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Avec le développement de nouveaux matériaux ultra-souples pour les dispositifs médicaux et les applications biomédicales, la caractérisation complète de leurs propriétés physiques et mécaniques est à la fois importante et complexe. Une technique de nanoindentation par microscopie à force atomique (AFM) modifiée a été appliquée pour caractériser le module de surface extrêmement faible de la nouvelle lentille de contact biomimétique en silicone hydrogel lehfilcon A, revêtue d'une couche de structures polymères ramifiées. Cette méthode permet une détermination précise des points de contact sans les effets d'extrusion visqueuse à l'approche des polymères ramifiés. De plus, elle permet de déterminer les caractéristiques mécaniques des éléments individuels de la structure sans l'influence de la poroélasticité. Ceci est rendu possible grâce à la sélection d'une sonde AFM dont la conception (taille de la pointe, géométrie et raideur du ressort) est particulièrement adaptée à la mesure des propriétés des matériaux souples et des échantillons biologiques. Cette méthode améliore la sensibilité et la précision de la mesure du matériau très souple lehfilcon A, qui présente un module d'élasticité extrêmement faible en surface (jusqu'à 2 kPa) et une élasticité extrêmement élevée en milieu aqueux (quasi-totalement aqueux). L'étude de surface a non seulement révélé les propriétés de surface ultra-souples de la lentille en lehfilcon A, mais a également montré que le module des brosses polymères ramifiées était comparable à celui du substrat silicium-hydrogène. Cette technique de caractérisation de surface peut être appliquée à d'autres matériaux ultra-souples et dispositifs médicaux.
Les propriétés mécaniques des matériaux destinés au contact direct avec les tissus vivants sont souvent déterminées par l'environnement biologique. Une parfaite adéquation de ces propriétés permet d'obtenir les caractéristiques cliniques souhaitées sans induire de réactions cellulaires indésirables^1,2,3. Pour les matériaux homogènes massifs, la caractérisation des propriétés mécaniques est relativement aisée grâce à la disponibilité de procédures et de méthodes d'essai standardisées (par exemple, la microindentation^4,5,6). Cependant, pour les matériaux ultra-souples tels que les gels, les hydrogels, les biopolymères, les cellules vivantes, etc., ces méthodes d'essai sont généralement inapplicables en raison des limitations de résolution des mesures et de l'hétérogénéité de certains matériaux⁷. Au fil des années, les méthodes d'indentation traditionnelles ont été modifiées et adaptées à la caractérisation d'une large gamme de matériaux mous, mais nombre d'entre elles présentent encore des lacunes importantes qui limitent leur utilisation^{8,9,10,11,12,13}. L'absence de méthodes d'essai spécialisées permettant de caractériser avec précision et fiabilité les propriétés mécaniques des matériaux ultra-souples et des couches superficielles limite considérablement leur utilisation dans diverses applications.
Dans nos travaux précédents, nous avons présenté la lentille de contact en lehfilcon A (LC), un matériau hétérogène souple doté de propriétés de surface ultra-douces, issues de conceptions potentiellement biomimétiques inspirées de la surface de la cornée. Ce biomatériau a été développé par greffage d'une couche polymère ramifiée et réticulée de poly(2-méthacryloyloxyéthylphosphorylcholine (MPC)) (PMPC) sur un hydrogel de silicone (SiHy)¹⁵ conçu pour les dispositifs médicaux. Ce procédé de greffage crée en surface une couche constituée d'une structure polymère ramifiée en brosse, très souple et hautement élastique. Nos travaux précédents ont confirmé que la structure biomimétique de la LC en lehfilcon A confère des propriétés de surface supérieures, telles qu'une meilleure mouillabilité et une prévention accrue de l'encrassement, une lubrification améliorée et une adhésion cellulaire et bactérienne réduite^15,16. De plus, l'utilisation et le développement de ce matériau biomimétique laissent entrevoir des applications potentielles dans d'autres dispositifs biomédicaux. Il est donc essentiel de caractériser les propriétés de surface de ce matériau ultra-souple et de comprendre son interaction mécanique avec l'œil afin de constituer une base de connaissances exhaustive pour soutenir les développements et applications futurs. La plupart des lentilles de contact en SiHy disponibles sur le marché sont composées d'un mélange homogène de polymères hydrophiles et hydrophobes formant une structure matérielle uniforme¹⁷. Plusieurs études ont été menées pour étudier leurs propriétés mécaniques à l'aide de méthodes d'essai classiques de compression, de traction et de microindentation^18,19,20,21. Cependant, la conception biomimétique novatrice de la lentille de contact en lehfilcon A en fait un matériau hétérogène unique, dont les propriétés mécaniques des structures de polymères ramifiés diffèrent significativement de celles du substrat de base en SiHy. Par conséquent, il est très difficile de quantifier précisément ces propriétés à l'aide des méthodes conventionnelles et d'indentation. Une méthode prometteuse utilise la nanoindentation couplée à la microscopie à force atomique (AFM), une technique employée pour déterminer les propriétés mécaniques de matériaux viscoélastiques souples tels que les cellules et les tissus biologiques, ainsi que les polymères souples^22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. En nanoindentation AFM, les principes fondamentaux des essais de nanoindentation sont combinés aux dernières avancées technologiques en matière d'AFM pour offrir une sensibilité de mesure accrue et permettre l'essai d'une large gamme de matériaux intrinsèquement très mous31,32,33,34,35,36. De plus, cette technologie offre d'autres avantages importants grâce à l'utilisation de différentes géométries d'indenteur et de sonde, ainsi qu'à la possibilité d'effectuer des essais dans divers milieux liquides.
