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Mit der Entwicklung neuer ultraweicher Materialien für Medizinprodukte und biomedizinische Anwendungen ist die umfassende Charakterisierung ihrer physikalischen und mechanischen Eigenschaften sowohl wichtig als auch anspruchsvoll. Eine modifizierte Nanoindentationstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurde angewendet, um den extrem niedrigen Oberflächenmodul der neuen biomimetischen Silikon-Hydrogel-Kontaktlinse Lehfilcon A zu charakterisieren, die mit einer Schicht verzweigter Polymerbürstenstrukturen beschichtet ist. Diese Methode ermöglicht die präzise Bestimmung von Kontaktpunkten ohne die Auswirkungen viskoser Extrusion beim Annähern an verzweigte Polymere. Darüber hinaus erlaubt sie die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften einzelner Bürstenelemente ohne den Einfluss der Poroelastizität. Dies wird durch die Auswahl einer AFM-Sonde mit einem Design (Spitzengröße, Geometrie und Federkonstante) erreicht, das sich besonders für die Messung der Eigenschaften weicher Materialien und biologischer Proben eignet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit und Genauigkeit für die präzise Messung des sehr weichen Materials Lehfilcon A, das einen extrem niedrigen Elastizitätsmodul an der Oberfläche (bis zu 2 kPa) und eine extrem hohe Elastizität im inneren (nahezu 100% wässrigen) Milieu aufweist. Die Ergebnisse der Oberflächenuntersuchung offenbarten nicht nur die ultraweichen Oberflächeneigenschaften der Lehfilcon-A-Linse, sondern zeigten auch, dass der Elastizitätsmodul der verzweigten Polymerbürsten mit dem des Silizium-Wasserstoff-Substrats vergleichbar ist. Diese Oberflächencharakterisierungstechnik lässt sich auf andere ultraweiche Materialien und medizinische Geräte anwenden.
Die mechanischen Eigenschaften von Materialien, die für den direkten Kontakt mit lebendem Gewebe entwickelt wurden, werden häufig durch die biologische Umgebung bestimmt. Die optimale Abstimmung dieser Materialeigenschaften trägt dazu bei, die gewünschten klinischen Eigenschaften des Materials zu erzielen, ohne unerwünschte zelluläre Reaktionen hervorzurufen^1,2,3. Bei homogenen Materialien ist die Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften aufgrund der Verfügbarkeit von Standardverfahren und Testmethoden (z. B. Mikroindentation^4,5,6) relativ einfach. Bei ultraweichen Materialien wie Gelen, Hydrogelen, Biopolymeren, lebenden Zellen usw. sind diese Testmethoden jedoch aufgrund von Auflösungsbeschränkungen und der Inhomogenität mancher Materialien in der Regel nicht anwendbar⁷. Traditionelle Indentationsmethoden wurden im Laufe der Jahre modifiziert und angepasst, um ein breites Spektrum weicher Materialien zu charakterisieren. Viele Methoden weisen jedoch weiterhin gravierende Mängel auf, die ihre Anwendung einschränken^{8,9,10,11,12,13}. Der Mangel an spezialisierten Testmethoden, die die mechanischen Eigenschaften von ultraweichen Materialien und Oberflächenschichten präzise und zuverlässig charakterisieren können, schränkt deren Einsatz in verschiedenen Anwendungen stark ein.
In unserer vorherigen Arbeit stellten wir die Lehfilcon-A-Kontaktlinse (CL) vor, ein weiches, heterogenes Material mit ultraweichen Oberflächeneigenschaften, die auf potenziell biomimetischen Designs basieren, welche von der Oberfläche der Hornhaut inspiriert sind. Dieses Biomaterial wurde durch Aufpfropfen einer verzweigten, vernetzten Polymerschicht aus Poly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC)) (PMPC) auf ein Silikonhydrogel (SiHy) entwickelt, das für medizinische Geräte konzipiert wurde. Durch diesen Pfropfprozess entsteht eine Oberflächenschicht aus einer sehr weichen und hochelastischen, verzweigten Polymerbürstenstruktur. Unsere vorherigen Arbeiten bestätigten, dass die biomimetische Struktur der Lehfilcon-A-CL überlegene Oberflächeneigenschaften wie verbesserte Benetzung und geringere Anhaftung von Verunreinigungen, erhöhte Gleitfähigkeit sowie reduzierte Zell- und Bakterienadhäsion bietet. Darüber hinaus legt die Verwendung und Weiterentwicklung dieses biomimetischen Materials eine Anwendung in weiteren biomedizinischen Geräten nahe. Daher ist es entscheidend, die Oberflächeneigenschaften dieses ultraweichen Materials zu charakterisieren und seine mechanische Wechselwirkung mit dem Auge zu verstehen, um eine umfassende Wissensbasis für zukünftige Entwicklungen und Anwendungen zu schaffen. Die meisten handelsüblichen Silikon-Hydrogel-Kontaktlinsen (SiHy) bestehen aus einer homogenen Mischung hydrophiler und hydrophober Polymere, die eine einheitliche Materialstruktur bilden¹⁷. Zahlreiche Studien untersuchten ihre mechanischen Eigenschaften mithilfe traditioneller Druck-, Zug- und Mikroindentationsmethoden^18,19,20,21. Das neuartige biomimetische Design der Lehfilcon-A-Kontaktlinse macht sie jedoch zu einem einzigartigen heterogenen Material, dessen mechanische Eigenschaften der verzweigten Polymerbürstenstrukturen sich deutlich von denen des SiHy-Basissubstrats unterscheiden. Daher ist es sehr schwierig, diese Eigenschaften mit konventionellen Indentationsmethoden genau zu quantifizieren. Ein vielversprechender Ansatz ist die Nanoindentationsmethode, die in der Rasterkraftmikroskopie (AFM) implementiert ist. Diese Methode wurde bereits zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften weicher viskoelastischer Materialien wie biologischer Zellen und Gewebe sowie weicher Polymere eingesetzt^22,23,24,25. Bei der AFM-Nanoindentation werden die Grundlagen der Nanoindentationsprüfung mit den neuesten Fortschritten der AFM-Technologie kombiniert, um eine höhere Messgenauigkeit und die Prüfung einer breiten Palette von inhärent superweichen Materialien zu ermöglichen.^{31,32,33,34,35,36} Darüber hinaus bietet die Technologie durch die Verwendung unterschiedlicher Geometrien von Eindringkörper und Sonde sowie die Möglichkeit der Prüfung in verschiedenen flüssigen Medien weitere wichtige Vorteile.
