método prometedor utiliza o método de ensaio de nanoindentación implementado en microscopía de forza atómica (AFM), un método que se utilizou para determinar as propiedades mecánicas de materiais viscoelásticos brandos como células e tecidos biolóxicos, así como polímeros brandos22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. Na nanoindentación AFM, os fundamentos das probas de nanoindentación combínanse cos últimos avances na tecnoloxía AFM para proporcionar unha maior sensibilidade de medición e probas dunha ampla gama de materiais inherentemente superbrandos31,32,33,34,35,36. Ademais, a tecnoloxía ofrece outras vantaxes importantes mediante o uso de diferentes xeometrías, indentador e sonda, e a posibilidade de realizar probas en varios medios líquidos.
A nanoindentación AFM pódese dividir condicionalmente en tres compoñentes principais: (1) equipamento (sensores, detectores, sondas, etc.); (2) parámetros de medición (como forza, desprazamento, velocidade, tamaño da rampa, etc.); (3) procesamento de datos (corrección da liña base, estimación do punto de contacto, axuste de datos, modelado, etc.). Un problema significativo con este método é que varios estudos na literatura que empregan a nanoindentación AFM informan de resultados cuantitativos moi diferentes para o mesmo tipo de mostra/célula/material37,38,39,40,41. Por exemplo, Lekka et al. Estudouse e comparouse a influencia da xeometría da sonda AFM no módulo de Young medido de mostras de hidrogel mecanicamente homoxéneo e células heteroxéneas. Informan de que os valores do módulo dependen en gran medida da selección do cantilever e da forma da punta, co valor máis alto para unha sonda en forma de pirámide e o valor máis baixo de 42 para unha sonda esférica. Do mesmo xeito, Selhuber-Unkel et al. Demostrouse como a velocidade do indentador, o tamaño do indentador e o grosor das mostras de poliacrilamida (PAAM) afectan o módulo de Young medido mediante nanoindentación ACM43. Outro factor que o complica é a falta de materiais de ensaio estándar de módulo extremadamente baixo e de procedementos de ensaio gratuítos. Isto fai que sexa moi difícil obter resultados precisos con confianza. Non obstante, o método é moi útil para medicións relativas e avaliacións comparativas entre tipos de mostras similares, por exemplo, usando a nanoindentación AFM para distinguir as células normais das células cancerosas 44, 45.
Ao probar materiais brandos con nanoindentación AFM, unha regra xeral é usar unha sonda cunha constante de elasticidade (k) baixa que se axuste moito ao módulo da mostra e unha punta semiesférica/redonda para que a primeira sonda non perfore as superficies da mostra no primeiro contacto con materiais brandos. Tamén é importante que o sinal de deflexión xerado pola sonda sexa o suficientemente forte como para ser detectado polo sistema detector láser24,34,46,47. No caso de células, tecidos e xeles heteroxéneos ultrabrandos, outro desafío é superar a forza adhesiva entre a sonda e a superficie da mostra para garantir medicións reproducibles e fiables48,49,50. Ata hai pouco, a maior parte do traballo sobre a nanoindentación AFM centrábase no estudo do comportamento mecánico de células biolóxicas, tecidos, xeles, hidroxeles e biomoléculas usando sondas esféricas relativamente grandes, comunmente denominadas sondas coloidais (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Estas puntas teñen un radio de 1 a 50 µm e adoitan estar feitas de vidro de borosilicato, polimetacrilato de metilo (PMMA), poliestireno (PS), dióxido de silicio (SiO2) e carbono similar ao diamante (DLC). Aínda que a nanoindentación CP-AFM adoita ser a primeira opción para a caracterización de mostras brandas, ten os seus propios problemas e limitacións. O uso de puntas esféricas grandes, de tamaño micrónico, aumenta a área de contacto total da punta coa mostra e resulta nunha perda significativa de resolución espacial. Para mostras brandas e heteroxéneas, onde as propiedades mecánicas dos elementos locais poden diferir significativamente da media nunha área máis ampla, a indentación CP pode ocultar calquera heteroxeneidade nas propiedades a escala local52. As sondas coloidais adoitan fabricarse unindo esferas coloidais de tamaño micrónico a voladizos sen punta utilizando adhesivos epoxi. O propio proceso de fabricación está cheo de moitos problemas e pode levar a inconsistencias no proceso de calibración da sonda. Ademais, o tamaño e a masa das partículas coloidais afectan directamente os principais parámetros de calibración da ménsula, como a frecuencia de resonancia, a rixidez do resorte e a sensibilidade á deflexión56,57,58. Polo tanto, os métodos comúns para as sondas AFM convencionais, como a calibración da temperatura, poden non proporcionar unha calibración precisa para a CP, e poden ser necesarios outros métodos para realizar estas correccións57, 59, 60, 61. Os experimentos típicos de indentación de CP usan ménsulas con grandes desviacións para estudar as propiedades de mostras brandas, o que crea outro problema ao calibrar o comportamento non lineal da ménsula a desviacións relativamente grandes62,63,64. Os métodos modernos de indentación de sondas coloidais adoitan ter en conta a xeometría da ménsula utilizada para calibrar a sonda, pero ignoran a influencia das partículas coloidais, o que crea unha incerteza adicional na precisión do método38,61. Do mesmo xeito, os módulos elásticos calculados mediante o axuste do modelo de contacto dependen directamente da xeometría da sonda de indentación, e a discrepancia entre as características da punta e as da superficie da mostra pode levar a inexactitudes27, 65, 66, 67, 68. Algúns traballos recentes de Spencer et al. Destácanse os factores que se deben ter en conta ao caracterizar as escobillas de polímero brando usando o método de nanoindentación CP-AFM. Informaron de que a retención dun fluído viscoso nas escobillas de polímero en función da velocidade resulta nun aumento na carga da cabeza e, polo tanto, en diferentes medicións das propiedades dependentes da velocidade30,69,70,71.