La nanoindentation AFM peut être divisée en trois composantes principales : (1) l’équipement (capteurs, détecteurs, sondes, etc.) ; (2) les paramètres de mesure (force, déplacement, vitesse, amplitude de la rampe, etc.) ; (3) le traitement des données (correction de la ligne de base, estimation du point de contact, ajustement des données, modélisation, etc.). Un problème majeur de cette méthode réside dans le fait que plusieurs études publiées, utilisant la nanoindentation AFM, rapportent des résultats quantitatifs très différents pour un même type d’échantillon/cellule/matériau^{37,38,39,40,41}. Par exemple, Lekka et al. ont étudié et comparé l’influence de la géométrie de la sonde AFM sur le module de Young mesuré d’échantillons d’hydrogel mécaniquement homogène et de cellules hétérogènes. Ils rapportent que les valeurs du module dépendent fortement du choix du levier et de la forme de la pointe, la valeur la plus élevée étant obtenue avec une sonde pyramidale et la plus faible avec une sonde sphérique. De même, Selhuber-Unkel et al. Il a été démontré que la vitesse et la taille de l'indenteur, ainsi que l'épaisseur des échantillons de polyacrylamide (PAAM), influencent le module de Young mesuré par nanoindentation ACM43. L'absence de matériaux d'essai standardisés à très faible module et de procédures d'essai gratuites constitue un autre facteur de complication. Il est donc très difficile d'obtenir des résultats précis et fiables. Néanmoins, la méthode s'avère très utile pour les mesures relatives et les évaluations comparatives entre échantillons similaires, par exemple en utilisant la nanoindentation AFM pour distinguer les cellules normales des cellules cancéreuses^{44, 45}.
Lors de l'analyse de matériaux mous par nanoindentation AFM, il est généralement conseillé d'utiliser une sonde à faible constante de raideur (k) proche du module d'Young de l'échantillon, ainsi qu'une pointe hémisphérique ou ronde afin d'éviter toute perforation de la surface de l'échantillon lors du premier contact. Il est également important que le signal de déflexion généré par la sonde soit suffisamment intense pour être détecté par le système de détection laser^24,34,46,47. Dans le cas de cellules, de tissus et de gels hétérogènes ultra-mous, un autre défi consiste à surmonter la force d'adhérence entre la sonde et la surface de l'échantillon afin de garantir des mesures reproductibles et fiables^48,49,50. Jusqu'à récemment, la plupart des travaux sur la nanoindentation AFM se sont concentrés sur l'étude du comportement mécanique des cellules, tissus, gels, hydrogels et biomolécules biologiques à l'aide de sondes sphériques relativement grandes, communément appelées sondes colloïdales (SC). 47, 51, 52, 53, 54, 55. Ces pointes ont un rayon de 1 à 50 µm et sont généralement fabriquées en verre borosilicaté, en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), en polystyrène (PS), en dioxyde de silicium (SiO₂) et en carbone amorphe (DLC). Bien que la nanoindentation CP-AFM soit souvent privilégiée pour la caractérisation d'échantillons mous, elle présente des problèmes et des limitations. L'utilisation de pointes sphériques de grande taille (micrométriques) augmente la surface de contact totale entre la pointe et l'échantillon, ce qui entraîne une perte significative de résolution spatiale. Pour les échantillons mous et hétérogènes, où les propriétés mécaniques locales peuvent différer sensiblement de la moyenne sur une zone plus étendue, l'indentation CP peut masquer toute hétérogénéité des propriétés à l'échelle locale⁵². Les sondes colloïdales sont généralement fabriquées en fixant des sphères colloïdales micrométriques à des microleviers sans pointe à l'aide d'adhésifs époxy. Le processus de fabrication lui-même est complexe et peut engendrer des incohérences lors de l'étalonnage de la sonde. De plus, la taille et la masse des particules colloïdales influent directement sur les principaux paramètres d'étalonnage du levier, tels que la fréquence de résonance, la rigidité du ressort et la sensibilité à la déflexion^56,57,58. Par conséquent, les méthodes couramment utilisées pour les sondes AFM conventionnelles, comme l'étalonnage en température, peuvent ne pas fournir un étalonnage précis pour les sondes à particules colloïdales (CP), et d'autres méthodes peuvent s'avérer nécessaires pour effectuer ces corrections^57,59,60,61. Les expériences d'indentation CP classiques utilisent des leviers à grandes déviations pour étudier les propriétés d'échantillons mous, ce qui pose un autre problème lors de l'étalonnage du comportement non linéaire du levier à des déviations relativement importantes^62,63,64. Les méthodes modernes d'indentation par sonde colloïdale prennent généralement en compte la géométrie du levier utilisé pour l'étalonnage, mais négligent l'influence des particules colloïdales, ce qui introduit une incertitude supplémentaire quant à la précision de la méthode^38,61. De même, les modules d'élasticité calculés par modélisation de contact dépendent directement de la géométrie de la pointe d'indentation, et un décalage entre les caractéristiques de la pointe et celles de la surface de l'échantillon peut entraîner des imprécisions^{27, 65, 66, 67, 68}. Des travaux récents de Spencer et al. mettent en évidence les facteurs à prendre en compte lors de la caractérisation de brosses polymères souples par nanoindentation CP-AFM. Ils ont montré que la rétention d'un fluide visqueux dans les brosses polymères, en fonction de la vitesse, induit une augmentation de la charge sur la tête et, par conséquent, des mesures différentes des propriétés dépendantes de la vitesse^{30, 69, 70, 71}.
