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Con el desarrollo de nuevos materiales ultrablandos para dispositivos médicos y aplicaciones biomédicas, la caracterización integral de sus propiedades físicas y mecánicas es importante y desafiante. Se aplicó una técnica de nanoindentación con microscopía de fuerza atómica (AFM) modificada para caracterizar el módulo superficial extremadamente bajo de la nueva lente de contacto de hidrogel de silicona biomimética lehfilcon A, recubierta con una capa de estructuras de cepillo de polímero ramificado. Este método permite la determinación precisa de los puntos de contacto sin los efectos de la extrusión viscosa al acercarse a polímeros ramificados. Además, permite determinar las características mecánicas de cada elemento del cepillo sin el efecto de la poroelasticidad. Esto se logra seleccionando una sonda AFM con un diseño (tamaño de la punta, geometría y rigidez elástica) especialmente adecuado para medir las propiedades de materiales blandos y muestras biológicas. Este método mejora la sensibilidad y la precisión para una medición precisa del material muy blando lehfilcon A, que presenta un módulo de elasticidad superficial extremadamente bajo (hasta 2 kPa) y una elasticidad extremadamente alta en el entorno interno acuoso (casi 100%). Los resultados del estudio de superficie no solo revelaron las propiedades ultrasuaves de la lente lehfilcon A, sino que también mostraron que el módulo de los cepillos de polímero ramificado era comparable al del sustrato de silicio-hidrógeno. Esta técnica de caracterización de superficie puede aplicarse a otros materiales ultrasuaves y dispositivos médicos.
Las propiedades mecánicas de los materiales diseñados para el contacto directo con tejido vivo suelen estar determinadas por el entorno biológico. La perfecta correspondencia de estas propiedades permite alcanzar las características clínicas deseadas sin causar reacciones celulares adversas1,2,3. En el caso de materiales homogéneos a granel, la caracterización de las propiedades mecánicas es relativamente sencilla gracias a la disponibilidad de procedimientos y métodos de ensayo estándar (p. ej., microindentación4,5,6). Sin embargo, en el caso de materiales ultrablandos como geles, hidrogeles, biopolímeros, células vivas, etc., estos métodos de ensayo no suelen ser aplicables debido a las limitaciones de resolución de la medición y a la falta de homogeneidad de algunos materiales7. Con el paso de los años, los métodos tradicionales de indentación se han modificado y adaptado para caracterizar una amplia gama de materiales blandos, pero muchos de ellos aún presentan graves deficiencias que limitan su uso8,9,10,11,12,13. La falta de métodos de ensayo especializados que puedan caracterizar con precisión y fiabilidad las propiedades mecánicas de los materiales superblandos y las capas superficiales limita considerablemente su uso en diversas aplicaciones.
En nuestro trabajo previo, presentamos la lente de contacto lehfilcon A (CL), un material blando heterogéneo con propiedades superficiales ultrasuaves derivadas de diseños potencialmente biomiméticos inspirados en la superficie de la córnea. Este biomaterial se desarrolló mediante el injerto de una capa polimérica reticulada y ramificada de poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) sobre un hidrogel de silicona (SiHy) 15, diseñado para dispositivos médicos. Este proceso de injerto crea una capa superficial compuesta por una estructura polimérica ramificada en cepillo, muy suave y altamente elástica. Nuestro trabajo previo ha confirmado que la estructura biomimética de lehfilcon A CL proporciona propiedades superficiales superiores, como una mejor prevención de la humectación y la formación de incrustaciones, mayor lubricidad y menor adhesión celular y bacteriana15,16. Además, el uso y desarrollo de este material biomimético también sugiere una mayor expansión a otros dispositivos biomédicos. Por lo tanto, es fundamental caracterizar las propiedades superficiales de este material ultrablando y comprender su interacción mecánica con el ojo para crear una base de conocimiento integral que respalde futuros desarrollos y aplicaciones. La mayoría de las lentes de contacto de SiHy disponibles comercialmente están compuestas por una mezcla homogénea de polímeros hidrófilos e hidrófobos que forman una estructura material uniforme17. Se han realizado varios estudios para investigar sus propiedades mecánicas mediante métodos tradicionales de compresión, tracción y microindentación18,19,20,21. Sin embargo, el novedoso diseño biomimético de lehfilcon A CL lo convierte en un material heterogéneo único en el que las propiedades mecánicas de las estructuras de cepillo de polímero ramificado difieren significativamente de las del sustrato base de SiHy. Por lo tanto, es muy difícil cuantificar con precisión estas propiedades mediante métodos convencionales y de indentación. Un método prometedor utiliza el método de nanoindentación implementado en la microscopía de fuerza atómica (AFM), un método que se ha utilizado para determinar las propiedades mecánicas de materiales viscoelásticos blandos, como células y tejidos biológicos, así como polímeros blandos22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. En la nanoindentación AFM, los fundamentos de las pruebas de nanoindentación se combinan con los últimos avances en tecnología AFM para proporcionar una mayor sensibilidad de medición y la posibilidad de realizar pruebas en una amplia gama de materiales inherentemente superblandos31,32,33,34,35,36. Además, esta tecnología ofrece otras ventajas importantes gracias al uso de diferentes geometrías de indentador y sonda, y la posibilidad de realizar pruebas en diversos medios líquidos.