Die AFM-Nanoindentation lässt sich bedingt in drei Hauptkomponenten unterteilen: (1) Geräte (Sensoren, Detektoren, Sonden usw.); (2) Messparameter (wie Kraft, Weg, Geschwindigkeit, Rampengröße usw.); (3) Datenverarbeitung (Basiskorrektur, Bestimmung des Berührungspunkts, Datenanpassung, Modellierung usw.). Ein wesentliches Problem dieser Methode besteht darin, dass verschiedene Studien in der Literatur, die AFM-Nanoindentation verwenden, für denselben Proben-/Zell-/Materialtyp sehr unterschiedliche quantitative Ergebnisse liefern^{37,38,39,40,41}. Beispielsweise untersuchten und verglichen Lekka et al. den Einfluss der AFM-Sondengeometrie auf den gemessenen Elastizitätsmodul von Proben aus mechanisch homogenem Hydrogel und heterogenen Zellen. Sie berichten, dass die Modulwerte stark von der Wahl des Cantilevers und der Spitzenform abhängen, wobei der höchste Wert für eine pyramidenförmige Sonde und der niedrigste Wert von 42 für eine sphärische Sonde ermittelt wurde. Ähnlich berichten Selhuber-Unkel et al. Es wurde gezeigt, wie die Eindringgeschwindigkeit, die Eindringkörpergröße und die Dicke von Polyacrylamid (PAAM)-Proben den mittels ACM43-Nanoindentation gemessenen Elastizitätsmodul beeinflussen. Erschwerend kommt hinzu, dass es an standardisierten Testmaterialien für extrem niedrige Elastizitätsmodule und an geeigneten Testverfahren mangelt. Dies macht es sehr schwierig, zuverlässige und genaue Ergebnisse zu erzielen. Die Methode ist jedoch sehr nützlich für relative Messungen und vergleichende Auswertungen ähnlicher Probentypen, beispielsweise zur Unterscheidung von normalen Zellen und Krebszellen mittels AFM-Nanoindentation^44,45.
Bei der Untersuchung weicher Materialien mittels AFM-Nanoindentation gilt die Faustregel, eine Sonde mit niedriger Federkonstante (k) zu verwenden, die dem Elastizitätsmodul der Probe möglichst genau entspricht, sowie eine halbkugelförmige/runde Spitze, damit die Sonde beim ersten Kontakt mit dem weichen Material die Probenoberfläche nicht durchdringt. Wichtig ist außerdem, dass das von der Sonde erzeugte Auslenkungssignal stark genug ist, um vom Laserdetektorsystem erfasst zu werden^24,34,46,47. Bei ultraweichen, heterogenen Zellen, Geweben und Gelen besteht eine weitere Herausforderung darin, die Adhäsionskraft zwischen Sonde und Probenoberfläche zu überwinden, um reproduzierbare und zuverlässige Messungen zu gewährleisten^48,49,50. Bis vor Kurzem konzentrierten sich die meisten Arbeiten zur AFM-Nanoindentation auf die Untersuchung des mechanischen Verhaltens von biologischen Zellen, Geweben, Gelen, Hydrogelen und Biomolekülen mithilfe relativ großer sphärischer Sonden, sogenannter kolloidaler Sonden (CPs). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Diese Spitzen haben einen Radius von 1 bis 50 µm und bestehen üblicherweise aus Borosilikatglas, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polystyrol (PS), Siliziumdioxid (SiO₂) und diamantartigem Kohlenstoff (DLC). Obwohl die CP-AFM-Nanoindentation oft die erste Wahl für die Charakterisierung weicher Proben ist, weist sie eigene Probleme und Einschränkungen auf. Die Verwendung großer, mikrometergroßer sphärischer Spitzen vergrößert die gesamte Kontaktfläche der Spitze mit der Probe und führt zu einem signifikanten Verlust der Ortsauflösung. Bei weichen, inhomogenen Proben, bei denen die mechanischen Eigenschaften lokaler Elemente deutlich vom Durchschnitt über einen größeren Bereich abweichen können, kann die CP-Indentation jegliche Inhomogenität der Eigenschaften auf lokaler Ebene verbergen⁵². Kolloidale Sonden werden typischerweise hergestellt, indem mikrometergroße Kolloidkugeln mithilfe von Epoxidklebstoffen an spitzenlose Cantilever angebracht werden. Der Herstellungsprozess selbst ist mit zahlreichen Problemen behaftet und kann zu Inkonsistenzen bei der Sondenkalibrierung führen. Darüber hinaus beeinflussen Größe und Masse der kolloidalen Partikel direkt die wichtigsten Kalibrierparameter des Cantilevers, wie Resonanzfrequenz, Federsteifigkeit und Auslenkungsempfindlichkeit^56,57,58. Daher liefern gängige Methoden für konventionelle AFM-Sonden, wie die Temperaturkalibrierung, möglicherweise keine genaue Kalibrierung für CP, und es können andere Methoden zur Durchführung dieser Korrekturen erforderlich sein^57,59,60,61. Typische CP-Indentationsversuche verwenden Cantilever mit großen Auslenkungen zur Untersuchung der Eigenschaften weicher Proben, was ein weiteres Problem bei der Kalibrierung des nichtlinearen Verhaltens des Cantilevers bei relativ großen Auslenkungen darstellt^62,63,64. Moderne Indentationsmethoden für kolloidale Sonden berücksichtigen üblicherweise die Geometrie des zur Kalibrierung verwendeten Cantilevers, vernachlässigen jedoch den Einfluss der kolloidalen Partikel, was zu einer zusätzlichen Unsicherheit in der Genauigkeit der Methode führt^38,61. Ebenso hängen die mittels Kontaktmodellanpassung berechneten Elastizitätsmoduln direkt von der Geometrie der Eindringspitze ab, und eine Diskrepanz zwischen den Eigenschaften der Spitze und der Probenoberfläche kann zu Ungenauigkeiten führen^{27, 65, 66, 67, 68}. In einer aktuellen Arbeit von Spencer et al. werden die Faktoren hervorgehoben, die bei der Charakterisierung weicher Polymerbürsten mittels CP-AFM-Nanoindentation berücksichtigt werden sollten. Sie berichten, dass die Retention einer viskosen Flüssigkeit in Polymerbürsten in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit zu einer Erhöhung der Kopfbelastung und somit zu veränderten Messungen geschwindigkeitsabhängiger Eigenschaften führt^{30, 69, 70, 71}.