Dans cette étude, nous avons caractérisé le module de surface du matériau ultra-souple et hautement élastique lehfilcon A CL à l'aide d'une méthode de nanoindentation AFM modifiée. Compte tenu des propriétés et de la structure inédite de ce matériau, la sensibilité de la méthode d'indentation traditionnelle est manifestement insuffisante pour caractériser le module de ce matériau extrêmement mou. Il est donc nécessaire d'utiliser une méthode de nanoindentation AFM à sensibilité accrue. Après avoir examiné les limitations et les problèmes des techniques de nanoindentation AFM existantes avec sonde colloïdale, nous expliquons pourquoi nous avons opté pour une sonde AFM plus petite et conçue sur mesure afin d'éliminer les problèmes de sensibilité et le bruit de fond, de localiser précisément le point de contact, de mesurer le module de vitesse des matériaux hétérogènes mous, notamment en tenant compte de la dépendance à la rétention de fluide, et d'obtenir une quantification précise. De plus, nous avons pu mesurer avec précision la forme et les dimensions de la pointe d'indentation, ce qui nous a permis d'utiliser le modèle d'ajustement cône-sphère pour déterminer le module d'élasticité sans avoir à évaluer la surface de contact entre la pointe et le matériau. Les deux hypothèses implicites quantifiées dans ce travail sont les propriétés élastiques complètes du matériau et le module d'élasticité indépendant de la profondeur d'indentation. À l'aide de cette méthode, nous avons d'abord testé des matériaux ultra-souples de référence, dont le module d'élasticité est connu, afin de la quantifier. Nous l'avons ensuite utilisée pour caractériser les surfaces de deux matériaux différents utilisés dans la fabrication de lentilles de contact. Cette méthode de caractérisation des surfaces par nanoindentation AFM, avec une sensibilité accrue, devrait trouver des applications dans une large gamme de matériaux ultra-souples hétérogènes biomimétiques, potentiellement utilisables dans les dispositifs médicaux et les applications biomédicales.
Des lentilles de contact Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, États-Unis) et leurs substrats en hydrogel de silicone ont été sélectionnés pour des expériences de nanoindentation. Un support de lentille spécialement conçu a été utilisé. Pour installer la lentille de test, celle-ci a été soigneusement placée sur le support en forme de dôme, en veillant à l'absence de bulles d'air, puis fixée par les bords. Un orifice situé en haut du support permet d'accéder au centre optique de la lentille pour les expériences de nanoindentation, tout en maintenant le liquide en place. Ceci assure une hydratation optimale des lentilles. 500 μl de solution d'emballage pour lentilles de contact ont été utilisés comme solution de test. Afin de vérifier les résultats quantitatifs, des hydrogels de polyacrylamide (PAAM) non activés, disponibles dans le commerce, ont été préparés à partir d'une composition de polyacrylamide-co-méthylène-bisacrylamide (boîtes de Petri Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, Californie, États-Unis), présentant un module d'élasticité connu de 1 kPa. Déposer 4 à 5 gouttes (environ 125 µl) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS de Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, États-Unis) et 1 goutte de solution pour lentilles de contact OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, États-Unis) à l'interface hydrogel-sonde AFM.
Des échantillons de Lehfilcon A CL et de substrats SiHy ont été visualisés à l'aide d'un microscope électronique à balayage à émission de champ (MEB-FEG) FEI Quanta 250 équipé d'un détecteur de microscopie électronique à transmission à balayage (MET-B). Pour préparer les échantillons, les lentilles ont d'abord été lavées à l'eau puis découpées en secteurs. Afin d'obtenir un contraste différentiel entre les composants hydrophiles et hydrophobes des échantillons, une solution stabilisée de RuO₄ à 0,10 % a été utilisée comme colorant, dans laquelle les échantillons ont été immergés pendant 30 minutes. La coloration du Lehfilcon A CL au RuO₄ est importante non seulement pour améliorer le contraste différentiel, mais aussi pour préserver la structure des brosses polymères ramifiées dans leur forme originale, qui est alors visible sur les images MET-B. Les échantillons ont ensuite été lavés et déshydratés dans une série de mélanges éthanol/eau à concentration croissante d'éthanol. Ils ont ensuite été enrobés d'époxy EMBed 812/Araldite, polymérisé pendant une nuit à 70 °C. Les blocs d'échantillons obtenus par polymérisation de résine ont été découpés à l'aide d'un ultramicrotome, et les coupes fines résultantes ont été visualisées par microscopie électronique à balayage en transmission (STEM) en mode basse pression sous une tension d'accélération de 30 kV. Le même système MEB a été utilisé pour la caractérisation détaillée de la sonde AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, États-Unis). Les images MEB de la sonde AFM ont été acquises en mode haute pression sous une tension d'accélération de 30 kV. Des images ont été acquises sous différents angles et grossissements afin d'enregistrer tous les détails de la forme et de la taille de la pointe de la sonde AFM. Toutes les dimensions de la pointe présentant un intérêt sur les images ont été mesurées numériquement.