La nanoindentación AFM se puede dividir condicionalmente en tres componentes principales: (1) equipo (sensores, detectores, sondas, etc.); (2) parámetros de medición (como fuerza, desplazamiento, velocidad, tamaño de rampa, etc.); (3) Procesamiento de datos (corrección de línea base, estimación del punto de contacto, ajuste de datos, modelado, etc.). Un problema significativo con este método es que varios estudios en la literatura que utilizan nanoindentación AFM informan resultados cuantitativos muy diferentes para el mismo tipo de muestra/celda/material37,38,39,40,41. Por ejemplo, Lekka et al. Se estudió y comparó la influencia de la geometría de la sonda AFM en el módulo de Young medido de muestras de hidrogel mecánicamente homogéneo y células heterogéneas. Informan que los valores del módulo dependen en gran medida de la selección del voladizo y la forma de la punta, con el valor más alto para una sonda con forma de pirámide y el valor más bajo de 42 para una sonda esférica. De manera similar, Selhuber-Unkel et al. Se ha demostrado cómo la velocidad, el tamaño y el grosor del indentador en muestras de poliacrilamida (PAAM) afectan el módulo de Young medido mediante nanoindentación con ACM43. Otro factor que complica el estudio es la falta de materiales de prueba estándar para módulos extremadamente bajos y de procedimientos de prueba gratuitos. Esto dificulta la obtención de resultados precisos y confiables. Sin embargo, el método es muy útil para mediciones relativas y evaluaciones comparativas entre tipos de muestras similares; por ejemplo, mediante nanoindentación con AFM para distinguir células normales de células cancerosas 44, 45.
Al probar materiales blandos con nanoindentación AFM, una regla general es usar una sonda con una constante elástica baja (k) que coincida estrechamente con el módulo de la muestra y una punta hemisférica/redonda para que la primera sonda no perfore las superficies de la muestra en el primer contacto con materiales blandos. También es importante que la señal de deflexión generada por la sonda sea lo suficientemente fuerte como para ser detectada por el sistema detector láser24,34,46,47. En el caso de células, tejidos y geles heterogéneos ultrablandos, otro desafío es superar la fuerza adhesiva entre la sonda y la superficie de la muestra para garantizar mediciones reproducibles y confiables48,49,50. Hasta hace poco, la mayor parte del trabajo sobre nanoindentación AFM se ha centrado en el estudio del comportamiento mecánico de células biológicas, tejidos, geles, hidrogeles y biomoléculas utilizando sondas esféricas relativamente grandes, comúnmente conocidas como sondas coloidales (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Estas puntas tienen un radio de 1 a 50 µm y comúnmente están hechas de vidrio de borosilicato, polimetilmetacrilato (PMMA), poliestireno (PS), dióxido de silicio (SiO2) y carbono tipo diamante (DLC). Aunque la nanoindentación CP-AFM es a menudo la primera opción para la caracterización de muestras blandas, tiene sus propios problemas y limitaciones. El uso de puntas esféricas grandes de tamaño micrométrico aumenta el área de contacto total de la punta con la muestra y da como resultado una pérdida significativa de resolución espacial. Para muestras blandas y no homogéneas, donde las propiedades mecánicas de los elementos locales pueden diferir significativamente del promedio en un área más amplia, la indentación CP puede ocultar cualquier falta de homogeneidad en las propiedades a escala local52. Las sondas coloidales generalmente se fabrican uniendo esferas coloidales de tamaño micrométrico a voladizos sin punta usando adhesivos epóxicos. El proceso de fabricación en sí mismo presenta numerosos problemas y puede generar inconsistencias en la calibración de la sonda. Además, el tamaño y la masa de las partículas coloidales afectan directamente los principales parámetros de calibración del voladizo, como la frecuencia de resonancia, la rigidez del resorte y la sensibilidad a la deflexión56,57,58. Por lo tanto, los métodos comúnmente utilizados para las sondas AFM convencionales, como la calibración de temperatura, pueden no proporcionar una calibración precisa para CP, y podrían requerirse otros métodos para realizar estas correcciones57, 59, 60, 61. Los experimentos típicos de indentación de CP utilizan voladizos con grandes desviaciones para estudiar las propiedades de muestras blandas, lo que genera otro problema al calibrar el comportamiento no lineal del voladizo con desviaciones relativamente grandes62,63,64. Los métodos modernos de indentación de sondas coloidales generalmente consideran la geometría del voladizo utilizado para calibrar la sonda, pero ignoran la influencia de las partículas coloidales, lo que genera incertidumbre adicional en la precisión del método38,61. De manera similar, los módulos elásticos calculados mediante el ajuste del modelo de contacto dependen directamente de la geometría de la sonda de indentación, y la discrepancia entre las características de la punta y la superficie de la muestra puede generar imprecisiones27, 65, 66, 67, 68. Se destacan algunos trabajos recientes de Spencer et al. sobre los factores que deben tenerse en cuenta al caracterizar cepillos de polímero blando mediante el método de nanoindentación CP-AFM. Informaron que la retención de un fluido viscoso en cepillos de polímero en función de la velocidad resulta en un aumento de la carga en el cabezal y, por lo tanto, en diferentes mediciones de las propiedades dependientes de la velocidad30,69,70,71.