In dieser Studie wurde der Oberflächenmodul des ultraweichen, hochelastischen Materials Lehfilcon A CL mittels einer modifizierten AFM-Nanoindentationsmethode charakterisiert. Aufgrund der Eigenschaften und der neuartigen Struktur dieses Materials ist der Empfindlichkeitsbereich der traditionellen Indentationsmethode zur Charakterisierung des Moduls dieses extrem weichen Materials eindeutig unzureichend. Daher war der Einsatz einer AFM-Nanoindentationsmethode mit höherer und niedrigerer Empfindlichkeit erforderlich. Nach einer Betrachtung der Schwächen und Probleme bestehender Nanoindentationstechniken mit kolloidalen AFM-Sonden wird erläutert, warum eine kleinere, speziell entwickelte AFM-Sonde gewählt wurde, um Empfindlichkeitsprobleme, Hintergrundrauschen und einen punktuellen Kontakt zu eliminieren, den Geschwindigkeitsmodul weicher, heterogener Materialien, wie z. B. die Abhängigkeit von der Flüssigkeitsretention, zu messen und eine genaue Quantifizierung zu ermöglichen. Darüber hinaus konnten Form und Abmessungen der Indentationsspitze präzise gemessen werden, wodurch die Anwendung des Kegel-Kugel-Modells zur Bestimmung des Elastizitätsmoduls ohne Berücksichtigung der Kontaktfläche zwischen Spitze und Material möglich war. Die beiden impliziten Annahmen, die in dieser Arbeit quantifiziert werden, sind die vollständig elastischen Materialeigenschaften und der von der Eindringtiefe unabhängige Modul. Mit dieser Methode testeten wir zunächst ultraweiche Standards mit bekanntem Modul, um die Methode zu quantifizieren, und charakterisierten anschließend die Oberflächen zweier verschiedener Kontaktlinsenmaterialien. Diese Methode zur Charakterisierung von AFM-Nanoindentationsoberflächen mit erhöhter Empfindlichkeit dürfte auf eine breite Palette biomimetischer, heterogener, ultraweicher Materialien anwendbar sein und Potenzial für Anwendungen in Medizinprodukten und der Biomedizin bieten.
Für Nanoindentationsversuche wurden Lehfilcon A Kontaktlinsen (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) und deren Silikon-Hydrogel-Substrate ausgewählt. Im Experiment kam eine speziell entwickelte Linsenhalterung zum Einsatz. Zur Positionierung der Linse für die Tests wurde diese vorsichtig auf den kuppelförmigen Ständer gesetzt, wobei darauf geachtet wurde, dass keine Luftblasen eindrangen, und anschließend an den Rändern fixiert. Eine Öffnung in der Halterung an der Oberseite des Linsenhalters ermöglicht den Zugang zum optischen Zentrum der Linse für die Nanoindentationsversuche und hält gleichzeitig die Flüssigkeit an Ort und Stelle. Dadurch bleiben die Linsen vollständig hydratisiert. Als Testlösung wurden 500 μl Kontaktlinsen-Verpackungslösung verwendet. Zur Überprüfung der quantitativen Ergebnisse wurden kommerziell erhältliche, nicht aktivierte Polyacrylamid (PAAM)-Hydrogele aus einer Polyacrylamid-co-Methylen-Bisacrylamid-Zusammensetzung (100-mm-Petrischalen von Petrisoft, Matrigen, Irvine, CA, USA) mit einem bekannten Elastizitätsmodul von 1 kPa hergestellt. Geben Sie 4-5 Tropfen (ca. 125 µl) phosphatgepufferte Salzlösung (PBS von Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) und 1 Tropfen OPTI-FREE Puremoist Kontaktlinsenlösung (Alcon, Vaud, TX, USA) auf die AFM-Hydrogel-Sonden-Grenzfläche.
Proben von Lehfilcon A CL und SiHy-Substraten wurden mit einem FEI Quanta 250 Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FEG-REM) mit integriertem Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM) visualisiert. Zur Probenpräparation wurden die Linsen zunächst mit Wasser gespült und in keilförmige Stücke geschnitten. Um einen Differenzkontrast zwischen den hydrophilen und hydrophoben Komponenten der Proben zu erzielen, wurde eine 0,10%ige stabilisierte RuO₄-Lösung als Farbstoff verwendet, in die die Proben 30 Minuten lang eingetaucht wurden. Die RuO₄-Färbung von Lehfilcon A CL ist nicht nur wichtig für einen verbesserten Differenzkontrast, sondern trägt auch dazu bei, die Struktur der verzweigten Polymerbürsten in ihrer ursprünglichen Form zu erhalten, wodurch diese in den STEM-Aufnahmen sichtbar werden. Anschließend wurden die Proben in einer Reihe von Ethanol/Wasser-Gemischen mit steigender Ethanolkonzentration gewaschen und dehydriert. Abschließend wurden die Proben mit EMBed 812/Araldit-Epoxidharz vergossen, das über Nacht bei 70 °C aushärtete. Die mittels Harzpolymerisation gewonnenen Probenblöcke wurden mit einem Ultramikrotom geschnitten und die resultierenden Dünnschnitte mit einem STEM-Detektor im Niedervakuummodus bei einer Beschleunigungsspannung von 30 kV visualisiert. Dasselbe SEM-System wurde zur detaillierten Charakterisierung der PFQNM-LC-A-CAL-AFM-Sonde (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) verwendet. SEM-Aufnahmen der AFM-Sonde wurden im typischen Hochvakuummodus mit einer Beschleunigungsspannung von 30 kV aufgenommen. Es wurden Bilder aus verschiedenen Winkeln und mit unterschiedlichen Vergrößerungen aufgenommen, um alle Details der Form und Größe der AFM-Sondenspitze zu erfassen. Alle relevanten Abmessungen der Spitze wurden digital gemessen.