Un microscope à force atomique Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, États-Unis) en mode « PeakForce QNM in Fluid » a été utilisé pour visualiser et nanoindenter des échantillons de lehfilcon A CL, de substrat SiHy et d’hydrogel de PAAm. Pour les expériences d’imagerie, une sonde PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) d’un rayon de courbure nominal de 1 nm a permis d’acquérir des images haute résolution de l’échantillon à une vitesse de balayage de 0,50 Hz. Toutes les images ont été prises en solution aqueuse.
Des expériences de nanoindentation AFM ont été réalisées à l'aide d'une sonde PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Cette sonde AFM est composée d'une pointe en silicium montée sur un levier en nitrure de 345 nm d'épaisseur, 54 µm de long et 4,5 µm de large, avec une fréquence de résonance de 45 kHz. Elle est spécifiquement conçue pour la caractérisation et la réalisation de mesures nanomécaniques quantitatives sur des échantillons biologiques mous. Les capteurs sont calibrés individuellement en usine avec des réglages de ressort pré-calibrés. Les constantes de raideur des sondes utilisées dans cette étude étaient comprises entre 0,05 et 0,1 N/m. Afin de déterminer précisément la forme et la taille de la pointe, la sonde a été caractérisée en détail par microscopie électronique à balayage (MEB). La figure 1a présente une micrographie électronique à balayage haute résolution et faible grossissement de la sonde PFQNM-LC-A-CAL, offrant une vue d'ensemble de sa conception. La figure 1b présente une vue agrandie de l'extrémité de la sonde, fournissant des informations sur sa forme et sa taille. À son extrémité, l'aiguille est un hémisphère d'environ 140 nm de diamètre (Fig. 1c). Plus bas, l'extrémité s'effile en une forme conique, atteignant une longueur mesurée d'environ 500 nm. Au-delà de cette zone effilée, l'extrémité est cylindrique et se termine par une longueur totale de 1,18 µm. Il s'agit de la partie fonctionnelle principale de la sonde. Par ailleurs, une sonde sphérique en polystyrène (PS) de grande taille (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, États-Unis) d'un diamètre de pointe de 45 µm et d'une constante de raideur de 2 N/m a également été utilisée comme sonde colloïdale, en comparaison avec la sonde PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm.
Il a été rapporté que du liquide peut être piégé entre la sonde AFM et la structure de la brosse polymère lors de la nanoindentation, exerçant ainsi une force ascendante sur la sonde avant même qu'elle n'entre en contact avec la surface⁶⁹. Cet effet d'extrusion visqueuse dû à la rétention de fluide peut modifier le point de contact apparent, affectant de ce fait les mesures du module de surface. Afin d'étudier l'influence de la géométrie de la sonde et de la vitesse d'indentation sur la rétention de fluide, des courbes de force d'indentation ont été tracées pour des échantillons de lentilles de contact en lehfilcon A à l'aide d'une sonde de 140 nm de diamètre à des vitesses de déplacement constantes de 1 µm/s et 2 µm/s. Des expériences avec une sonde de 45 µm de diamètre et une force fixe de 6 nN ont été réalisées à 1 µm/s. Les expériences avec une sonde de 140 nm de diamètre ont été menées à une vitesse d'indentation de 1 µm/s et une force appliquée de 300 pN, choisie pour créer une pression de contact dans la plage physiologique (1–8 kPa) de la paupière supérieure. pression 72. Des échantillons souples prêts à l'emploi d'hydrogel PAA avec une pression de 1 kPa ont été testés pour une force d'indentation de 50 pN à une vitesse de 1 μm/s à l'aide d'une sonde d'un diamètre de 140 nm.
Étant donné que la longueur de la partie conique de la pointe de la sonde PFQNM-LC-A-CAL est d'environ 500 nm, on peut raisonnablement supposer que, pour toute profondeur d'indentation inférieure à 500 nm, la géométrie de la sonde restera conforme à sa forme conique pendant l'indentation. De plus, on suppose que la surface du matériau testé présentera une réponse élastique réversible, ce qui sera également confirmé dans les sections suivantes. Par conséquent, en fonction de la forme et de la taille de la pointe, nous avons choisi le modèle d'ajustement cône-sphère développé par Briscoe, Sebastian et Adams, disponible dans le logiciel du fournisseur (NanoScope, Bruker). Ce modèle décrit la relation force-déplacement F(δ) pour un cône présentant un défaut sphérique à son sommet. (Voir figure 73). La figure 2 illustre la géométrie de contact lors de l'interaction d'un cône rigide avec une pointe sphérique. R représente le rayon de la pointe sphérique, a le rayon de contact, b le rayon de contact à l'extrémité de la pointe sphérique, δ la profondeur d'indentation et θ le demi-angle du cône. L'image MEB de cette sonde montre clairement que la pointe sphérique de 140 nm de diamètre se raccorde tangentiellement au cône. Par conséquent, b est défini uniquement par R, soit b = R cos θ. Le logiciel fourni par le fabricant établit une relation cône-sphère permettant de calculer le module de Young (E) à partir des données de force-séparation, en supposant a > b.