Neste estudo, caracterizamos o módulo superficial do material ultra brando e altamente elástico lehfilcon A CL empregando un método de nanoindentación AFM modificado. Dadas as propiedades e a nova estrutura deste material, o rango de sensibilidade do método de indentación tradicional é claramente insuficiente para caracterizar o módulo deste material extremadamente brando, polo que é necesario empregar un método de nanoindentación AFM con maior e menor sensibilidade. Despois de revisar as deficiencias e os problemas das técnicas de nanoindentación con sonda AFM coloidal existentes, mostramos por que escollemos unha sonda AFM máis pequena e deseñada a medida para eliminar a sensibilidade, o ruído de fondo, localizar o punto de contacto, medir o módulo de velocidade de materiais brandos heteroxéneos, como a dependencia da retención de fluídos, e unha cuantificación precisa. Ademais, puidemos medir con precisión a forma e as dimensións da punta de indentación, o que nos permite empregar o modelo de axuste cono-esfera para determinar o módulo de elasticidade sen avaliar a área de contacto da punta co material. As dúas suposicións implícitas que se cuantifican neste traballo son as propiedades do material totalmente elástico e o módulo independente da profundidade de indentación. Usando este método, primeiro probamos estándares ultrabrandos cun módulo coñecido para cuantificar o método e, a continuación, empregamos este método para caracterizar as superficies de dous materiais de lentes de contacto diferentes. Espérase que este método de caracterización de superficies de nanoindentación AFM con maior sensibilidade sexa aplicable a unha ampla gama de materiais ultrabrandos heteroxéneos biomiméticos con uso potencial en dispositivos médicos e aplicacións biomédicas.
Para os experimentos de nanoindentación escolléronse lentes de contacto Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EUA) e os seus substratos de hidroxel de silicona. No experimento empregouse unha montura de lente especialmente deseñada. Para instalar a lente para a proba, colocouse coidadosamente no soporte en forma de cúpula, asegurándose de que non entrasen burbullas de aire no seu interior, e logo fixouse cos bordos. Un orificio na fixación na parte superior do soporte da lente proporciona acceso ao centro óptico da lente para os experimentos de nanoindentación mentres mantén o líquido no seu lugar. Isto mantén as lentes totalmente hidratadas. Empregáronse 500 μl de solución de empaquetado de lentes de contacto como solución de proba. Para verificar os resultados cuantitativos, preparáronse hidroxeles de poliacrilamida non activada (PAAM) dispoñibles comercialmente a partir dunha composición de poliacrilamida-co-metileno-bisacrilamida (placas de Petri Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EUA), un módulo elástico coñecido de 1 kPa. Empregar de 4 a 5 gotas (aproximadamente 125 µl) de solución salina tamponada con fosfato (PBS de Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EUA) e 1 gota de solución para lentes de contacto OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EUA) na interface hidrogel-sonda do AFM.