En este estudio, caracterizamos el módulo superficial del material ultrablando y altamente elástico lehfilcon A CL mediante un método de nanoindentación AFM modificado. Dadas las propiedades y la nueva estructura de este material, el rango de sensibilidad del método de indentación tradicional es claramente insuficiente para caracterizar el módulo de este material extremadamente blando, por lo que es necesario utilizar un método de nanoindentación AFM con mayor y menor sensibilidad. Tras revisar las deficiencias y los problemas de las técnicas existentes de nanoindentación con sonda AFM coloidal, mostramos por qué elegimos una sonda AFM más pequeña y diseñada a medida para eliminar la sensibilidad, el ruido de fondo, localizar el punto de contacto, medir el módulo de velocidad de materiales blandos heterogéneos, como la dependencia de la retención de fluidos, y lograr una cuantificación precisa. Además, pudimos medir con precisión la forma y las dimensiones de la punta de indentación, lo que nos permitió utilizar el modelo de ajuste cono-esfera para determinar el módulo de elasticidad sin evaluar el área de contacto de la punta con el material. Las dos suposiciones implícitas que se cuantifican en este trabajo son las propiedades completamente elásticas del material y el módulo de indentación independiente de la profundidad. Con este método, primero probamos estándares ultrablandos con un módulo conocido para cuantificarlo y, posteriormente, lo empleamos para caracterizar las superficies de dos materiales diferentes para lentes de contacto. Se espera que este método de caracterización de superficies de nanoindentación AFM con mayor sensibilidad sea aplicable a una amplia gama de materiales ultrablandos heterogéneos biomiméticos con potencial para su uso en dispositivos médicos y aplicaciones biomédicas.
Se eligieron lentes de contacto Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EE. UU.) y sus sustratos de hidrogel de silicona para experimentos de nanoindentación. Se utilizó una montura de lente especialmente diseñada. Para instalar la lente para la prueba, se colocó cuidadosamente en el soporte en forma de cúpula, asegurándose de que no entraran burbujas de aire, y luego se fijó con los bordes. Un orificio en el accesorio en la parte superior del soporte de la lente proporciona acceso al centro óptico de la lente para experimentos de nanoindentación mientras mantiene el líquido en su lugar. Esto mantiene las lentes completamente hidratadas. Se utilizaron 500 μl de solución de envasado de lentes de contacto como solución de prueba. Para verificar los resultados cuantitativos, se prepararon hidrogeles de poliacrilamida (PAAM) no activados disponibles comercialmente a partir de una composición de poliacrilamida-co-metilen-bisacrilamida (placas Petrisoft Petri de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EE. UU.), un módulo elástico conocido de 1 kPa. Utilice de 4 a 5 gotas (aproximadamente 125 µl) de solución salina tamponada con fosfato (PBS de Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EE. UU.) y 1 gota de solución para lentes de contacto OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EE. UU.) en la interfaz de la sonda de hidrogel AFM.
Se visualizaron muestras de sustratos Lehfilcon A CL y SiHy mediante un microscopio electrónico de barrido por emisión de campo (FEG SEM) FEI Quanta 250 equipado con un detector de microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM). Para preparar las muestras, las lentes se lavaron primero con agua y se cortaron en cuñas con forma de pastel. Para lograr un contraste diferencial entre los componentes hidrófilos e hidrófobos de las muestras, se utilizó una solución estabilizada de RuO₄ al 0,10 % como colorante, en la que las muestras se sumergieron durante 30 minutos. La tinción con RuO₄ de Lehfilcon A CL es importante no solo para lograr un mejor contraste diferencial, sino que también ayuda a preservar la estructura de los cepillos de polímero ramificado en su forma original, que luego son visibles en las imágenes STEM. Posteriormente, se lavaron y deshidrataron en una serie de mezclas de etanol/agua con concentración creciente de etanol. Las muestras se moldearon con epoxi EMBed 812/Araldite, que curó durante la noche a 70 °C. Los bloques de muestra obtenidos mediante polimerización de resina se cortaron con un ultramicrótomo y las secciones delgadas resultantes se visualizaron con un detector STEM en modo de bajo vacío a un voltaje de aceleración de 30 kV. El mismo sistema SEM se utilizó para la caracterización detallada de la sonda de AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Bárbara, CA, EE. UU.). Las imágenes SEM de la sonda de AFM se obtuvieron en un modo típico de alto vacío con un voltaje de aceleración de 30 kV. Adquiera imágenes a diferentes ángulos y aumentos para registrar todos los detalles de la forma y el tamaño de la punta de la sonda de AFM. Todas las dimensiones de interés de la punta en las imágenes se midieron digitalmente.