où F représente la force d'indentation, E le module de Young et ν le coefficient de Poisson. Le rayon de contact a peut être estimé à l'aide de :
Schéma de la géométrie de contact d'un cône rigide à pointe sphérique pressé dans le matériau d'une lentille de contact Lefilcon avec une couche superficielle de brosses polymères ramifiées.
Si a ≤ b, la relation se réduit à l'équation d'un pénétrateur sphérique conventionnel ;
Nous pensons que l'interaction de la sonde d'indentation avec la structure ramifiée de la brosse polymère PMPC entraînera un rayon de contact a supérieur au rayon de contact sphérique b. Par conséquent, pour toutes les mesures quantitatives du module d'élasticité réalisées dans cette étude, nous avons utilisé la relation obtenue pour le cas a > b.
Les matériaux biomimétiques ultra-souples étudiés ici ont été caractérisés par microscopie électronique à transmission à balayage (STEM) de la section transversale et par microscopie à force atomique (AFM) de la surface. Cette caractérisation détaillée fait suite à nos travaux antérieurs, qui ont démontré que la structure en brosse polymère ramifiée de la surface de la lentille de contact en lehfilcon A modifiée par PMPC présentait des propriétés mécaniques similaires à celles du tissu cornéen natif¹⁴. C’est pourquoi nous qualifions les surfaces de lentilles de contact de matériaux biomimétiques¹⁴. Les figures 3a et 3b présentent des sections transversales de structures en brosse polymère PMPC ramifiées sur la surface d’un substrat de lentille de contact en lehfilcon A et d’un substrat de SiHy non traité, respectivement. L’analyse des surfaces des deux échantillons par imagerie AFM haute résolution a confirmé les résultats de l’analyse STEM (figures 3c et 3d). L'ensemble de ces images permet d'estimer la longueur de la structure en brosse polymère ramifiée du PMPC à environ 300–400 nm, une donnée essentielle pour l'interprétation des mesures de nanoindentation par AFM. Une autre observation importante, tirée de ces images, est que la structure de surface globale du matériau biomimétique CL présente une morphologie différente de celle du substrat SiHy. Cette différence de morphologie de surface se manifeste lors de l'interaction mécanique avec la pointe AFM et influence ensuite les valeurs du module mesurées.
Images STEM en coupe transversale de (a) la couche catalytique de lehfilcon A et (b) du substrat SiHy. Échelle : 500 nm. Images AFM de la surface du substrat de la couche catalytique de lehfilcon A (c) et du substrat de base SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Les polymères bio-inspirés et les structures de polymères en brosse sont intrinsèquement souples et ont fait l'objet de nombreuses études et utilisations dans diverses applications biomédicales^74,75,76,77. Il est donc important d'utiliser la méthode de nanoindentation AFM, qui permet de mesurer avec précision et fiabilité leurs propriétés mécaniques. Cependant, les propriétés uniques de ces matériaux ultra-souples, telles qu'un module d'élasticité extrêmement faible, une teneur en liquide élevée et une grande élasticité, rendent souvent difficile le choix du matériau, de la forme et de la taille de la sonde d'indentation. Il est crucial d'éviter que l'indenteur ne perfore la surface souple de l'échantillon, ce qui entraînerait des erreurs dans la détermination du point et de la surface de contact.
Pour cela, une compréhension approfondie de la morphologie des matériaux biomimétiques ultra-souples (lehfilcon A CL) est essentielle. Les informations relatives à la taille et à la structure des brosses polymères ramifiées, obtenues par imagerie, constituent la base de la caractérisation mécanique de la surface par nanoindentation AFM. Au lieu de sondes colloïdales sphériques micrométriques, nous avons opté pour la sonde en nitrure de silicium PFQNM-LC-A-CAL (Bruker), d'un diamètre de pointe de 140 nm, spécialement conçue pour la cartographie quantitative des propriétés mécaniques d'échantillons biologiques^{78, 79, 80, 81, 82, 83, 84}. Le choix de sondes relativement pointues, comparativement aux sondes colloïdales conventionnelles, s'explique par les caractéristiques structurales du matériau. En comparant la taille de la pointe de la sonde (~140 nm) avec les brosses polymères ramifiées présentes à la surface du CL lehfilcon A (Fig. 3a), on peut conclure que la pointe est suffisamment grande pour entrer en contact direct avec ces structures, ce qui réduit le risque de perforation. Pour illustrer ce point, la Fig. 4 présente une image STEM du CL lehfilcon A et de la pointe de la sonde AFM (à l'échelle).
Schéma montrant une image STEM d'une CL de lehfilcon A et une sonde d'indentation ACM (dessinée à l'échelle).
