Tak, fordi du besøger Nature.com. Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). For at sikre løbende support viser vi desuden webstedet uden typografier og JavaScript.
Viser en karrusel med tre slides på én gang. Brug knapperne Forrige og Næste til at navigere gennem tre slides ad gangen, eller brug skyderknapperne i slutningen til at navigere gennem tre slides ad gangen.
Med udviklingen af ​​nye ultrabløde materialer til medicinsk udstyr og biomedicinske anvendelser er den omfattende karakterisering af deres fysiske og mekaniske egenskaber både vigtig og udfordrende. En modificeret atomkraftmikroskopi (AFM) nanoindentationsteknik blev anvendt til at karakterisere det ekstremt lave overflademodul af den nye lehfilcon A biomimetiske silikonehydrogelkontaktlinse belagt med et lag af forgrenede polymerbørstestrukturer. Denne metode muliggør præcis bestemmelse af kontaktpunkter uden virkningerne af viskøs ekstrudering, når man nærmer sig forgrenede polymerer. Derudover gør den det muligt at bestemme de mekaniske egenskaber ved individuelle børsteelementer uden effekten af ​​poroelasticitet. Dette opnås ved at vælge en AFM-sonde med et design (spidsstørrelse, geometri og fjederhastighed), der er særligt egnet til måling af egenskaberne af bløde materialer og biologiske prøver. Denne metode forbedrer følsomheden og nøjagtigheden for nøjagtig måling af det meget bløde materiale lehfilcon A, som har et ekstremt lavt elasticitetsmodul på overfladearealet (op til 2 kPa) og en ekstremt høj elasticitet i det indre (næsten 100%) vandige miljø. Resultaterne af overfladeundersøgelsen afslørede ikke blot de ultrabløde overfladeegenskaber af lehfilcon A-linsen, men viste også, at modulet af de forgrenede polymerbørster var sammenligneligt med modulet af silicium-hydrogensubstratet. Denne overfladekarakteriseringsteknik kan anvendes på andre ultrabløde materialer og medicinsk udstyr.
De mekaniske egenskaber ved materialer designet til direkte kontakt med levende væv bestemmes ofte af det biologiske miljø. Den perfekte matchning af disse materialeegenskaber hjælper med at opnå de ønskede kliniske egenskaber ved materialet uden at forårsage negative cellulære reaktioner1,2,3. For homogene bulkmaterialer er karakteriseringen af ​​mekaniske egenskaber relativt let på grund af tilgængeligheden af ​​standardprocedurer og testmetoder (f.eks. mikroindentation4,5,6). For ultrabløde materialer såsom geler, hydrogeler, biopolymerer, levende celler osv. er disse testmetoder dog generelt ikke anvendelige på grund af begrænsninger i måleopløsningen og inhomogeniteten af ​​nogle materialer7. Gennem årene er traditionelle indentationsmetoder blevet modificeret og tilpasset til at karakterisere en bred vifte af bløde materialer, men mange metoder lider stadig af alvorlige mangler, der begrænser deres anvendelse8,9,10,11,12,13. Manglen på specialiserede testmetoder, der nøjagtigt og pålideligt kan karakterisere de mekaniske egenskaber ved superbløde materialer og overfladelag, begrænser deres anvendelse i forskellige anvendelser alvorligt.