Visualizáronse mostras de substratos de Lehfilcon A CL e SiHy empregando un sistema de microscopio electrónico de varrido de emisión de campo (FEG SEM) FEI Quanta 250 equipado cun detector de microscopio electrónico de transmisión de varrido (STEM). Para preparar as mostras, as lentes laváronse primeiro con auga e cortáronse en cuñas en forma de torta. Para lograr un contraste diferencial entre os compoñentes hidrófilos e hidrófobos das mostras, empregouse unha solución estabilizada ao 0,10 % de RuO4 como colorante, na que as mostras se mergullaron durante 30 minutos. A tinción de lehfilcon A CL RuO4 é importante non só para conseguir un mellor contraste diferencial, senón que tamén axuda a preservar a estrutura dos pinceis de polímero ramificados na súa forma orixinal, que logo son visibles nas imaxes STEM. Despois laváronse e deshidratáronse nunha serie de mesturas de etanol/auga cunha concentración crecente de etanol. As mostras coláronse despois con epoxi EMBed 812/araldita, que curou durante a noite a 70 °C. Os bloques de mostra obtidos por polimerización de resina cortáronse cun ultramicrotomo e as seccións delgadas resultantes visualizáronse cun detector STEM en modo de baixo baleiro a unha tensión de aceleración de 30 kV. O mesmo sistema SEM utilizouse para a caracterización detallada da sonda AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Bárbara, CA, EUA). As imaxes SEM da sonda AFM obtivéronse nun modo típico de alto baleiro cunha tensión de aceleración de 30 kV. Adquirir imaxes en diferentes ángulos e aumentos para rexistrar todos os detalles da forma e o tamaño da punta da sonda AFM. Todas as dimensións da punta de interese nas imaxes medíronse dixitalmente.
Empregouse un microscopio de forza atómica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Bárbara, California, EUA) co modo “PeakForce QNM in Fluid” para visualizar e nanoindentar mostras de lehfilcon A CL, substrato de SiHy e hidrogel de PAAm. Para os experimentos de imaxe, empregouse unha sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) cun radio de punta nominal de 1 nm para capturar imaxes de alta resolución da mostra a unha velocidade de dixitalización de 0,50 Hz. Todas as imaxes tomáronse en solución acuosa.
Os experimentos de nanoindentación AFM realizáronse empregando unha sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). A sonda AFM ten unha punta de silicio sobre unha ménsula de nitruro de 345 nm de grosor, 54 µm de longo e 4,5 µm de ancho cunha frecuencia de resonancia de 45 kHz. Está deseñada especificamente para caracterizar e realizar medicións nanomecánicas cuantitativas en mostras biolóxicas brandas. Os sensores calíbranse individualmente na fábrica con axustes de resorte precalibrados. As constantes de resorte das sondas empregadas neste estudo estiveron no rango de 0,05–0,1 N/m. Para determinar con precisión a forma e o tamaño da punta, a sonda caracterizouse en detalle mediante SEM. Na figura 1a móstrase unha micrografía electrónica de varrido de alta resolución e baixa ampliación da sonda PFQNM-LC-A-CAL, que proporciona unha visión holística do deseño da sonda. Na figura 1b móstrase unha vista ampliada da parte superior da punta da sonda, que proporciona información sobre a forma e o tamaño da punta. No extremo, a agulla ten forma de hemisferio duns 140 nm de diámetro (Fig. 1c). Por debaixo disto, a punta estréase nunha forma cónica, alcanzando unha lonxitude medida de aproximadamente 500 nm. Fóra da rexión que se estreita, a punta é cilíndrica e remata nunha lonxitude total de 1,18 µm. Esta é a principal parte funcional da punta da sonda. Ademais, tamén se empregou para as probas como sonda coloidal unha sonda esférica grande de poliestireno (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EUA) cun diámetro de punta de 45 µm e unha constante de elasticidade de 2 N/m. Comprobouse cunha sonda PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm para comparación.
Informouse de que o líquido pode quedar atrapado entre a sonda AFM e a estrutura do cepillo de polímero durante a nanoindentación, o que exercerá unha forza ascendente sobre a sonda AFM antes de que toque realmente a superficie69. Este efecto de extrusión viscosa debido á retención de fluídos pode cambiar o punto de contacto aparente, afectando así as medicións do módulo superficial. Para estudar o efecto da xeometría da sonda e a velocidade de indentación na retención de fluídos, trazáronse curvas de forza de indentación para mostras de lehfilcon A CL usando unha sonda de 140 nm de diámetro a taxas de desprazamento constantes de 1 µm/s e 2 µm/s. Diámetro da sonda de 45 µm, axuste de forza fixo de 6 nN alcanzado a 1 µm/s. Os experimentos cunha sonda de 140 nm de diámetro realizáronse a unha velocidade de indentación de 1 µm/s e unha forza axustada de 300 pN, escollida para crear unha presión de contacto dentro do rango fisiolóxico (1–8 kPa) da pálpebra superior. presión 72. Probáronse mostras brandas preparadas de hidrogel de PAA cunha presión de 1 kPa para unha forza de indentación de 50 pN a unha velocidade de 1 μm/s usando unha sonda cun diámetro de 140 nm.