Zur Visualisierung und Nanoindentation von Lehfilcon-A-CL-, SiHy-Substrat- und PAAm-Hydrogelproben wurde ein Rasterkraftmikroskop Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) im Modus „PeakForce QNM in Fluid“ verwendet. Für die Bildgebungsversuche kam eine PEAKFORCE-HIRS-FA-Sonde (Bruker) mit einem nominellen Spitzenradius von 1 nm zum Einsatz, um hochauflösende Bilder der Probe mit einer Abtastrate von 0,50 Hz aufzunehmen. Alle Aufnahmen erfolgten in wässriger Lösung.
AFM-Nanoindentationsmessungen wurden mit einer PFQNM-LC-A-CAL-Sonde (Bruker) durchgeführt. Die AFM-Sonde besitzt eine Siliziumspitze auf einem 345 nm dicken, 54 µm langen und 4,5 µm breiten Nitrid-Cantilever mit einer Resonanzfrequenz von 45 kHz. Sie ist speziell für die Charakterisierung und quantitative nanomechanische Messung weicher biologischer Proben konzipiert. Die Sensoren werden werkseitig mit vorkalibrierten Federeinstellungen individuell kalibriert. Die Federkonstanten der in dieser Studie verwendeten Sonden lagen im Bereich von 0,05–0,1 N/m. Zur genauen Bestimmung von Form und Größe der Spitze wurde die Sonde detailliert mittels SEM charakterisiert. Abbildung 1a zeigt eine hochauflösende Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme der PFQNM-LC-A-CAL-Sonde bei niedriger Vergrößerung und bietet einen umfassenden Überblick über deren Design. Abbildung 1b zeigt eine vergrößerte Ansicht der Sondenspitze und gibt Aufschluss über deren Form und Größe. Am äußersten Ende ist die Nadel eine Halbkugel mit einem Durchmesser von ca. 140 nm (Abb. 1c). Darunter verjüngt sich die Spitze zu einem Kegel und erreicht eine gemessene Länge von ca. 500 nm. Außerhalb des Verjüngungsbereichs ist die Spitze zylindrisch und hat eine Gesamtlänge von 1,18 µm. Dies ist der wichtigste funktionelle Teil der Sondenspitze. Zusätzlich wurde eine große, kugelförmige Polystyrolsonde (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) mit einem Spitzendurchmesser von 45 µm und einer Federkonstante von 2 N/m als Kolloidsonde getestet. Zum Vergleich wurde die PFQNM-LC-A-CAL-Sonde (140 nm) verwendet.
Es wurde berichtet, dass sich bei der Nanoindentation Flüssigkeit zwischen der AFM-Sonde und der Polymerbürstenstruktur ansammeln kann. Diese Flüssigkeit übt eine nach oben gerichtete Kraft auf die AFM-Sonde aus, bevor diese die Oberfläche berührt.⁶⁹ Dieser viskose Extrusionseffekt aufgrund der Flüssigkeitsretention kann den scheinbaren Kontaktpunkt verändern und somit die Messungen des Oberflächenmoduls beeinflussen. Um den Einfluss der Sondengeometrie und der Indentationsgeschwindigkeit auf die Flüssigkeitsretention zu untersuchen, wurden Kraftkurven für Lehfilcon-A-CL-Proben mit einer Sonde von 140 nm Durchmesser bei konstanten Eindringgeschwindigkeiten von 1 µm/s und 2 µm/s aufgezeichnet. Bei einem Sondendurchmesser von 45 µm und einer festen Kraft von 6 nN, die bei 1 µm/s erreicht wurde, wurden Experimente mit einer Sonde von 140 nm Durchmesser bei einer Indentationsgeschwindigkeit von 1 µm/s und einer festen Kraft von 300 pN durchgeführt. Diese Werte wurden gewählt, um einen Kontaktdruck im physiologischen Bereich (1–8 kPa) des Oberlids zu erzeugen. Druck 72. Weiche, vorgefertigte Proben aus PAA-Hydrogel mit einem Druck von 1 kPa wurden mit einer Sonde mit einem Durchmesser von 140 nm auf eine Eindringkraft von 50 pN bei einer Geschwindigkeit von 1 μm/s getestet.
Da die Länge des konischen Teils der PFQNM-LC-A-CAL-Sonde etwa 500 nm beträgt, kann für jede Eindringtiefe < 500 nm davon ausgegangen werden, dass die Geometrie der Sonde während des Eindringens ihrer Kegelform treu bleibt. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Oberfläche des Prüfmaterials ein reversibles elastisches Verhalten zeigt, was in den folgenden Abschnitten bestätigt wird. Daher wählten wir, abhängig von Form und Größe der Spitze, das von Briscoe, Sebastian und Adams entwickelte Kegel-Kugel-Anpassungsmodell, das in der Software des Herstellers (NanoScope) verfügbar ist, zur Auswertung unserer AFM-Nanoindentationsmessungen. Die Datenanalyse erfolgte mit der Software Bruker (73). Das Modell beschreibt die Kraft-Weg-Beziehung F(δ) für einen Kegel mit einem sphärischen Defekt an der Spitze. (Siehe Abb.) Abbildung 2 zeigt die Kontaktgeometrie bei der Wechselwirkung eines starren Kegels mit einer sphärischen Spitze. Dabei ist R der Radius der sphärischen Spitze, a der Kontaktradius, b der Kontaktradius am Ende der sphärischen Spitze, δ der Kontaktradius, die Eindringtiefe und θ der halbe Öffnungswinkel des Kegels. Die REM-Aufnahme dieser Sonde zeigt deutlich, dass die sphärische Spitze mit 140 nm Durchmesser tangential in einen Kegel übergeht. Daher ist b hier nur über R definiert, d. h. b = R cos θ. Die mitgelieferte Software stellt eine Kegel-Kugel-Beziehung zur Verfügung, um die Werte des Elastizitätsmoduls (E) aus den Kraft-Abstands-Daten unter der Annahme a > b zu berechnen.
wobei F die Eindringkraft, E der Elastizitätsmodul und ν die Querkontraktionszahl ist. Der Kontaktradius a kann wie folgt abgeschätzt werden:
Schema der Kontaktgeometrie eines starren Kegels mit sphärischer Spitze, der in das Material einer Lefilcon-Kontaktlinse mit einer Oberflächenschicht aus verzweigten Polymerbürsten eingepresst ist.