I vores tidligere arbejde introducerede vi lehfilcon A (CL) kontaktlinsen, et blødt heterogent materiale med alle de ultrabløde overfladeegenskaber, der stammer fra potentielt biomimetiske designs inspireret af overfladen af ​​øjets hornhinde. Dette biomateriale blev udviklet ved at pode et forgrenet, tværbundet polymerlag af poly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC)) (PMPC) på en silikonehydrogel (SiHy) 15 designet til medicinsk udstyr baseret på. Denne podningsproces skaber et lag på overfladen bestående af en meget blød og meget elastisk forgrenet polymerbørstestruktur. Vores tidligere arbejde har bekræftet, at den biomimetiske struktur af lehfilcon A CL giver overlegne overfladeegenskaber såsom forbedret befugtning og tilsmudsning, øget smøreevne og reduceret celle- og bakterieadhæsion 15,16. Derudover antyder brugen og udviklingen af ​​dette biomimetiske materiale også yderligere udvidelse til andre biomedicinske apparater. Det er derfor afgørende at karakterisere overfladeegenskaberne af dette ultrabløde materiale og forstå dets mekaniske interaktion med øjet for at skabe en omfattende vidensbase til støtte for fremtidig udvikling og anvendelse. De fleste kommercielt tilgængelige SiHy-kontaktlinser er sammensat af en homogen blanding af hydrofile og hydrofobe polymerer, der danner en ensartet materialestruktur17. Adskillige undersøgelser er blevet udført for at undersøge deres mekaniske egenskaber ved hjælp af traditionelle kompressions-, træk- og mikroindentationstestmetoder18,19,20,21. Det nye biomimetiske design af lehfilcon A CL gør det imidlertid til et unikt heterogent materiale, hvor de mekaniske egenskaber af de forgrenede polymerbørstestrukturer adskiller sig væsentligt fra SiHy-basesubstratets. Derfor er det meget vanskeligt at kvantificere disse egenskaber nøjagtigt ved hjælp af konventionelle og indentationsmetoder. En lovende metode anvender nanoindentationstestmetoden implementeret i atomkraftmikroskopi (AFM), en metode, der er blevet brugt til at bestemme de mekaniske egenskaber af bløde viskoelastiske materialer såsom biologiske celler og væv, såvel som bløde polymerer22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. I AFM-nanoindentation kombineres det grundlæggende i nanoindentationstestning med de nyeste fremskridt inden for AFM-teknologi for at give øget målefølsomhed og testning af en bred vifte af iboende superbløde materialer31,32,33,34,35,36. Derudover tilbyder teknologien andre vigtige fordele gennem brugen af ​​forskellige geometrier, indenter og probe samt muligheden for testning i forskellige flydende medier.
AFM-nanoindentation kan betinget opdeles i tre hovedkomponenter: (1) udstyr (sensorer, detektorer, prober osv.); (2) måleparametre (såsom kraft, forskydning, hastighed, rampestørrelse osv.); (3) Databehandling (baselinekorrektion, berøringspunktsestimering, datatilpasning, modellering osv.). Et væsentligt problem med denne metode er, at adskillige studier i litteraturen, der bruger AFM-nanoindentation, rapporterer meget forskellige kvantitative resultater for den samme prøve-/celle-/materialetype37,38,39,40,41. For eksempel Lekka et al. Indflydelsen af ​​AFM-probegeometri på det målte Youngs modul af prøver af mekanisk homogene hydrogel- og heterogene celler blev undersøgt og sammenlignet. De rapporterer, at modulværdier er stærkt afhængige af udkragningsvalg og spidsform, med den højeste værdi for en pyramideformet probe og den laveste værdi på 42 for en sfærisk probe. Tilsvarende Selhuber-Unkel et al. Det er blevet vist, hvordan indenterhastigheden, indenterstørrelsen og tykkelsen af ​​polyacrylamid (PAAM)-prøver påvirker Youngs modul målt ved ACM43-nanoindentation. En anden komplicerende faktor er manglen på standard testmaterialer med ekstremt lavt modul og gratis testprocedurer. Dette gør det meget vanskeligt at få nøjagtige resultater med sikkerhed. Metoden er dog meget nyttig til relative målinger og sammenlignende evalueringer mellem lignende prøvetyper, for eksempel ved brug af AFM-nanoindentation til at skelne normale celler fra kræftceller 44, 45.