Dado que a lonxitude da parte cónica da punta da sonda PFQNM-LC-A-CAL é de aproximadamente 500 nm, para calquera profundidade de indentación < 500 nm pódese asumir con seguridade que a xeometría da sonda durante a indentación permanecerá fiel á súa forma de cono. Ademais, asúmese que a superficie do material en proba presentará unha resposta elástica reversible, que tamén se confirmará nas seguintes seccións. Polo tanto, dependendo da forma e o tamaño da punta, escollemos o modelo de axuste cono-esfera desenvolvido por Briscoe, Sebastian e Adams, que está dispoñible no software do provedor, para procesar os nosos experimentos de nanoindentación AFM (NanoScope). Software de análise de datos de separación, Bruker) 73. O modelo describe a relación forza-desprazamento F(δ) para un cono cun defecto no ápice esférico. Na figura... A figura 2 mostra a xeometría de contacto durante a interacción dun cono ríxido cunha punta esférica, onde R é o radio da punta esférica, a é o radio de contacto, b é o radio de contacto no extremo da punta esférica, δ é a profundidade de indentación do radio de contacto, θ é o semiángulo do cono. A imaxe SEM desta sonda mostra claramente que a punta esférica de 140 nm de diámetro se fusiona tanxencialmente cun cono, polo que aquí b defínese só a través de R, é dicir, b = R cos θ. O software subministrado polo provedor proporciona unha relación cono-esfera para calcular os valores do módulo de Young (E) a partir dos datos de separación de forza supoñendo a > b. Relación:
onde F é a forza de indentación, E é o módulo de Young e ν é o coeficiente de Poisson. O raio de contacto a pódese estimar usando:
Esquema da xeometría de contacto dun cono ríxido cunha punta esférica prensada no material dunha lente de contacto Lefilcon cunha capa superficial de cepillos de polímero ramificados.
Se a ≤ b, a relación redúcese á ecuación para un indentador esférico convencional;
Cremos que a interacción da sonda de indentación coa estrutura ramificada do cepillo de polímero PMPC fará que o raio de contacto a sexa maior que o raio de contacto esférico b. Polo tanto, para todas as medicións cuantitativas do módulo elástico realizadas neste estudo, empregamos a dependencia obtida para o caso a > b.
Os materiais biomiméticos ultrabrandos estudados neste estudo foron fotografados exhaustivamente mediante microscopía electrónica de transmisión de varrido (STEM) da sección transversal da mostra e microscopía de forza atómica (AFM) da superficie. Esta caracterización superficial detallada realizouse como unha extensión do noso traballo publicado anteriormente, no que determinamos que a estrutura de cepillo polimérico ramificada dinamicamente da superficie de lehfilcon A CL modificada con PMPC presentaba propiedades mecánicas similares ao tecido corneal nativo 14. Por este motivo, referímonos ás superficies das lentes de contacto como materiais biomiméticos 14. Na figura 3a e b móstranse seccións transversais de estruturas de cepillo polimérico PMPC ramificadas na superficie dun substrato de lehfilcon A CL e un substrato de SiHy sen tratar, respectivamente. As superficies de ambas as mostras foron analizadas adicionalmente mediante imaxes AFM de alta resolución, o que confirmou aínda máis os resultados da análise STEM (figura 3c e d). En conxunto, estas imaxes dan unha lonxitude aproximada da estrutura de cepillo polimérico ramificado PMPC a 300–400 nm, o que é fundamental para interpretar as medicións de nanoindentación de AFM. Outra observación clave derivada das imaxes é que a estrutura superficial xeral do material biomimético CL é morfoloxicamente diferente da do material de substrato SiHy. Esta diferenza na súa morfoloxía superficial pode facerse evidente durante a súa interacción mecánica coa sonda AFM de indentación e, posteriormente, nos valores de módulo medidos.
Imaxes STEM en sección transversal de (a) lehfilcon A CL e (b) substrato de SiHy. Barra de escala, 500 nm. Imaxes AFM da superficie do substrato de lehfilcon A CL (c) e do substrato base de SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Os polímeros bioinspirados e as estruturas de cepillo de polímeros son inherentemente brandos e foron amplamente estudados e utilizados en diversas aplicacións biomédicas74,75,76,77. Polo tanto, é importante empregar o método de nanoindentación AFM, que pode medir con precisión e fiabilidade as súas propiedades mecánicas. Pero ao mesmo tempo, as propiedades únicas destes materiais ultrabrandos, como o módulo elástico extremadamente baixo, o alto contido de líquido e a alta elasticidade, a miúdo dificultan a elección do material, a forma e o tamaño axeitados da sonda de indentación. Isto é importante para que o indentador non perfore a superficie branda da mostra, o que levaría a erros á hora de determinar o punto de contacto coa superficie e a área de contacto.