De plus, la taille de la pointe (140 nm) est suffisamment petite pour éviter tout risque d'extrusion collante, comme cela a été précédemment rapporté pour les brosses polymères produites par la méthode de nanoindentation CP-AFM^69,71. Nous supposons que, du fait de la forme conique-sphérique particulière et de la taille relativement petite de cette pointe AFM (Fig. 1), la courbe de force générée par la nanoindentation du lehfilcon A CL est indépendante de la vitesse d'indentation et de la vitesse de chargement/déchargement. Par conséquent, elle n'est pas affectée par les effets poroélastiques. Pour tester cette hypothèse, des échantillons de lehfilcon A CL ont été indentés à une force maximale fixe à l'aide d'une sonde PFQNM-LC-A-CAL, mais à deux vitesses différentes. Les courbes de force de traction et de rétraction obtenues ont permis de tracer la force (nN) en fonction de la distance (µm), comme illustré sur la figure 5a. Il est clair que les courbes de force lors du chargement et du déchargement se superposent parfaitement, et la figure ne montre aucune preuve tangible que la force de cisaillement à profondeur d'indentation nulle augmente avec la vitesse d'indentation, ce qui suggère que les éléments de la brosse ont été caractérisés sans effet poroélastique. En revanche, des effets de rétention de fluide (extrusion visqueuse et effets de poroélasticité) sont manifestes pour la sonde AFM de 45 µm de diamètre à la même vitesse d'indentation et sont mis en évidence par l'hystérésis entre les courbes d'étirement et de rétraction, comme illustré sur la figure 5b. Ces résultats confirment l'hypothèse et suggèrent que les sondes de 140 nm de diamètre constituent un choix judicieux pour la caractérisation de telles surfaces molles.
Courbes de force d'indentation du lehfilcon A CL obtenues par ACM ; (a) avec une sonde de 140 nm de diamètre à deux vitesses de chargement, démontrant l'absence d'effet poroélastique lors de l'indentation de surface ; (b) avec des sondes de 45 µm et 140 nm de diamètre. Ces courbes montrent les effets de l'extrusion visqueuse et de la poroélasticité pour les grandes sondes par rapport aux petites sondes.
Pour caractériser les surfaces ultra-molles, les méthodes de nanoindentation AFM nécessitent une sonde adaptée à l'étude des propriétés du matériau. Outre la forme et la taille de la pointe, la sensibilité du système de détection AFM, sa sensibilité à la déflexion de la pointe dans l'environnement de test et la rigidité du levier jouent un rôle important dans la précision et la fiabilité des mesures de nanoindentation. Pour notre système AFM, la limite de détection du détecteur sensible à la position (PSD) est d'environ 0,5 mV et est basée sur la raideur du ressort pré-étalonnée et la sensibilité à la déflexion du fluide calculée de la sonde PFQNM-LC-A-CAL, ce qui correspond à la sensibilité théorique à la charge. Cette dernière est inférieure à 0,1 pN. Par conséquent, cette méthode permet la mesure d'une force d'indentation minimale ≤ 0,1 pN sans aucun bruit périphérique. Cependant, il est quasiment impossible pour un système AFM de réduire le bruit périphérique à ce niveau en raison de facteurs tels que les vibrations mécaniques et la dynamique des fluides. Ces facteurs limitent la sensibilité globale de la méthode de nanoindentation AFM et induisent également un bruit de fond d'environ ≤ 10 pN. Pour la caractérisation de surface, des échantillons de lehfilcon A CL et de substrat SiHy ont été indentés en conditions d'hydratation complète à l'aide d'une pointe de 140 nm pour la caractérisation MEB. Les courbes de force obtenues ont été superposées (force [pN] en fonction de la pression). La distance inter-échantillons (µm) est présentée sur la figure 6a. Comparée à celle du substrat de base SiHy, la courbe de force du lehfilcon A CL présente clairement une phase de transition débutant au point de contact avec la brosse polymère ramifiée et se terminant par un changement de pente brutal, marquant le contact de la pointe avec le matériau sous-jacent. Cette partie transitoire de la courbe de force met en évidence le comportement élastique de la brosse polymère ramifiée en surface, comme le montrent la courbe de compression qui suit de près la courbe de tension, ainsi que le contraste des propriétés mécaniques entre la structure de la brosse et le matériau SiHy massif. La séparation de la longueur moyenne d'une brosse polymère ramifiée sur l'image STEM du PCS (Fig. 3a) et de sa courbe de force en abscisse (Fig. 3a) montre que la méthode permet de détecter la pointe et le polymère ramifié atteignant la surface. Contact entre les structures de la brosse. De plus, le fort chevauchement des courbes de force indique l'absence de rétention de liquide. Dans ce cas, il n'y a absolument aucune adhésion entre l'aiguille et la surface de l'échantillon. Les parties supérieures des courbes de force des deux échantillons se chevauchent, reflétant la similarité des propriétés mécaniques des matériaux du substrat.
(a) Courbes de force de nanoindentation AFM pour les substrats CL de lehfilcon A et les substrats SiHy, (b) courbes de force montrant l'estimation du point de contact à l'aide de la méthode de seuil de bruit de fond.