Ved test af bløde materialer med AFM-nanoindentation er en generel tommelfingerregel at bruge en probe med en lav fjederkonstant (k), der nøje matcher prøvemodulet, og en halvkugleformet/rund spids, så den første probe ikke gennemborer prøveoverfladerne ved første kontakt med bløde materialer. Det er også vigtigt, at det afbøjningssignal, der genereres af proben, er stærkt nok til at blive detekteret af laserdetektorsystemet24,34,46,47. I tilfælde af ultrabløde heterogene celler, væv og geler er en anden udfordring at overvinde klæbekraften mellem proben og prøveoverfladen for at sikre reproducerbare og pålidelige målinger48,49,50. Indtil for nylig har det meste arbejde med AFM-nanoindentation fokuseret på studiet af den mekaniske opførsel af biologiske celler, væv, geler, hydrogeler og biomolekyler ved hjælp af relativt store sfæriske prober, almindeligvis omtalt som kolloide prober (CP'er). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Disse spidser har en radius på 1 til 50 µm og er almindeligvis lavet af borosilikatglas, polymethylmethacrylat (PMMA), polystyren (PS), siliciumdioxid (SiO2) og diamantlignende kulstof (DLC). Selvom CP-AFM nanoindentation ofte er førstevalget til karakterisering af bløde prøver, har det sine egne problemer og begrænsninger. Brugen af ​​store, mikronstore, sfæriske spidser øger spidsens samlede kontaktareal med prøven og resulterer i et betydeligt tab af rumlig opløsning. For bløde, inhomogene prøver, hvor de mekaniske egenskaber af lokale elementer kan afvige væsentligt fra gennemsnittet over et større område, kan CP-indentation skjule enhver inhomogenitet i egenskaber på lokal skala52. Kolloidale prober fremstilles typisk ved at fastgøre mikronstore kolloidale kugler til spidsløse cantilevers ved hjælp af epoxyklæbemidler. Selve fremstillingsprocessen er behæftet med mange problemer og kan føre til uoverensstemmelser i probekalibreringsprocessen. Derudover påvirker størrelsen og massen af ​​kolloidale partikler direkte de vigtigste kalibreringsparametre for cantileveren, såsom resonansfrekvens, fjederstivhed og afbøjningsfølsomhed56,57,58. Således giver almindeligt anvendte metoder til konventionelle AFM-prober, såsom temperaturkalibrering, muligvis ikke en nøjagtig kalibrering for CP, og andre metoder kan være nødvendige for at udføre disse korrektioner57, 59, 60, 61. Typiske CP-indrykningseksperimenter bruger store afvigelser fra cantileveren til at studere egenskaberne af bløde prøver, hvilket skaber et andet problem ved kalibrering af den ikke-lineære opførsel af cantileveren ved relativt store afvigelser62,63,64. Moderne kolloidale probeindrykningsmetoder tager normalt højde for geometrien af ​​den cantilever, der bruges til at kalibrere proben, men ignorerer indflydelsen af ​​kolloidale partikler, hvilket skaber yderligere usikkerhed i metodens nøjagtighed38,61. Tilsvarende er elasticitetsmoduler beregnet ved kontaktmodeltilpasning direkte afhængige af geometrien af ​​indentationssonden, og uoverensstemmelse mellem spids- og prøveoverfladeegenskaber kan føre til unøjagtigheder27, 65, 66, 67, 68. Nogle nyere arbejder af Spencer et al. De faktorer, der skal tages i betragtning ved karakterisering af bløde polymerbørster ved hjælp af CP-AFM nanoindentationsmetoden, fremhæves. De rapporterede, at tilbageholdelsen af ​​en viskøs væske i polymerbørster som funktion af hastighed resulterer i en stigning i hovedbelastningen og dermed forskellige målinger af hastighedsafhængige egenskaber30,69,70,71.