Para isto, é esencial unha comprensión exhaustiva da morfoloxía dos materiais biomiméticos ultrabrandos (lehfilcon A CL). A información sobre o tamaño e a estrutura dos cepillos de polímero ramificado obtidos mediante o método de imaxe proporciona a base para a caracterización mecánica da superficie mediante técnicas de nanoindentación AFM. En lugar de sondas coloidais esféricas de tamaño micrónico, escollemos a sonda de nitruro de silicio PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) cun diámetro de punta de 140 nm, especialmente deseñada para o mapeo cuantitativo das propiedades mecánicas de mostras biolóxicas 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. A razón para usar sondas relativamente afiadas en comparación coas sondas coloidais convencionais pode explicarse polas características estruturais do material. Comparando o tamaño da punta da sonda (~140 nm) cos cepillos de polímero ramificados na superficie do lehfilcon A de CL, mostrados na figura 3a, pódese concluír que a punta é o suficientemente grande como para entrar en contacto directo con estas estruturas de cepillo, o que reduce a posibilidade de que a punta as perfore. Para ilustrar este punto, na figura 4 móstrase unha imaxe STEM do lehfilcon A CL e a punta indentada da sonda AFM (debuxada a escala).
Esquema que mostra a imaxe STEM do lehfilcon A CL e unha sonda de indentación ACM (debuxada a escala).
Ademais, o tamaño da punta de 140 nm é o suficientemente pequeno como para evitar o risco de calquera dos efectos de extrusión pegajosa descritos anteriormente para os cepillos de polímero producidos polo método de nanoindentación CP-AFM69,71. Supoñemos que, debido á forma cono-esférica especial e ao tamaño relativamente pequeno desta punta AFM (Fig. 1), a natureza da curva de forza xerada pola nanoindentación de lehfilcon A CL non dependerá da velocidade de indentación nin da velocidade de carga/descarga. Polo tanto, non se ve afectada polos efectos poroelásticos. Para probar esta hipótese, as mostras de lehfilcon A CL foron indentadas a unha forza máxima fixa usando unha sonda PFQNM-LC-A-CAL, pero a dúas velocidades diferentes, e as curvas de forza de tracción e retracción resultantes utilizáronse para trazar a forza (nN) na separación (µm) como se mostra na Figura 5a. É evidente que as curvas de forza durante a carga e a descarga se solapan por completo, e non hai evidencia clara de que a forza de cizallamento a unha profundidade de indentación cero aumente coa velocidade de indentación na figura, o que suxire que os elementos individuais do cepillo foron caracterizados sen un efecto poroelástico. En contraste, os efectos de retención de fluídos (extrusión viscosa e efectos de poroelasticidade) son evidentes para a sonda AFM de 45 µm de diámetro á mesma velocidade de indentación e están destacados pola histérese entre as curvas de estiramento e retracción, como se mostra na Figura 5b. Estes resultados apoian a hipótese e suxiren que as sondas de 140 nm de diámetro son unha boa opción para caracterizar estas superficies brandas.
Curvas de forza de indentación de lehfilcon A CL usando ACM; (a) usando unha sonda cun diámetro de 140 nm a dúas taxas de carga, demostrando a ausencia dun efecto poroelástico durante a indentación superficial; (b) usando sondas cun diámetro de 45 µm e 140 nm. As figuras mostran os efectos da extrusión viscosa e a poroelasticidade para sondas grandes en comparación con sondas máis pequenas.