Se utilizó un microscopio de fuerza atómica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Bárbara, CA, EE. UU.) con el modo "PeakForce QNM en Fluido" para visualizar y nanoindentar muestras de lehfilcon A CL, sustrato de SiHy y hidrogel de PAAm. Para los experimentos de imagen, se utilizó una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) con un radio nominal de punta de 1 nm para capturar imágenes de alta resolución de la muestra a una velocidad de barrido de 0,50 Hz. Todas las imágenes se obtuvieron en solución acuosa.
Los experimentos de nanoindentación AFM se llevaron a cabo utilizando una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). La sonda AFM tiene una punta de silicio en un cantilever de nitruro de 345 nm de espesor, 54 µm de largo y 4,5 µm de ancho con una frecuencia de resonancia de 45 kHz. Está diseñada específicamente para caracterizar y realizar mediciones nanomecánicas cuantitativas en muestras biológicas blandas. Los sensores se calibran individualmente en fábrica con ajustes de resorte precalibrados. Las constantes de resorte de las sondas utilizadas en este estudio estuvieron en el rango de 0,05–0,1 N/m. Para determinar con precisión la forma y el tamaño de la punta, la sonda se caracterizó en detalle utilizando SEM. En la fig. La figura 1a muestra una micrografía electrónica de barrido de alta resolución y bajo aumento de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que proporciona una visión holística del diseño de la sonda. En la fig. La Fig. 1b muestra una vista ampliada de la parte superior de la punta de la sonda, que proporciona información sobre su forma y tamaño. En el extremo, la aguja es una semiesfera de aproximadamente 140 nm de diámetro (Fig. 1c). Por debajo, la punta se estrecha hasta adoptar una forma cónica, alcanzando una longitud medida de aproximadamente 500 nm. Fuera de la región cónica, la punta es cilíndrica y termina en una longitud total de 1,18 µm. Esta es la principal parte funcional de la punta de la sonda. Además, se utilizó una sonda esférica grande de poliestireno (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EE. UU.) con un diámetro de punta de 45 µm y una constante elástica de 2 N/m para las pruebas como sonda coloidal. Se comparó con la sonda PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm para comparación.
Se ha informado que el líquido puede quedar atrapado entre la sonda AFM y la estructura del cepillo de polímero durante la nanoindentación, lo que ejercerá una fuerza ascendente sobre la sonda AFM antes de que toque la superficie69. Este efecto de extrusión viscosa debido a la retención de fluido puede cambiar el punto de contacto aparente, afectando así las mediciones del módulo superficial. Para estudiar el efecto de la geometría de la sonda y la velocidad de indentación en la retención de fluido, se trazaron curvas de fuerza de indentación para muestras de lehfilcon A CL utilizando una sonda de 140 nm de diámetro a velocidades de desplazamiento constantes de 1 µm/s y 2 µm/s. Diámetro de la sonda 45 µm, ajuste de fuerza fijo 6 nN logrado a 1 µm/s. Los experimentos con una sonda de 140 nm de diámetro se llevaron a cabo a una velocidad de indentación de 1 µm/s y una fuerza establecida de 300 pN, elegida para crear una presión de contacto dentro del rango fisiológico (1–8 kPa) del párpado superior. Presión 72. Se probaron muestras blandas preparadas de hidrogel de PAA con una presión de 1 kPa para una fuerza de indentación de 50 pN a una velocidad de 1 μm/s utilizando una sonda con un diámetro de 140 nm.
Dado que la longitud de la parte cónica de la punta de la sonda PFQNM-LC-A-CAL es de aproximadamente 500 nm, para cualquier profundidad de indentación < 500 nm, se puede asumir con seguridad que la geometría de la sonda durante la indentación se mantendrá fiel a su forma cónica. Además, se supone que la superficie del material en prueba exhibirá una respuesta elástica reversible, lo cual también se confirmará en las siguientes secciones. Por lo tanto, dependiendo de la forma y el tamaño de la punta, elegimos el modelo de ajuste cono-esfera desarrollado por Briscoe, Sebastian y Adams, disponible en el software del proveedor, para procesar nuestros experimentos de nanoindentación AFM (NanoScope). Software de análisis de datos de separación, Bruker) 73. El modelo describe la relación fuerza-desplazamiento F(δ) para un cono con un defecto esférico en el ápice. En la fig. La Figura 2 muestra la geometría de contacto durante la interacción de un cono rígido con una punta esférica. R es el radio de la punta esférica, a es el radio de contacto, b es el radio de contacto en el extremo de la punta esférica, δ es el radio de contacto y la profundidad de indentación, y θ es el semiángulo del cono. La imagen de SEM de esta sonda muestra claramente que la punta esférica de 140 nm de diámetro se fusiona tangencialmente en un cono, por lo que b se define únicamente mediante R, es decir, b = R cos θ. El software proporcionado por el proveedor proporciona una relación cono-esfera para calcular los valores del módulo de Young (E) a partir de los datos de separación de fuerzas, suponiendo que a > b. Relación:
Donde F es la fuerza de indentación, E es el módulo de Young y ν es el coeficiente de Poisson. El radio de contacto a se puede estimar mediante:
Esquema de la geometría de contacto de un cono rígido con punta esférica prensado en el material de una lente de contacto Lefilcon con una capa superficial de cepillos de polímero ramificados.