I denne undersøgelse har vi karakteriseret overflademodulet af det ultrabløde, højelastiske materiale lehfilcon A CL ved hjælp af en modificeret AFM-nanoindenteringsmetode. I betragtning af materialets egenskaber og nye struktur er følsomhedsområdet for den traditionelle indenteringsmetode klart utilstrækkeligt til at karakterisere modulet af dette ekstremt bløde materiale, så det er nødvendigt at bruge en AFM-nanoindenteringsmetode med højere følsomhed og lavere følsomhedsniveau. Efter at have gennemgået manglerne og problemerne ved eksisterende kolloidale AFM-probes nanoindenteringsteknikker, viser vi, hvorfor vi valgte en mindre, specialdesignet AFM-probe for at eliminere følsomhed, baggrundsstøj, præcist fastslå kontaktpunkter, måle hastighedsmodulet af bløde, heterogene materialer, såsom væskeretentionsafhængighed, og præcis kvantificering. Derudover var vi i stand til nøjagtigt at måle formen og dimensionerne af indenteringsspidsen, hvilket giver os mulighed for at bruge kegle-sfære-tilpasningsmodellen til at bestemme elasticitetsmodulet uden at vurdere spidsens kontaktareal med materialet. De to implicitte antagelser, der kvantificeres i dette arbejde, er materialets fuldt elastiske egenskaber og det dybdeuafhængige modul. Ved hjælp af denne metode testede vi først ultrabløde standarder med et kendt modul for at kvantificere metoden, og brugte derefter denne metode til at karakterisere overfladerne af to forskellige kontaktlinsematerialer. Denne metode til karakterisering af AFM-nanoindentationsoverflader med øget følsomhed forventes at være anvendelig på en bred vifte af biomimetiske heterogene ultrabløde materialer med potentiel anvendelse i medicinsk udstyr og biomedicinske applikationer.
Lehfilcon A kontaktlinser (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) og deres silikonehydrogelsubstrater blev valgt til nanoindentationsforsøg. En specialdesignet linseholder blev anvendt i eksperimentet. For at installere linsen til test blev den omhyggeligt placeret på det kuppelformede stativ, idet det sikredes, at der ikke kom luftbobler indeni, og derefter fikseret med kanterne. Et hul i fiksturen øverst på linseholderen giver adgang til linsens optiske centrum til nanoindentationsforsøg, samtidig med at væsken holdes på plads. Dette holder linserne fuldt hydrerede. 500 μl kontaktlinseemballageopløsning blev anvendt som testopløsning. For at verificere de kvantitative resultater blev kommercielt tilgængelige ikke-aktiverede polyacrylamid (PAAM) hydrogeler fremstillet af en polyacrylamid-co-methylen-bisacrylamid-sammensætning (100 mm Petrisoft Petri-skåle, Matrigen, Irvine, CA, USA) med et kendt elasticitetsmodul på 1 kPa. Brug 4-5 dråber (ca. 125 µl) fosfatbufret saltvand (PBS fra Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) og 1 dråbe OPTI-FREE Puremoist kontaktlinseopløsning (Alcon, Vaud, TX, USA) ved AFM hydrogel-probe-grænsefladen.
Prøver af Lehfilcon A CL- og SiHy-substrater blev visualiseret ved hjælp af et FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM)-system udstyret med en scanning transmission electron microscope (STEM)-detektor. For at forberede prøverne blev linserne først vasket med vand og skåret i tærteformede kiler. For at opnå en differentiel kontrast mellem de hydrofile og hydrofobe komponenter i prøverne blev en 0,10% stabiliseret opløsning af RuO4 anvendt som farvestof, hvori prøverne blev nedsænket i 30 minutter. Lehfilcon A CL RuO4-farvning er vigtig ikke kun for at opnå forbedret differentiel kontrast, men hjælper også med at bevare strukturen af ​​de forgrenede polymerbørster i deres oprindelige form, som derefter er synlige på STEM-billeder. De blev derefter vasket og dehydreret i en række ethanol/vand-blandinger med stigende ethanolkoncentration. Prøverne blev derefter støbt med EMBed 812/Araldite-epoxy, som hærdede natten over ved 70°C. Prøveblokke opnået ved harpikspolymerisation blev skåret med en ultramikrotom, og de resulterende tynde sektioner blev visualiseret med en STEM-detektor i lavvakuumtilstand ved en accelerationsspænding på 30 kV. Det samme SEM-system blev brugt til detaljeret karakterisering af PFQNM-LC-A-CAL AFM-proben (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). SEM-billeder af AFM-proben blev taget i en typisk højvakuumtilstand med en accelerationsspænding på 30 kV. Optag billeder fra forskellige vinkler og med forskellige forstørrelser for at registrere alle detaljer om formen og størrelsen af ​​AFM-probespidsen. Alle spidsdimensioner af interesse i billederne blev målt digitalt.