Para caracterizar superficies ultrabrandas, os métodos de nanoindentación AFM deben ter a mellor sonda para estudar as propiedades do material en estudo. Ademais da forma e tamaño da punta, a sensibilidade do sistema detector AFM, a sensibilidade á deflexión da punta no ambiente de proba e a rixidez do cantiléver xogan un papel importante á hora de determinar a precisión e a fiabilidade das medicións de nanoindentación. Para o noso sistema AFM, o límite de detección do detector sensible á posición (PSD) é de aproximadamente 0,5 mV e baséase na taxa de resorte precalibrada e na sensibilidade de deflexión do fluído calculada da sonda PFQNM-LC-A-CAL, que corresponde á sensibilidade teórica da carga, que é inferior a 0,1 pN. Polo tanto, este método permite a medición dunha forza de indentación mínima ≤ 0,1 pN sen ningún compoñente de ruído periférico. Non obstante, é case imposible que un sistema AFM reduza o ruído periférico a este nivel debido a factores como a vibración mecánica e a dinámica de fluídos. Estes factores limitan a sensibilidade global do método de nanoindentación AFM e tamén resultan nun sinal de ruído de fondo de aproximadamente ≤ 10 pN. Para a caracterización da superficie, as mostras de substrato de lehfilcon A CL e SiHy foron indentadas en condicións totalmente hidratadas usando unha sonda de 140 nm para a caracterización SEM, e as curvas de forza resultantes superpuxéronse entre a forza (pN) e a presión. O gráfico de separación (µm) móstrase na Figura 6a. En comparación co substrato base de SiHy, a curva de forza de lehfilcon A CL mostra claramente unha fase de transición que comeza no punto de contacto co cepillo de polímero bifurcado e remata cun cambio brusco na pendente que marca o contacto da punta co material subxacente. Esta parte de transición da curva de forza destaca o comportamento verdadeiramente elástico do cepillo de polímero ramificado na superficie, como o demostra a curva de compresión que segue de preto a curva de tensión e o contraste nas propiedades mecánicas entre a estrutura do cepillo e o material voluminoso de SiHy. Ao comparar o lefilcon... A separación da lonxitude media dun pincel de polímero ramificado na imaxe STEM do PCS (Fig. 3a) e a súa curva de forza ao longo da abscisa na Fig. 3a. 6a mostra que o método é capaz de detectar a punta e o polímero ramificado que alcanzan a parte superior da superficie. Contacto entre as estruturas do pincel. Ademais, a estreita superposición das curvas de forza indica que non hai efecto de retención de líquidos. Neste caso, non hai absolutamente ningunha adhesión entre a agulla e a superficie da mostra. As seccións superiores das curvas de forza para as dúas mostras solapanse, o que reflicte a semellanza das propiedades mecánicas dos materiais do substrato.
(a) Curvas de forza de nanoindentación AFM para substratos de lehfilcon A CL e substratos de SiHy, (b) curvas de forza que mostran a estimación do punto de contacto usando o método do limiar de ruído de fondo.
Para estudar os detalles máis finos da curva de forza, a curva de tensión da mostra lehfilcon A CL represéntase de novo na figura 6b cunha forza máxima de 50 pN ao longo do eixe y. Este gráfico proporciona información importante sobre o ruído de fondo orixinal. O ruído está no rango de ±10 pN, que se usa para determinar con precisión o punto de contacto e calcular a profundidade de indentación. Como se informa na literatura, a identificación dos puntos de contacto é fundamental para avaliar con precisión as propiedades dos materiais, como o módulo85. Unha abordaxe que implica o procesamento automático de datos da curva de forza mostrou un mellor axuste entre o axuste de datos e as medicións cuantitativas para materiais brandos86. Neste traballo, a nosa elección de puntos de contacto é relativamente sinxela e obxectiva, pero ten as súas limitacións. A nosa abordaxe conservadora para determinar o punto de contacto pode resultar en valores de módulo lixeiramente sobreestimados para profundidades de indentación máis pequenas (< 100 nm). O uso da detección de puntos de contacto baseada en algoritmos e o procesamento automatizado de datos podería ser unha continuación deste traballo no futuro para mellorar aínda máis o noso método. Así, para un ruído de fondo intrínseco da orde de ±10 pN, definimos o punto de contacto como o primeiro punto de datos no eixe x na Figura 6b cun valor de ≥10 pN. Entón, de acordo co limiar de ruído de 10 pN, unha liña vertical ao nivel de ~0,27 µm marca o punto de contacto coa superficie, despois do cal a curva de estiramento continúa ata que o substrato alcanza a profundidade de indentación de ~270 nm. Curiosamente, en función do tamaño das características do cepillo de polímero ramificado (300–400 nm) medidas mediante o método de imaxe, a profundidade de indentación da mostra CL lehfilcon A observada mediante o método do limiar de ruído de fondo é duns 270 nm, o que está moi preto do tamaño de medición con STEM. Estes resultados confirman aínda máis a compatibilidade e aplicabilidade da forma e o tamaño da punta da sonda AFM para a indentación desta estrutura de cepillo de polímero ramificado moi suave e altamente elástica. Estes datos tamén proporcionan evidencia sólida para apoiar o noso método de usar o ruído de fondo como limiar para localizar puntos de contacto. Polo tanto, calquera resultado cuantitativo obtido a partir da modelización matemática e do axuste da curva de forza debería ser relativamente preciso.