Si a ≤ b, la relación se reduce a la ecuación para un penetrador esférico convencional;
Creemos que la interacción de la sonda de indentación con la estructura ramificada del cepillo de polímero de PMPC hará que el radio de contacto a sea mayor que el radio de contacto esférico b. Por lo tanto, para todas las mediciones cuantitativas del módulo elástico realizadas en este estudio, utilizamos la dependencia obtenida para el caso a > b.
Los materiales biomiméticos ultrasuaves estudiados en este estudio se obtuvieron imágenes exhaustivas mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) de la sección transversal de la muestra y microscopía de fuerza atómica (AFM) de la superficie. Esta caracterización detallada de la superficie se realizó como una extensión de nuestro trabajo publicado anteriormente, en el que determinamos que la estructura de cepillo polimérico ramificada dinámicamente de la superficie lehfilcon A CL modificada con PMPC exhibió propiedades mecánicas similares al tejido corneal nativo 14 . Por esta razón, nos referimos a las superficies de lentes de contacto como materiales biomiméticos14. En la fig. 3a,b se muestran secciones transversales de estructuras de cepillo de polímero PMPC ramificadas en la superficie de un sustrato lehfilcon A CL y un sustrato SiHy sin tratar, respectivamente. Las superficies de ambas muestras se analizaron más a fondo utilizando imágenes AFM de alta resolución, que confirmaron aún más los resultados del análisis STEM (Fig. 3c, d). En conjunto, estas imágenes ofrecen una longitud aproximada de la estructura de cepillo de polímero ramificado de PMPC a 300-400 nm, lo cual es crucial para la interpretación de las mediciones de nanoindentación por AFM. Otra observación clave derivada de las imágenes es que la estructura superficial general del material biomimético CL es morfológicamente diferente a la del sustrato de SiHy. Esta diferencia en la morfología superficial puede apreciarse durante la interacción mecánica con la sonda de indentación por AFM y, posteriormente, en los valores del módulo medidos.
Imágenes STEM transversales de (a) Lehfilcon A CL y (b) sustrato de SiHy. Escala: 500 nm. Imágenes AFM de la superficie del sustrato de Lehfilcon A CL (c) y del sustrato de SiHy base (d) (3 µm × 3 µm).
Los polímeros bioinspirados y las estructuras de cepillo de polímero son inherentemente blandos y se han estudiado y utilizado ampliamente en diversas aplicaciones biomédicas74,75,76,77. Por lo tanto, es importante utilizar el método de nanoindentación AFM, que permite medir sus propiedades mecánicas con precisión y fiabilidad. Sin embargo, las propiedades únicas de estos materiales ultrablandos, como su módulo elástico extremadamente bajo, su alto contenido de líquido y su alta elasticidad, a menudo dificultan la elección del material, la forma y el tamaño adecuados de la sonda de indentación. Esto es importante para evitar que el indentador perfore la superficie blanda de la muestra, lo que provocaría errores en la determinación del punto y el área de contacto con la superficie.
Para ello, es fundamental comprender a fondo la morfología de los materiales biomiméticos ultrablandos (lehfilcon A CL). La información sobre el tamaño y la estructura de los cepillos de polímero ramificado, obtenida mediante el método de imagen, proporciona la base para la caracterización mecánica de la superficie mediante técnicas de nanoindentación AFM. En lugar de sondas coloidales esféricas de tamaño micrométrico, elegimos la sonda de nitruro de silicio PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) con un diámetro de punta de 140 nm, especialmente diseñada para el mapeo cuantitativo de las propiedades mecánicas de muestras biológicas 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. La justificación del uso de sondas relativamente afiladas en comparación con las sondas coloidales convencionales se debe a las características estructurales del material. Al comparar el tamaño de la punta de la sonda (~140 nm) con los cepillos de polímero ramificados en la superficie del CL lehfilcon A, como se muestra en la Fig. 3a, se puede concluir que la punta es lo suficientemente grande como para entrar en contacto directo con estas estructuras de cepillo, lo que reduce la posibilidad de que la punta las atraviese. Para ilustrar este punto, en la Fig. 4 se muestra una imagen STEM del CL lehfilcon A y la punta de indentación de la sonda AFM (dibujada a escala).
Esquema que muestra la imagen STEM de lehfilcon A CL y una sonda de indentación ACM (dibujada a escala).