Wenn a ≤ b, reduziert sich die Beziehung auf die Gleichung für einen herkömmlichen sphärischen Eindringkörper;
Wir gehen davon aus, dass die Wechselwirkung der Eindringsonde mit der verzweigten Struktur der PMPC-Polymerbürste dazu führt, dass der Kontaktradius a größer ist als der sphärische Kontaktradius b. Daher verwendeten wir für alle quantitativen Messungen des Elastizitätsmoduls in dieser Studie die Abhängigkeit, die für den Fall a > b ermittelt wurde.
Die in dieser Studie untersuchten ultraweichen biomimetischen Materialien wurden umfassend mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) des Probenquerschnitts und Rasterkraftmikroskopie (AFM) der Oberfläche abgebildet. Diese detaillierte Oberflächencharakterisierung erfolgte als Erweiterung unserer zuvor veröffentlichten Arbeit, in der wir feststellten, dass die dynamisch verzweigte Polymerbürstenstruktur der PMPC-modifizierten Lehfilcon-A-Kontaktlinsenoberfläche ähnliche mechanische Eigenschaften wie natives Hornhautgewebe aufweist¹⁴. Aus diesem Grund bezeichnen wir Kontaktlinsenoberflächen als biomimetische Materialien¹⁴. Abb. 3a und 3b zeigen Querschnitte von verzweigten PMPC-Polymerbürstenstrukturen auf der Oberfläche eines Lehfilcon-A-Kontaktlinsensubstrats bzw. eines unbehandelten SiH_y-Substrats. Die Oberflächen beider Proben wurden zusätzlich mittels hochauflösender AFM-Bilder analysiert, welche die Ergebnisse der STEM-Analyse bestätigten (Abb. 3c und 3d). Zusammengenommen ergeben diese Bilder eine ungefähre Länge der verzweigten PMPC-Polymerbürstenstruktur von 300–400 nm, was für die Interpretation von AFM-Nanoindentationsmessungen entscheidend ist. Eine weitere wichtige Erkenntnis aus den Bildern ist, dass sich die Oberflächenstruktur des CL-biomimetischen Materials morphologisch von der des SiHy-Substratmaterials unterscheidet. Dieser Unterschied in der Oberflächenmorphologie wird bei der mechanischen Wechselwirkung mit der AFM-Sonde und somit in den gemessenen Modulwerten sichtbar.
Querschnitts-STEM-Aufnahmen von (a) Lehfilcon A CL und (b) SiHy-Substrat. Maßstabsbalken: 500 nm. AFM-Aufnahmen der Oberfläche des Lehfilcon A CL-Substrats (c) und des SiHy-Substrats (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirierte Polymere und Polymerbürstenstrukturen sind von Natur aus weich und wurden bereits umfassend untersucht und in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt^74,75,76,77. Daher ist die Anwendung der AFM-Nanoindentationsmethode wichtig, da sie eine präzise und zuverlässige Messung ihrer mechanischen Eigenschaften ermöglicht. Gleichzeitig erschweren die besonderen Eigenschaften dieser ultraweichen Materialien, wie beispielsweise der extrem niedrige Elastizitätsmodul, der hohe Flüssigkeitsgehalt und die hohe Elastizität, oft die Wahl des geeigneten Materials, der Form und der Größe der Eindringspitze. Dies ist wichtig, damit die Eindringspitze die weiche Probenoberfläche nicht durchdringt, was zu Fehlern bei der Bestimmung des Kontaktpunkts und der Kontaktfläche führen würde.
Hierfür ist ein umfassendes Verständnis der Morphologie ultraweicher biomimetischer Materialien (Lehfilcon A CL) unerlässlich. Informationen über Größe und Struktur der verzweigten Polymerbürsten, die mittels Bildgebung gewonnen werden, bilden die Grundlage für die mechanische Charakterisierung der Oberfläche mittels AFM-Nanoindentation. Anstelle von mikrometergroßen sphärischen Kolloidsonden wählten wir die Siliziumnitridsonde PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) mit einem Spitzendurchmesser von 140 nm, die speziell für die quantitative Kartierung der mechanischen Eigenschaften biologischer Proben entwickelt wurde (78–84). Die Verwendung relativ spitzer Sonden im Vergleich zu herkömmlichen Kolloidsonden lässt sich durch die Strukturmerkmale des Materials erklären. Vergleicht man die Größe der Sondenspitze (~140 nm) mit den verzweigten Polymerbürsten auf der Oberfläche von CL-Lehfilcon A (Abb. 3a), so lässt sich schlussfolgern, dass die Spitze groß genug ist, um in direkten Kontakt mit diesen Bürstenstrukturen zu treten. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die Spitze diese durchdringt. Zur Veranschaulichung zeigt Abb. 4 eine maßstabsgetreue STEM-Aufnahme von Lehfilcon A CL und der eindrückenden AFM-Sonde.
Schematische Darstellung einer STEM-Aufnahme von Lehfilcon A CL und einer ACM-Eindringsonde (maßstabsgetreu).