As medicións cuantitativas mediante métodos de nanoindentación AFM dependen completamente dos modelos matemáticos empregados para a selección de datos e a análise posterior. Polo tanto, é importante considerar todos os factores relacionados coa elección do indentador, as propiedades do material e a mecánica da súa interacción antes de escoller un modelo en particular. Neste caso, a xeometría da punta caracterizouse coidadosamente mediante micrografías SEM (Fig. 1) e, baseándose nos resultados, a sonda de nanoindentación AFM de 140 nm de diámetro cun cono duro e unha xeometría de punta esférica é unha boa opción para caracterizar mostras de lehfilcon A CL79. Outro factor importante que debe avaliarse coidadosamente é a elasticidade do material polimérico que se está a probar. Aínda que os datos iniciais de nanoindentación (Figs. 5a e 6a) describen claramente as características da superposición das curvas de tensión e compresión, é dicir, a recuperación elástica completa do material, é extremadamente importante confirmar a natureza puramente elástica dos contactos. Para este fin, realizáronse dúas indentacións sucesivas no mesmo lugar da superficie da mostra de lehfilcon A CL a unha velocidade de indentación de 1 µm/s en condicións de hidratación completa. Os datos da curva de forza resultante móstranse na figura 7 e, como se esperaba, as curvas de expansión e compresión das dúas impresións son case idénticas, o que destaca a alta elasticidade da estrutura ramificada do cepillo de polímero.
Dúas curvas de forza de indentación no mesmo lugar da superficie do lehfilcon A CL indican a elasticidade ideal da superficie da lente.
Baseándose na información obtida das imaxes SEM e STEM da punta da sonda e da superficie lehfilcon A CL, respectivamente, o modelo cono-esfera é unha representación matemática razoable da interacción entre a punta da sonda AFM e o material polimérico brando que se está a probar. Ademais, para este modelo cono-esfera, as suposicións fundamentais sobre as propiedades elásticas do material impreso son válidas para este novo material biomimético e utilízanse para cuantificar o módulo elástico.
Tras unha avaliación exhaustiva do método de nanoindentación AFM e os seus compoñentes, incluíndo as propiedades da sonda de indentación (forma, tamaño e rixidez do resorte), a sensibilidade (estimación do ruído de fondo e do punto de contacto) e os modelos de axuste de datos (medicións cuantitativas do módulo), utilizouse o método para caracterizar mostras ultrabrandas dispoñibles comercialmente para verificar os resultados cuantitativos. Probouse un hidrogel de poliacrilamida (PAAM) comercial cun módulo elástico de 1 kPa en condicións hidratadas usando unha sonda de 140 nm. Os detalles das probas e cálculos do módulo ofrécense na Información Suplementaria. Os resultados mostraron que o módulo medio medido foi de 0,92 kPa, e que a %RSD e a desviación porcentual (%) do módulo coñecido foron inferiores ao 10 %. Estes resultados confirman a precisión e a reproducibilidade do método de nanoindentación AFM usado neste traballo para medir os módulos de materiais ultrabrandos. As superficies das mostras de lehfilcon A CL e o substrato base de SiHy caracterizáronse aínda máis usando o mesmo método de nanoindentación AFM para estudar o módulo de contacto aparente da superficie ultrabranda en función da profundidade de indentación. Xeráronse curvas de separación da forza de indentación para tres mostras de cada tipo (n = 3; unha indentación por mostra) a unha forza de 300 pN, unha velocidade de 1 µm/s e hidratación completa. A curva de repartición da forza de indentación aproximouse usando un modelo de cono-esfera. Para obter un módulo dependente da profundidade de indentación, estableceuse unha porción de 40 nm de ancho da curva de forza en cada incremento de 20 nm a partir do punto de contacto e medíronse os valores do módulo en cada paso da curva de forza. Spin Cy et al. Utilizouse unha abordaxe similar para caracterizar o gradiente de módulo das escobillas de polímero de poli(metacrilato de laurilo) (P12MA) usando nanoindentación de sonda AFM coloidal, e son consistentes cos datos que usan o modelo de contacto de Hertz. Esta abordaxe proporciona unha gráfica do módulo de contacto aparente (kPa) fronte á profundidade de indentación (nm), como se mostra na Figura 8, que ilustra o gradiente de módulo/profundidade de contacto aparente. O módulo elástico calculado da mostra CL lehfilcon A está no rango de 2–3 kPa dentro dos 100 nm superiores da mostra, a partir do cal comeza a aumentar coa profundidade. Por outra banda, ao probar o substrato base de SiHy sen unha película tipo pincel na superficie, a profundidade máxima de indentación alcanzada a unha forza de 300 pN é inferior a 50 nm, e o valor do módulo obtido dos datos é duns 400 kPa, o que é comparable aos valores do módulo de Young para materiais a granel.
Módulo de contacto aparente (kPa) fronte á profundidade de indentación (nm) para substratos de lehfilcon A CL e SiHy usando o método de nanoindentación AFM con xeometría de cono-esfera para medir o módulo.