Además, el tamaño de la punta de 140 nm es lo suficientemente pequeño como para evitar el riesgo de cualquiera de los efectos de extrusión pegajosa informados previamente para cepillos de polímero producidos por el método de nanoindentación CP-AFM69,71. Suponemos que debido a la forma cónica-esférica especial y al tamaño relativamente pequeño de esta punta de AFM (Fig. 1), la naturaleza de la curva de fuerza generada por la nanoindentación de lehfilcon A CL no dependerá de la velocidad de indentación ni de la velocidad de carga/descarga. Por lo tanto, no se ve afectada por los efectos poroelásticos. Para probar esta hipótesis, las muestras de lehfilcon A CL se indentaron a una fuerza máxima fija utilizando una sonda PFQNM-LC-A-CAL, pero a dos velocidades diferentes, y las curvas de fuerza de tracción y retracción resultantes se utilizaron para representar gráficamente la fuerza (nN) en la separación (µm) que se muestra en la Figura 5a. Es evidente que las curvas de fuerza durante la carga y la descarga se superponen completamente, y no existe evidencia clara de que la fuerza de cizallamiento a profundidad de indentación cero aumente con la velocidad de indentación en la figura, lo que sugiere que los elementos individuales del cepillo se caracterizaron sin efecto poroelástico. Por el contrario, los efectos de retención de fluidos (extrusión viscosa y poroelasticidad) son evidentes para la sonda AFM de 45 µm de diámetro a la misma velocidad de indentación, y se destacan por la histéresis entre las curvas de estiramiento y retracción, como se muestra en la Figura 5b. Estos resultados respaldan la hipótesis y sugieren que las sondas de 140 nm de diámetro son una buena opción para caracterizar estas superficies blandas.
Curvas de fuerza de indentación de lehfilcon A CL usando ACM; (a) usando una sonda con un diámetro de 140 nm a dos velocidades de carga, lo que demuestra la ausencia de un efecto poroelástico durante la indentación de la superficie; (b) usando sondas con un diámetro de 45 µm y 140 nm. s muestra los efectos de la extrusión viscosa y la poroelasticidad para sondas grandes en comparación con sondas más pequeñas.
Para caracterizar superficies ultrablandas, los métodos de nanoindentación AFM requieren la mejor sonda para estudiar las propiedades del material en estudio. Además de la forma y el tamaño de la punta, la sensibilidad del sistema detector AFM, la sensibilidad a la deflexión de la punta en el entorno de prueba y la rigidez del voladizo desempeñan un papel importante en la determinación de la precisión y la fiabilidad de las mediciones de nanoindentación. Para nuestro sistema AFM, el límite de detección del detector sensible a la posición (PSD) es de aproximadamente 0,5 mV y se basa en la tasa de resorte precalibrada y la sensibilidad calculada a la deflexión del fluido de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que corresponde a la sensibilidad de carga teórica. es inferior a 0,1 pN. Por lo tanto, este método permite la medición de una fuerza de indentación mínima ≤ 0,1 pN sin ningún componente de ruido periférico. Sin embargo, es casi imposible para un sistema AFM reducir el ruido periférico a este nivel debido a factores como la vibración mecánica y la dinámica de fluidos. Estos factores limitan la sensibilidad general del método de nanoindentación AFM y también resultan en una señal de ruido de fondo de aproximadamente ≤ 10 pN. Para la caracterización de la superficie, las muestras de sustrato lehfilcon A CL y SiHy se indentaron en condiciones completamente hidratadas utilizando una sonda de 140 nm para la caracterización SEM, y las curvas de fuerza resultantes se superpusieron entre la fuerza (pN) y la presión. El gráfico de separación (µm) se muestra en la Figura 6a. En comparación con el sustrato base SiHy, la curva de fuerza lehfilcon A CL muestra claramente una fase de transición que comienza en el punto de contacto con el cepillo de polímero bifurcado y termina con un cambio brusco en la pendiente que marca el contacto de la punta con el material subyacente. Esta parte de transición de la curva de fuerza resalta el comportamiento verdaderamente elástico del cepillo de polímero ramificado en la superficie, como lo evidencia la curva de compresión que sigue de cerca la curva de tensión y el contraste en las propiedades mecánicas entre la estructura del cepillo y el material voluminoso SiHy. Al comparar lefilcon. La separación de la longitud promedio de un cepillo de polímero ramificado en la imagen STEM del PCS (Fig. 3a) y su curva de fuerza a lo largo de la abscisa en la Fig. 3a.6a muestra que el método detecta la punta y el polímero ramificado alcanzando la parte superior de la superficie. Se observa contacto entre las estructuras del cepillo. Además, la estrecha superposición de las curvas de fuerza indica la ausencia de retención de líquido. En este caso, no existe adhesión alguna entre la aguja y la superficie de la muestra. Las secciones superiores de las curvas de fuerza de ambas muestras se superponen, lo que refleja la similitud de las propiedades mecánicas de los materiales del sustrato.
(a) Curvas de fuerza de nanoindentación AFM para sustratos lehfilcon A CL y sustratos SiHy, (b) curvas de fuerza que muestran la estimación del punto de contacto utilizando el método de umbral de ruido de fondo.