Et Dimension FastScan Bio Icon atomkraftmikroskop (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) med "PeakForce QNM in Fluid"-tilstand blev brugt til at visualisere og nanoindentere lehfilcon A CL-, SiHy-substrat- og PAAm-hydrogelprøver. Til billeddannelsesforsøg blev en PEAKFORCE-HIRS-FA-probe (Bruker) med en nominel spidsradius på 1 nm brugt til at optage billeder af prøven i høj opløsning med en scanningshastighed på 0,50 Hz. Alle billeder blev taget i vandig opløsning.
AFM-nanoindentationseksperimenter blev udført ved hjælp af en PFQNM-LC-A-CAL-probe (Bruker). AFM-proben har en siliciumspids på en nitrid-cantilever, der er 345 nm tyk, 54 µm lang og 4,5 µm bred med en resonansfrekvens på 45 kHz. Den er specifikt designet til at karakterisere og udføre kvantitative nanomekaniske målinger på bløde biologiske prøver. Sensorerne kalibreres individuelt på fabrikken med prækalibrerede fjederindstillinger. Fjederkonstanterne for de prober, der blev brugt i denne undersøgelse, lå i området 0,05-0,1 N/m. For nøjagtigt at bestemme spidsens form og størrelse blev proben karakteriseret i detaljer ved hjælp af SEM. Figur 1a viser et scanningselektronmikrografi med høj opløsning og lav forstørrelse af PFQNM-LC-A-CAL-proben, der giver et holistisk overblik over probedesignet. Figur 1b viser en forstørret visning af toppen af ​​probespidsen, der giver information om spidsens form og størrelse. I den yderste ende er nålen en halvkugle med en diameter på omkring 140 nm (fig. 1c). Nedenfor denne tilspidses spidsen til en konisk form og når en målt længde på cirka 500 nm. Uden for det tilspidsede område er spidsen cylindrisk og ender med en samlet spidslængde på 1,18 µm. Dette er den primære funktionelle del af probespidsen. Derudover blev en stor sfærisk polystyren (PS) probe (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) med en spidsdiameter på 45 µm og en fjederkonstant på 2 N/m også brugt til testning som en kolloid probe med PFQNM-LC-A-CAL 140 nm probe til sammenligning.
Det er blevet rapporteret, at væske kan blive fanget mellem AFM-sonden og polymerbørstestrukturen under nanoindentation, hvilket vil udøve en opadgående kraft på AFM-sonden, før den rent faktisk rører overfladen69. Denne viskøse ekstruderingseffekt på grund af væskeretention kan ændre det tilsyneladende kontaktpunkt og derved påvirke overflademodulmålinger. For at undersøge effekten af ​​sondens geometri og indrykningshastighed på væskeretention blev indrykningskraftkurver plottet for lehfilcon A CL-prøver ved hjælp af en sonde med en diameter på 140 nm ved konstante forskydningshastigheder på 1 µm/s og 2 µm/s. Sondediameter 45 µm, fast kraftindstilling 6 nN opnået ved 1 µm/s. Eksperimenter med en sonde med en diameter på 140 nm blev udført ved en indrykningshastighed på 1 µm/s og en indstillet kraft på 300 pN, valgt for at skabe et kontakttryk inden for det fysiologiske område (1-8 kPa) for det øvre øjenlåg. tryk 72. Bløde, færdiglavede prøver af PAA-hydrogel med et tryk på 1 kPa blev testet for en indrykningskraft på 50 pN ved en hastighed på 1 μm/s ved hjælp af en probe med en diameter på 140 nm.