A superficie superior da nova estrutura de cepillo de polímero ramificado biomimético presenta un módulo de elasticidade extremadamente baixo (2–3 kPa). Isto coincidirá co extremo colgante libre do cepillo de polímero bifurcado, como se mostra na imaxe STEM. Aínda que hai algunhas evidencias dun gradiente de módulo no bordo exterior do CL, o substrato principal de alto módulo é máis influente. Non obstante, os 100 nm superiores da superficie están dentro do 20 % da lonxitude total do cepillo de polímero ramificado, polo que é razoable supoñer que os valores medidos do módulo neste rango de profundidade de indentación son relativamente precisos e non dependen fortemente do efecto do obxecto inferior.
Debido ao deseño biomimético único das lentes de contacto lehfilcon A, que consisten en estruturas de cepillo de polímero PMPC ramificadas enxertadas na superficie de substratos de SiHy, é moi difícil caracterizar de forma fiable as propiedades mecánicas das súas estruturas superficiais utilizando métodos de medición tradicionais. Aquí presentamos un método avanzado de nanoindentación AFM para caracterizar con precisión materiais ultrabrandos como lefilcon A con alto contido de auga e elasticidade extremadamente alta. Este método baséase no uso dunha sonda AFM cuxo tamaño de punta e xeometría se escolle coidadosamente para coincidir coas dimensións estruturais das características da superficie ultrabranda que se van imprimir. Esta combinación de dimensións entre a sonda e a estrutura proporciona unha maior sensibilidade, o que nos permite medir o baixo módulo e as propiedades elásticas inherentes dos elementos de cepillo de polímero ramificado, independentemente dos efectos poroelásticos. Os resultados mostraron que os cepillos de polímero PMPC ramificados únicos característicos da superficie da lente tiñan un módulo elástico extremadamente baixo (ata 2 kPa) e unha elasticidade moi alta (case do 100 %) cando se probaban nun ambiente acuoso. Os resultados da nanoindentación AFM tamén nos permitiron caracterizar o gradiente aparente de módulo de contacto/profundidade (30 kPa/200 nm) da superficie da lente biomimética. Este gradiente pode deberse á diferenza de módulo entre as escobillas de polímero ramificadas e o substrato de SiHy, ou á estrutura/densidade ramificada das escobillas de polímero, ou a unha combinación das mesmas. Non obstante, necesítanse máis estudos en profundidade para comprender plenamente a relación entre a estrutura e as propiedades, especialmente o efecto da ramificación das escobillas nas propiedades mecánicas. Medicións similares poden axudar a caracterizar as propiedades mecánicas da superficie doutros materiais ultrabrandos e dispositivos médicos.
Os conxuntos de datos xerados e/ou analizados durante o estudo actual están dispoñibles a través dos respectivos autores se se solicitan con razoable solicitude.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. e Haugen, HJ Reaccións biolóxicas ás propiedades físicas e químicas das superficies de biomateriais. Chemical Society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM e Liu, X. Mellora de biomateriais derivados de humanos para a enxeñaría de tecidos. Programación. Polímero. A ciencia. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Deseño, implementación clínica e resposta inmunitaria de biomateriais en medicina rexenerativa. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK e Farr GM Un método mellorado para determinar a dureza e o módulo elástico mediante experimentos de indentación con medicións de carga e desprazamento. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM. Orixes históricas das probas de dureza por indentación. Alma Mater. A ciencia. Tecnoloxías. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Medicións da dureza por indentación a macro, micro e nanoescala: unha revisión crítica. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD e Clapperich, SM Os erros de detección superficial provocan unha sobreestimación do módulo na nanoindentación de materiais brandos. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR e Yahya M.Yu. Avaliación do método de nanoindentación para determinar as características mecánicas de nanocompostos heteroxéneos mediante métodos experimentais e computacionais. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR e Owart, TS. Caracterización mecánica de xeles viscoelásticos brandos mediante indentación e análise de elementos finitos inversos baseada na optimización. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J e Chaneler D. Optimización da determinación da viscoelasticidade empregando sistemas de medición compatibles. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. e Pellillo, E. Nanoindentación de superficies poliméricas. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. e Van Vliet KJ Caracterización das propiedades mecánicas viscoelásticas de polímeros e tecidos biolóxicos altamente elásticos mediante indentación por choque. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Avaliación do módulo elástico e do traballo de adhesión de materiais brandos empregando o método Borodich-Galanov (BG) ampliado e indentación profunda. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Morfoloxía a nanoescala e propiedades mecánicas de superficies poliméricas biomiméticas de lentes de contacto de hidroxel de silicona. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).