Para estudiar los detalles más finos de la curva de fuerza, la curva de tensión de la muestra de lehfilcon A CL se vuelve a representar en la Fig. 6b con una fuerza máxima de 50 pN a lo largo del eje y. Este gráfico proporciona información importante sobre el ruido de fondo original. El ruido se encuentra en el rango de ±10 pN, lo cual se utiliza para determinar con precisión el punto de contacto y calcular la profundidad de indentación. Como se describe en la literatura, la identificación de los puntos de contacto es crucial para evaluar con precisión las propiedades del material, como el módulo85. Un enfoque que implica el procesamiento automático de los datos de la curva de fuerza ha demostrado una mejor adecuación entre el ajuste de datos y las mediciones cuantitativas para materiales blandos86. En este trabajo, nuestra elección de los puntos de contacto es relativamente simple y objetiva, pero tiene sus limitaciones. Nuestro enfoque conservador para determinar el punto de contacto puede resultar en valores de módulo ligeramente sobreestimados para profundidades de indentación menores (<100 nm). El uso de la detección de puntos de contacto basada en algoritmos y el procesamiento automatizado de datos podría ser una continuación de este trabajo en el futuro para mejorar aún más nuestro método. Por lo tanto, para el ruido de fondo intrínseco en el orden de ±10 pN, definimos el punto de contacto como el primer punto de datos en el eje x en la Figura 6b con un valor de ≥10 pN. Luego, de acuerdo con el umbral de ruido de 10 pN, una línea vertical en el nivel de ~0,27 µm marca el punto de contacto con la superficie, después de lo cual la curva de estiramiento continúa hasta que el sustrato encuentra la profundidad de indentación de ~270 nm. Curiosamente, con base en el tamaño de las características del cepillo de polímero ramificado (300-400 nm) medidas usando el método de imagen, la profundidad de indentación de la muestra CL lehfilcon A observada usando el método de umbral de ruido de fondo es de aproximadamente 270 nm, que es muy cercano al tamaño de medición con STEM. Estos resultados confirman además la compatibilidad y aplicabilidad de la forma y el tamaño de la punta de la sonda AFM para la indentación de esta estructura de cepillo de polímero ramificado muy suave y altamente elástica. Estos datos también proporcionan evidencia sólida que respalda nuestro método de utilizar el ruido de fondo como umbral para identificar los puntos de contacto. Por lo tanto, cualquier resultado cuantitativo obtenido mediante el modelado matemático y el ajuste de la curva de fuerza debería ser relativamente preciso.
Las mediciones cuantitativas mediante métodos de nanoindentación AFM dependen completamente de los modelos matemáticos utilizados para la selección de datos y el análisis posterior. Por lo tanto, es importante considerar todos los factores relacionados con la elección del indentador, las propiedades del material y la mecánica de su interacción antes de elegir un modelo en particular. En este caso, la geometría de la punta se caracterizó cuidadosamente mediante micrografías SEM (Fig. 1), y con base en los resultados, la sonda de nanoindentación AFM de 140 nm de diámetro con un cono duro y geometría de punta esférica es una buena opción para caracterizar muestras de lehfilcon A CL79. Otro factor importante que debe evaluarse cuidadosamente es la elasticidad del material polimérico que se está probando. Si bien los datos iniciales de nanoindentación (Figs. 5a y 6a) describen claramente las características de la superposición de las curvas de tensión y compresión, es decir, la recuperación elástica completa del material, es extremadamente importante confirmar la naturaleza puramente elástica de los contactos. Para ello, se realizaron dos indentaciones sucesivas en la misma ubicación de la superficie de la muestra de lehfilcon A CL a una velocidad de indentación de 1 µm/s en condiciones de hidratación completa. Los datos de la curva de fuerza resultante se muestran en la figura 7 y, como era de esperar, las curvas de expansión y compresión de ambas impresiones son prácticamente idénticas, lo que pone de relieve la alta elasticidad de la estructura ramificada del cepillo de polímero.
Dos curvas de fuerza de indentación en la misma ubicación en la superficie de lehfilcon A CL indican la elasticidad ideal de la superficie de la lente.
Basado en la información obtenida de imágenes SEM y STEM de la punta de la sonda y la superficie del lehfilcon A CL, respectivamente, el modelo cono-esfera constituye una representación matemática razonable de la interacción entre la punta de la sonda AFM y el material polimérico blando en prueba. Además, para este modelo cono-esfera, las suposiciones fundamentales sobre las propiedades elásticas del material impreso se cumplen para este nuevo material biomimético y se utilizan para cuantificar el módulo elástico.