Darüber hinaus ist die Spitzengröße von 140 nm so klein, dass das Risiko von klebrigen Extrusionseffekten, wie sie zuvor bei Polymerbürsten mittels CP-AFM-Nanoindentation beschrieben wurden^69,71, vermieden wird. Wir gehen davon aus, dass die Kraftkurve, die durch Nanoindentation von Lehfilcon A CL erzeugt wird, aufgrund der speziellen kegel-kugelförmigen Gestalt und der relativ geringen Größe dieser AFM-Spitze (Abb. 1) nicht von der Indentations- oder Belastungs-/Entlastungsgeschwindigkeit abhängt. Daher wird sie auch nicht durch poroelastische Effekte beeinflusst. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Lehfilcon A CL-Proben mit einer PFQNM-LC-A-CAL-Sonde bei zwei verschiedenen Geschwindigkeiten mit einer festgelegten maximalen Kraft indentiert. Die resultierenden Zug- und Rückzugskraftkurven wurden verwendet, um die Kraft (nN) in Abhängigkeit vom Abstand (µm) in Abbildung 5a darzustellen. Es ist deutlich erkennbar, dass sich die Kraftkurven beim Be- und Entladen vollständig überlagern. Die Abbildung zeigt keinen eindeutigen Zusammenhang zwischen der Scherkraft bei Null-Eindringtiefe und der Eindringgeschwindigkeit, was darauf hindeutet, dass die einzelnen Bürstenelemente ohne poroelastischen Effekt charakterisiert wurden. Im Gegensatz dazu sind bei der AFM-Sonde mit 45 µm Durchmesser und gleicher Eindringgeschwindigkeit Flüssigkeitsretentionseffekte (viskose Extrusion und poroelastische Effekte) deutlich erkennbar, die sich in der Hysterese zwischen Dehnungs- und Rückzugskurven (siehe Abb. 5b) zeigen. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese und legen nahe, dass Sonden mit 140 nm Durchmesser eine gute Wahl zur Charakterisierung solcher weicher Oberflächen darstellen.
Lehfilcon A CL-Eindringkraftkurven mit ACM; (a) mit einer Sonde mit 140 nm Durchmesser bei zwei Belastungsgeschwindigkeiten, was das Fehlen eines poroelastischen Effekts bei der Oberflächeneindringung zeigt; (b) mit Sonden mit 45 µm und 140 nm Durchmesser. Die Abbildungen zeigen die Auswirkungen der viskosen Extrusion und der Poroelastizität für große Sonden im Vergleich zu kleineren Sonden.
Zur Charakterisierung ultraweicher Oberflächen benötigen AFM-Nanoindentationsmethoden eine optimale Sonde zur Untersuchung der Materialeigenschaften. Neben Form und Größe der Sondenspitze spielen die Empfindlichkeit des AFM-Detektorsystems, die Empfindlichkeit gegenüber Spitzenablenkungen in der Testumgebung und die Steifigkeit des Cantilevers eine wichtige Rolle für die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Nanoindentationsmessungen. Bei unserem AFM-System liegt die Nachweisgrenze des positionsempfindlichen Detektors (PSD) bei ca. 0,5 mV. Sie basiert auf der vorkalibrierten Federkonstante und der berechneten Empfindlichkeit der PFQNM-LC-A-CAL-Sonde gegenüber Flüssigkeitsablenkungen, was der theoretischen Lastempfindlichkeit von unter 0,1 pN entspricht. Daher ermöglicht diese Methode die Messung einer minimalen Eindringkraft von ≤ 0,1 pN ohne jegliches Rauschen. Es ist jedoch für ein AFM-System aufgrund von Faktoren wie mechanischen Vibrationen und Fluiddynamik nahezu unmöglich, das Rauschen auf dieses Niveau zu reduzieren. Diese Faktoren begrenzen die Gesamtempfindlichkeit der AFM-Nanoindentationsmethode und führen zu einem Hintergrundrauschen von ca. ≤ 10 pN. Zur Oberflächencharakterisierung wurden Lehfilcon A CL- und SiHy-Substratproben unter vollständig hydratisierten Bedingungen mit einer 140-nm-Sonde für die SEM-Charakterisierung indentiert. Die resultierenden Kraftkurven wurden zwischen Kraft (pN) und Druck überlagert. Die Trennungskurve (µm) ist in Abbildung 6a dargestellt. Im Vergleich zum SiHy-Basissubstrat zeigt die Kraftkurve von Lehfilcon A CL deutlich eine Übergangsphase, die am Kontaktpunkt mit der verzweigten Polymerbürste beginnt und mit einem abrupten Knick endet, der den Kontakt der Spitze mit dem darunterliegenden Material markiert. Dieser Übergangsbereich der Kraftkurve verdeutlicht das rein elastische Verhalten der verzweigten Polymerbürste auf der Oberfläche, was durch die Kompressionskurve, die der Zugkurve sehr nahe kommt, und den Kontrast in den mechanischen Eigenschaften zwischen der Bürstenstruktur und dem massiven SiHy-Material belegt wird. Beim Vergleich von Lehfilcon… Die Trennung der mittleren Länge einer verzweigten Polymerbürste im STEM-Bild des PCS (Abb. 3a) und ihrer Kraftkurve entlang der Abszisse in Abb. 3a. 6a zeigt, dass die Methode die Spitze und das bis zur Oberfläche reichende verzweigte Polymer erfassen kann. Kontakt zwischen den Bürstenstrukturen. Die enge Überlappung der Kraftkurven deutet zudem auf keinen Flüssigkeitsretentionseffekt hin. In diesem Fall besteht keinerlei Adhäsion zwischen der Nadel und der Probenoberfläche. Die oberen Abschnitte der Kraftkurven beider Proben überlappen sich, was die Ähnlichkeit der mechanischen Eigenschaften der Substratmaterialien widerspiegelt.
(a) AFM-Nanoindentationskraftkurven für Lehfilcon A CL-Substrate und SiHy-Substrate, (b) Kraftkurven, die die Kontaktpunktbestimmung mittels der Hintergrundrauschschwellenmethode zeigen.