Afin d'étudier plus finement la courbe de force, la courbe de tension de l'échantillon de lehfilcon A CL est représentée à nouveau sur la figure 6b, avec une force maximale de 50 pN en ordonnée. Ce graphique fournit des informations importantes sur le bruit de fond initial. Ce bruit, de l'ordre de ±10 pN, est utilisé pour déterminer avec précision le point de contact et calculer la profondeur d'indentation. Comme indiqué dans la littérature, l'identification des points de contact est cruciale pour évaluer avec précision les propriétés des matériaux, telles que le module d'Young⁸⁵. Une approche impliquant le traitement automatique des données de la courbe de force a démontré une meilleure adéquation entre l'ajustement des données et les mesures quantitatives pour les matériaux souples⁸⁶. Dans ce travail, notre choix de points de contact est relativement simple et objectif, mais il présente des limites. Notre approche prudente pour déterminer le point de contact peut conduire à une légère surestimation des valeurs du module d'Young pour les faibles profondeurs d'indentation (< 100 nm). L'utilisation d'une détection de point de contact basée sur un algorithme et d'un traitement automatisé des données pourrait constituer une piste de recherche future pour améliorer encore notre méthode. Ainsi, pour un bruit de fond intrinsèque de l'ordre de ±10 pN, nous définissons le point de contact comme le premier point de données sur l'axe des abscisses de la figure 6b présentant une valeur ≥10 pN. Ensuite, conformément au seuil de bruit de 10 pN, une ligne verticale à environ 0,27 µm marque le point de contact avec la surface, après quoi la courbe d'étirement se poursuit jusqu'à ce que le substrat atteigne une profondeur d'indentation d'environ 270 nm. Il est intéressant de noter que, compte tenu de la taille des motifs de la brosse polymère ramifiée (300–400 nm) mesurée par imagerie, la profondeur d'indentation de l'échantillon de CL lehfilcon A observée par la méthode du seuil de bruit de fond est d'environ 270 nm, ce qui est très proche de la taille mesurée par STEM. Ces résultats confirment la compatibilité et l'applicabilité de la forme et de la taille de la pointe de la sonde AFM pour l'indentation de cette structure de brosse polymère ramifiée très souple et hautement élastique. Ces données confirment également notre méthode d'utilisation du bruit de fond comme seuil pour la localisation précise des points de contact. Par conséquent, les résultats quantitatifs obtenus par modélisation mathématique et ajustement de la courbe de force devraient être relativement précis.
Les mesures quantitatives par nanoindentation AFM dépendent entièrement des modèles mathématiques utilisés pour la sélection et l'analyse des données. Il est donc essentiel de prendre en compte tous les facteurs liés au choix de l'indenteur, aux propriétés du matériau et à la mécanique de leur interaction avant de choisir un modèle particulier. Dans ce cas précis, la géométrie de la pointe a été caractérisée avec précision à l'aide de micrographies MEB (Fig. 1). D'après les résultats obtenus, la sonde de nanoindentation AFM de 140 nm de diamètre, à pointe sphérique et à cône dur, est un choix judicieux pour la caractérisation d'échantillons de lehfilcon A CL79. L'élasticité du polymère testé constitue un autre facteur important à évaluer avec soin. Bien que les données initiales de nanoindentation (Fig. 5a et 6a) mettent clairement en évidence la superposition des courbes de traction et de compression, c'est-à-dire le retour élastique complet du matériau, il est primordial de confirmer la nature purement élastique des contacts. À cette fin, deux indentations successives ont été réalisées au même endroit sur la surface de l'échantillon de lehfilcon A CL à une vitesse d'indentation de 1 µm/s en conditions d'hydratation complète. Les courbes de force obtenues sont présentées sur la figure 7 et, comme prévu, les courbes d'expansion et de compression des deux empreintes sont quasiment identiques, ce qui souligne la grande élasticité de la structure en brosse polymère ramifiée.
Deux courbes de force d'indentation au même endroit sur la surface de la lentille de contact en lehfilcon A indiquent l'élasticité idéale de la surface de la lentille.
D’après les informations obtenues par microscopie électronique à balayage (MEB) et par microscopie électronique à transmission à balayage (METB) de la pointe de la sonde et de la surface de la couche adhésive de lehfilcon A, le modèle cône-sphère constitue une représentation mathématique pertinente de l’interaction entre la pointe de la sonde AFM et le polymère souple testé. De plus, pour ce modèle, les hypothèses fondamentales concernant les propriétés élastiques du matériau imprimé restent valables pour ce nouveau matériau biomimétique et permettent de quantifier le module d’élasticité.