Después de una evaluación exhaustiva del método de nanoindentación AFM y sus componentes, incluyendo las propiedades de la sonda de indentación (forma, tamaño y rigidez del resorte), la sensibilidad (ruido de fondo y estimación del punto de contacto) y los modelos de ajuste de datos (mediciones cuantitativas del módulo), se utilizó el método. caracterizar muestras ultrablandas disponibles comercialmente para verificar los resultados cuantitativos. Un hidrogel de poliacrilamida (PAAM) comercial con un módulo elástico de 1 kPa se probó en condiciones hidratadas utilizando una sonda de 140 nm. Los detalles de las pruebas y cálculos del módulo se proporcionan en la Información complementaria. Los resultados mostraron que el módulo promedio medido fue de 0,92 kPa, y el %RSD y la desviación porcentual (%) del módulo conocido fueron inferiores al 10%. Estos resultados confirman la precisión y reproducibilidad del método de nanoindentación AFM utilizado en este trabajo para medir los módulos de materiales ultrablandos. Las superficies de las muestras de lehfilcon A CL y el sustrato base SiHy se caracterizaron aún más utilizando el mismo método de nanoindentación AFM para estudiar el módulo de contacto aparente de la superficie ultrasuave en función de la profundidad de indentación. Se generaron curvas de separación de la fuerza de indentación para tres muestras de cada tipo (n = 3; una indentación por muestra) a una fuerza de 300 pN, una velocidad de 1 µm/s e hidratación completa. La curva de reparto de la fuerza de indentación se aproximó utilizando un modelo de cono-esfera. Para obtener el módulo dependiente de la profundidad de indentación, se estableció una porción de 40 nm de ancho de la curva de fuerza en cada incremento de 20 nm a partir del punto de contacto y se midieron los valores del módulo en cada paso de la curva de fuerza. Spin Cy et al. Se ha utilizado un enfoque similar para caracterizar el gradiente del módulo de cepillos de polímero de poli(metacrilato de laurilo) (P12MA) mediante nanoindentación con sonda AFM coloidal, y estos resultados son consistentes con los datos obtenidos mediante el modelo de contacto de Hertz. Este enfoque proporciona una gráfica del módulo de contacto aparente (kPa) frente a la profundidad de indentación (nm), como se muestra en la Figura 8, que ilustra el gradiente del módulo de contacto aparente/profundidad. El módulo elástico calculado de la muestra CL lehfilcon A se encuentra en el rango de 2 a 3 kPa dentro de los 100 nm superiores de la muestra, más allá del cual comienza a aumentar con la profundidad. Por otro lado, al probar el sustrato base SiHy sin una película similar a un cepillo en la superficie, la profundidad de indentación máxima alcanzada a una fuerza de 300 pN es inferior a 50 nm, y el valor del módulo obtenido a partir de los datos es de aproximadamente 400 kPa, que es comparable a los valores del módulo de Young para materiales a granel.
Módulo de contacto aparente (kPa) vs. profundidad de indentación (nm) para sustratos lehfilcon A CL y SiHy utilizando el método de nanoindentación AFM con geometría de cono-esfera para medir el módulo.
La superficie superior de la novedosa estructura biomimética del cepillo de polímero ramificado presenta un módulo de elasticidad extremadamente bajo (2-3 kPa). Esto coincide con el extremo colgante del cepillo de polímero bifurcado, como se muestra en la imagen STEM. Si bien existe cierta evidencia de un gradiente de módulo en el borde exterior del CL, el sustrato principal de alto módulo tiene mayor influencia. Sin embargo, los primeros 100 nm de la superficie se encuentran dentro del 20 % de la longitud total del cepillo de polímero ramificado, por lo que es razonable suponer que los valores medidos del módulo en este rango de profundidad de indentación son relativamente precisos y no dependen en gran medida del efecto del objeto inferior.
Debido al diseño biomimético único de las lentes de contacto lehfilcon A, compuestas por estructuras de cepillo de polímero PMPC ramificado injertadas sobre la superficie de sustratos de SiHy, resulta muy difícil caracterizar con fiabilidad las propiedades mecánicas de sus estructuras superficiales mediante métodos de medición tradicionales. Presentamos un método avanzado de nanoindentación AFM para caracterizar con precisión materiales ultrablandos como lefilcon A, con alto contenido de agua y una elasticidad extremadamente alta. Este método se basa en el uso de una sonda AFM cuyo tamaño y geometría de punta se seleccionan cuidadosamente para adaptarse a las dimensiones estructurales de las características de la superficie ultrablando que se van a imprimir. Esta combinación de dimensiones entre la sonda y la estructura proporciona una mayor sensibilidad, lo que permite medir el bajo módulo y las propiedades elásticas inherentes de los elementos de cepillo de polímero ramificado, independientemente de los efectos poroelásticos. Los resultados mostraron que los exclusivos cepillos de polímero PMPC ramificado característicos de la superficie de la lente presentaron un módulo elástico extremadamente bajo (hasta 2 kPa) y una elasticidad muy alta (casi el 100 %) al probarse en un entorno acuoso. Los resultados de la nanoindentación AFM también nos permitieron caracterizar el módulo de contacto aparente/gradiente de profundidad (30 kPa/200 nm) de la superficie de la lente biomimética. Este gradiente podría deberse a la diferencia de módulo entre los cepillos de polímero ramificados y el sustrato de SiHy, a la estructura/densidad ramificada de los cepillos de polímero, o a una combinación de ambos. Sin embargo, se requieren estudios más profundos para comprender completamente la relación entre la estructura y las propiedades, especialmente el efecto de la ramificación del cepillo en las propiedades mecánicas. Mediciones similares pueden ayudar a caracterizar las propiedades mecánicas de la superficie de otros materiales ultrablandos y dispositivos médicos.
Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a pedido razonable de los respectivos autores.
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