Um die Feinheiten der Kraftkurve zu untersuchen, wurde die Spannungskurve der Lehfilcon-A-CL-Probe in Abb. 6b mit einer maximalen Kraft von 50 pN auf der y-Achse neu dargestellt. Diese Grafik liefert wichtige Informationen über das ursprüngliche Hintergrundrauschen. Das Rauschen liegt im Bereich von ±10 pN und wird genutzt, um den Kontaktpunkt präzise zu bestimmen und die Eindringtiefe zu berechnen. Wie in der Literatur berichtet, ist die Identifizierung von Kontaktpunkten entscheidend für die genaue Bestimmung von Materialeigenschaften wie dem Elastizitätsmodul⁸⁵. Ein Ansatz mit automatischer Verarbeitung von Kraftkurvendaten hat eine verbesserte Übereinstimmung zwischen Datenanpassung und quantitativen Messungen für weiche Materialien gezeigt⁸⁶. In dieser Arbeit ist unsere Wahl der Kontaktpunkte relativ einfach und objektiv, hat aber ihre Grenzen. Unser konservativer Ansatz zur Bestimmung des Kontaktpunkts kann bei kleineren Eindringtiefen (< 100 nm) zu leicht überschätzten Modulwerten führen. Die Verwendung algorithmusbasierter Berührungspunkterkennung und automatisierter Datenverarbeitung könnte zukünftig eine Fortsetzung dieser Arbeit darstellen, um unsere Methode weiter zu verbessern. Bei einem intrinsischen Hintergrundrauschen in der Größenordnung von ±10 pN definieren wir den Kontaktpunkt als den ersten Datenpunkt auf der x-Achse in Abbildung 6b mit einem Wert von ≥10 pN. Entsprechend der Rauschschwelle von 10 pN markiert eine vertikale Linie bei etwa 0,27 µm den Kontaktpunkt mit der Oberfläche. Anschließend verläuft die Dehnungskurve weiter, bis das Substrat eine Eindringtiefe von etwa 270 nm erreicht. Interessanterweise beträgt die Eindringtiefe der CL-Lehfilcon-A-Probe, die mit der Rauschschwellenmethode ermittelt wurde, basierend auf der Größe der verzweigten Polymerbürstenstrukturen (300–400 nm), etwa 270 nm. Dieser Wert liegt sehr nahe an der mit STEM gemessenen Größe. Diese Ergebnisse bestätigen die Kompatibilität und Anwendbarkeit der Form und Größe der AFM-Sondenspitze für das Eindringen in diese sehr weiche und hochelastische verzweigte Polymerbürstenstruktur. Diese Daten liefern zudem starke Belege für unsere Methode, Hintergrundrauschen als Schwellenwert zur Bestimmung von Kontaktpunkten zu verwenden. Daher sollten alle quantitativen Ergebnisse, die durch mathematische Modellierung und Kraftkurvenanpassung gewonnen werden, relativ genau sein.
Quantitative Messungen mittels AFM-Nanoindentation hängen vollständig von den mathematischen Modellen ab, die für die Datenauswahl und die anschließende Analyse verwendet werden. Daher ist es wichtig, alle Faktoren im Zusammenhang mit der Wahl des Indenters, den Materialeigenschaften und der Mechanik ihrer Wechselwirkung zu berücksichtigen, bevor ein bestimmtes Modell ausgewählt wird. In diesem Fall wurde die Geometrie der Spitze mithilfe von SEM-Aufnahmen (Abb. 1) sorgfältig charakterisiert. Basierend auf den Ergebnissen ist die AFM-Nanoindentationssonde mit 140 nm Durchmesser, harter Kegel- und sphärischer Spitzengeometrie eine gute Wahl zur Charakterisierung von Lehfilcon A CL79-Proben. Ein weiterer wichtiger Faktor, der sorgfältig bewertet werden muss, ist die Elastizität des untersuchten Polymermaterials. Obwohl die ersten Nanoindentationsdaten (Abb. 5a und 6a) die Überlagerung der Zug- und Druckkurven, d. h. die vollständige elastische Erholung des Materials, deutlich zeigen, ist es äußerst wichtig, den rein elastischen Charakter der Kontakte zu bestätigen. Zu diesem Zweck wurden zwei aufeinanderfolgende Eindrücke an derselben Stelle auf der Oberfläche der Lehfilcon-A-CL-Probe mit einer Eindringgeschwindigkeit von 1 µm/s unter vollständig hydratisierten Bedingungen durchgeführt. Die resultierenden Kraftkurven sind in Abb. 7 dargestellt. Wie erwartet, sind die Expansions- und Kompressionskurven der beiden Eindrücke nahezu identisch, was die hohe Elastizität der verzweigten Polymerbürstenstruktur unterstreicht.
Zwei Eindringkraftkurven an der gleichen Stelle auf der Oberfläche von Lehfilcon A CL deuten auf die ideale Elastizität der Linsenoberfläche hin.
Basierend auf den Informationen aus SEM- und STEM-Aufnahmen der Sondenspitze bzw. der Lehfilcon-A-CL-Oberfläche stellt das Kegel-Kugel-Modell eine plausible mathematische Beschreibung der Wechselwirkung zwischen der AFM-Sondenspitze und dem untersuchten weichen Polymermaterial dar. Darüber hinaus gelten für dieses Kegel-Kugel-Modell die grundlegenden Annahmen über die elastischen Eigenschaften des geprägten Materials auch für dieses neue biomimetische Material und werden zur Quantifizierung des Elastizitätsmoduls verwendet.