Après une évaluation complète de la méthode de nanoindentation AFM et de ses composantes, notamment les propriétés de la sonde d'indentation (forme, taille et rigidité du ressort), sa sensibilité (bruit de fond et estimation du point de contact) et les modèles d'ajustement des données (mesures quantitatives du module), la méthode a été utilisée pour caractériser des échantillons ultra-souples disponibles dans le commerce afin de vérifier les résultats quantitatifs. Un hydrogel de polyacrylamide (PAAM) commercial, présentant un module d'élasticité de 1 kPa, a été testé en conditions hydratées à l'aide d'une sonde de 140 nm. Les détails des tests et des calculs de module sont fournis dans les informations supplémentaires. Les résultats ont montré que le module moyen mesuré était de 0,92 kPa, et que le coefficient de variation relatif (%RSD) et l'écart relatif (%) par rapport au module connu étaient inférieurs à 10 %. Ces résultats confirment la précision et la reproductibilité de la méthode de nanoindentation AFM utilisée dans ce travail pour mesurer les modules des matériaux ultra-souples. Les surfaces des échantillons de lehfilcon A CL et du substrat de base SiHy ont été caractérisées par nanoindentation AFM afin d'étudier le module de contact apparent de la surface ultra-souple en fonction de la profondeur d'indentation. Les courbes de force d'indentation ont été générées pour trois échantillons de chaque type (n = 3 ; une indentation par échantillon) à une force de 300 pN, une vitesse de 1 µm/s et une hydratation complète. La courbe de force d'indentation a été approchée par un modèle cône-sphère. Pour obtenir le module en fonction de la profondeur d'indentation, une portion de 40 nm de large de la courbe de force a été définie tous les 20 nm à partir du point de contact, et les valeurs du module ont été mesurées à chaque étape de la courbe de force. (Spin Cy et al.) Une approche similaire a été utilisée pour caractériser le gradient de module des brosses polymères de poly(méthacrylate de lauryle) (P12MA) par nanoindentation à l'aide d'une sonde AFM colloïdale. Les résultats obtenus sont cohérents avec les données du modèle de contact de Hertz. Cette approche permet de tracer le module de contact apparent (kPa) en fonction de la profondeur d'indentation (nm), comme illustré sur la figure 8, qui met en évidence le gradient module de contact apparent/profondeur. Le module d'élasticité calculé de l'échantillon CL lehfilcon A se situe entre 2 et 3 kPa dans les 100 premiers nanomètres de l'échantillon, au-delà duquel il augmente avec la profondeur. En revanche, lors des tests sur le substrat de base SiHy sans film de type brosse en surface, la profondeur d'indentation maximale atteinte pour une force de 300 pN est inférieure à 50 nm, et la valeur du module obtenue est d'environ 400 kPa, comparable à celle du module de Young des matériaux massifs.
Module de contact apparent (kPa) vs. profondeur d'indentation (nm) pour les substrats lehfilcon A CL et SiHy en utilisant la méthode de nanoindentation AFM avec une géométrie cône-sphère pour mesurer le module.
La surface supérieure de la nouvelle structure biomimétique de brosse polymère ramifiée présente un module d'élasticité extrêmement faible (2–3 kPa). Ceci correspond à l'extrémité libre de la brosse polymère fourchue, comme le montre l'image STEM. Bien qu'un gradient de module soit perceptible au bord extérieur de la couche catalytique, le substrat principal, à module élevé, est prépondérant. Cependant, les 100 nm supérieurs de la surface représentent moins de 20 % de la longueur totale de la brosse polymère ramifiée. Il est donc raisonnable de supposer que les valeurs mesurées du module dans cette gamme de profondeur d'indentation sont relativement précises et peu influencées par le substrat.
Du fait de la conception biomimétique unique des lentilles de contact en lehfilcon A, constituées de structures de polymère PMPC ramifiées greffées sur la surface de substrats en SiHy, il est très difficile de caractériser avec précision les propriétés mécaniques de leurs structures de surface à l'aide des méthodes de mesure traditionnelles. Nous présentons ici une méthode de nanoindentation AFM avancée permettant de caractériser avec précision des matériaux ultra-souples tels que le lehfilcon A, caractérisés par une forte teneur en eau et une élasticité extrêmement élevée. Cette méthode repose sur l'utilisation d'une sonde AFM dont la taille et la géométrie de la pointe sont soigneusement choisies pour correspondre aux dimensions structurales des motifs de surface ultra-souples à imprimer. Cette combinaison de dimensions entre la sonde et la structure offre une sensibilité accrue, permettant de mesurer le faible module d'élasticité et les propriétés élastiques intrinsèques des éléments de polymère ramifiés, indépendamment des effets poroélastiques. Les résultats ont montré que les polymères PMPC ramifiés, caractéristiques de la surface de la lentille, présentaient un module d'élasticité extrêmement faible (jusqu'à 2 kPa) et une élasticité très élevée (près de 100 %) en milieu aqueux. Les résultats de la nanoindentation AFM nous ont également permis de caractériser le gradient apparent du module de contact en fonction de la profondeur (30 kPa/200 nm) de la surface de la lentille biomimétique. Ce gradient pourrait être dû à la différence de module entre les brosses polymères ramifiées et le substrat SiHy, à la structure/densité ramifiée des brosses polymères, ou à une combinaison de ces facteurs. Toutefois, des études plus approfondies sont nécessaires pour comprendre pleinement la relation entre la structure et les propriétés, notamment l'effet de la ramification des brosses sur les propriétés mécaniques. Des mesures similaires peuvent contribuer à caractériser les propriétés mécaniques de la surface d'autres matériaux ultra-souples et dispositifs médicaux.
Les jeux de données générés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès des auteurs respectifs sur demande raisonnable.
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