Nach einer umfassenden Evaluierung der AFM-Nanoindentationsmethode und ihrer Komponenten, einschließlich der Eigenschaften der Indentationssonde (Form, Größe und Federsteifigkeit), der Empfindlichkeit (Hintergrundrauschen und Kontaktpunktbestimmung) und der Datenanpassungsmodelle (quantitative Modulmessungen), wurde die Methode zur Charakterisierung kommerziell erhältlicher ultraweicher Proben eingesetzt, um die quantitativen Ergebnisse zu verifizieren. Ein kommerzielles Polyacrylamid-(PAAM)-Hydrogel mit einem Elastizitätsmodul von 1 kPa wurde unter hydratisierten Bedingungen mit einer 140-nm-Sonde getestet. Details zur Modulprüfung und -berechnung finden sich in den Zusatzinformationen. Die Ergebnisse zeigten, dass der gemessene mittlere Modul 0,92 kPa betrug und die relative Standardabweichung (RSD) sowie die prozentuale Abweichung vom bekannten Modul unter 10 % lagen. Diese Ergebnisse bestätigen die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der in dieser Arbeit verwendeten AFM-Nanoindentationsmethode zur Messung der Moduli ultraweicher Materialien. Die Oberflächen der Lehfilcon-A-CL-Proben und des SiHy-Basissubstrats wurden mittels AFM-Nanoindentation weiter charakterisiert, um den scheinbaren Kontaktmodul der ultraweichen Oberfläche in Abhängigkeit von der Eindringtiefe zu untersuchen. Für jeweils drei Proben jedes Typs (n = 3; eine Eindringung pro Probe) wurden bei einer Kraft von 300 pN, einer Geschwindigkeit von 1 µm/s und vollständiger Hydratation Kraft-Kraft-Kurven erstellt. Die Kraftverteilungskurve wurde mithilfe eines Kegel-Kugel-Modells approximiert. Um den Modul in Abhängigkeit von der Eindringtiefe zu ermitteln, wurde in 20-nm-Schritten ausgehend vom Kontaktpunkt ein 40 nm breiter Abschnitt der Kraftkurve ausgewählt und die Modulwerte in jedem Schritt gemessen. (Spin Cy et al.) Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um den Modulgradienten von Poly(laurylmethacrylat) (P12MA)-Polymerbürsten mittels Nanoindentation mit einer kolloidalen AFM-Sonde zu charakterisieren. Die Ergebnisse stimmen mit Daten des Hertzschen Kontaktmodells überein. Dieser Ansatz liefert eine Auftragung des scheinbaren Kontaktmoduls (kPa) gegen die Eindringtiefe (nm), wie in Abbildung 8 dargestellt. Diese Abbildung veranschaulicht den Gradienten des scheinbaren Kontaktmoduls in Abhängigkeit von der Eindringtiefe. Der berechnete Elastizitätsmodul der CL-Lehfilcon-A-Probe liegt innerhalb der oberen 100 nm der Probe im Bereich von 2–3 kPa und steigt darüber hinaus mit zunehmender Tiefe an. Bei der Prüfung des SiHy-Basissubstrats ohne bürstenartigen Film auf der Oberfläche beträgt die maximale Eindringtiefe bei einer Kraft von 300 pN weniger als 50 nm, und der aus den Daten ermittelte Modulwert liegt bei etwa 400 kPa. Dieser Wert ist vergleichbar mit den Werten des Elastizitätsmoduls von Massenmaterialien.
Scheinbarer Kontaktmodul (kPa) vs. Eindringtiefe (nm) für Lehfilcon A CL und SiHy-Substrate unter Verwendung der AFM-Nanoindentationsmethode mit Kegel-Kugel-Geometrie zur Messung des Moduls.
Die oberste Oberfläche der neuartigen biomimetischen, verzweigten Polymerbürstenstruktur weist einen extrem niedrigen Elastizitätsmodul (2–3 kPa) auf. Dieser entspricht dem frei hängenden Ende der gegabelten Polymerbürste, wie in der STEM-Aufnahme zu sehen ist. Obwohl am äußeren Rand der CL ein Modulgradient erkennbar ist, ist das Substrat mit seinem hohen Modul maßgeblicher. Da die obersten 100 nm der Oberfläche jedoch nur 20 % der Gesamtlänge der verzweigten Polymerbürste ausmachen, kann davon ausgegangen werden, dass die gemessenen Modulwerte in diesem Eindringtiefenbereich relativ genau sind und nicht stark vom Einfluss des darunterliegenden Objekts abhängen.
Aufgrund des einzigartigen biomimetischen Designs von Lehfilcon-A-Kontaktlinsen, bestehend aus verzweigten PMPC-Polymerbürstenstrukturen auf SiHy-Substraten, ist es sehr schwierig, die mechanischen Eigenschaften ihrer Oberflächenstrukturen mit herkömmlichen Messmethoden zuverlässig zu charakterisieren. Wir präsentieren hier eine fortschrittliche AFM-Nanoindentationsmethode zur präzisen Charakterisierung ultraweicher Materialien wie Lehfilcon A mit hohem Wassergehalt und extrem hoher Elastizität. Diese Methode basiert auf einer AFM-Sonde, deren Spitzengröße und -geometrie sorgfältig auf die Strukturdimensionen der zu prägenden ultraweichen Oberflächenmerkmale abgestimmt sind. Diese Kombination von Sonden- und Strukturdimensionen ermöglicht eine erhöhte Empfindlichkeit und erlaubt die Messung des niedrigen Elastizitätsmoduls und der inhärenten elastischen Eigenschaften der verzweigten Polymerbürstenelemente unabhängig von poroelastischen Effekten. Die Ergebnisse zeigten, dass die einzigartigen verzweigten PMPC-Polymerbürsten der Linsenoberfläche einen extrem niedrigen Elastizitätsmodul (bis zu 2 kPa) und eine sehr hohe Elastizität (nahezu 100 %) in wässriger Umgebung aufwiesen. Die Ergebnisse der AFM-Nanoindentation ermöglichten es uns zudem, den scheinbaren Kontaktmodul/Tiefengradienten (30 kPa/200 nm) der biomimetischen Linsenoberfläche zu charakterisieren. Dieser Gradient könnte auf den Modulunterschied zwischen den verzweigten Polymerbürsten und dem SiHy-Substrat, die verzweigte Struktur/Dichte der Polymerbürsten oder eine Kombination dieser Faktoren zurückzuführen sein. Um den Zusammenhang zwischen Struktur und Eigenschaften, insbesondere den Einfluss der Bürstenverzweigung auf die mechanischen Eigenschaften, vollständig zu verstehen, sind jedoch weitere detaillierte Untersuchungen erforderlich. Ähnliche Messungen können zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften der Oberfläche anderer ultraweicher Materialien und medizinischer Geräte beitragen.
Die im Rahmen dieser Studie erstellten und/oder analysierten Datensätze können auf begründete Anfrage bei den jeweiligen Autoren angefordert werden.
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