Da længden af ​​den koniske del af spidsen af ​​PFQNM-LC-A-CAL-sonden er cirka 500 nm, kan det for enhver indrykningsdybde < 500 nm med sikkerhed antages, at sondens geometri under indrykningen vil forblive tro mod dens kegleform. Derudover antages det, at overfladen af ​​det testede materiale vil udvise en reversibel elastisk respons, hvilket også vil blive bekræftet i de følgende afsnit. Afhængigt af spidsens form og størrelse valgte vi derfor kegle-kugle-tilpasningsmodellen udviklet af Briscoe, Sebastian og Adams, som er tilgængelig i leverandørens software, til at behandle vores AFM-nanoindentationseksperimenter (NanoScope). Separationsdataanalysesoftware, Bruker) 73. Modellen beskriver kraft-forskydningsforholdet F(δ) for en kegle med en sfærisk apexdefekt. På fig. Figur 2 viser kontaktgeometrien under interaktionen mellem en stiv kegle og en sfærisk spids, hvor R er radius af den sfæriske spids, a er kontaktradius, b er kontaktradius for enden af ​​den sfæriske spids, δ er kontaktradius, indrykningsdybde, θ er keglens halve vinkel. SEM-billedet af denne probe viser tydeligt, at den sfæriske spids med en diameter på 140 nm går tangentielt over i en kegle, så her er b kun defineret gennem R, dvs. b = R cos θ. Den leverandørleverede software leverer et kegle-sfære-forhold til at beregne Youngs modul (E)-værdier ud fra kraftseparationsdata, forudsat at a > b. Forhold:
hvor F er indrykningskraften, E er Youngs modul, og ν er Poissons forhold. Kontaktradius a kan estimeres ved hjælp af:
Skema over kontaktgeometrien for en stiv kegle med en sfærisk spids presset ind i materialet i en Lefilcon-kontaktlinse med et overfladelag af forgrenede polymerbørster.
Hvis a ≤ b, reduceres relationen til ligningen for en konventionel sfærisk indentor;
Vi mener, at interaktionen mellem den indrykkende sonde og den forgrenede struktur af PMPC-polymerbørsten vil medføre, at kontaktradius a bliver større end den sfæriske kontaktradius b. Derfor anvendte vi for alle kvantitative målinger af elasticitetsmodulet udført i denne undersøgelse den afhængighed, der blev opnået for tilfældet a > b.
De ultrabløde biomimetiske materialer, der blev undersøgt i denne undersøgelse, blev omfattende afbildet ved hjælp af scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) af prøvens tværsnit og atomkraftmikroskopi (AFM) af overfladen. Denne detaljerede overfladekarakterisering blev udført som en udvidelse af vores tidligere publicerede arbejde, hvor vi bestemte, at den dynamisk forgrenede polymere børstestruktur af den PMPC-modificerede lehfilcon A CL-overflade udviste lignende mekaniske egenskaber som nativt hornhindevæv 14. Af denne grund omtaler vi kontaktlinseoverflader som biomimetiske materialer 14. Fig. 3a og 3b viser tværsnit af forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer på overfladen af ​​henholdsvis et lehfilcon A CL-substrat og et ubehandlet SiHy-substrat. Overfladerne af begge prøver blev yderligere analyseret ved hjælp af AFM-billeder med høj opløsning, hvilket yderligere bekræftede resultaterne af STEM-analysen (fig. 3c og d). Samlet set giver disse billeder en omtrentlig længde af den forgrenede PMPC-polymerbørstestruktur ved 300-400 nm, hvilket er afgørende for at fortolke AFM-nanoindentationsmålinger. En anden vigtig observation udledt af billederne er, at den overordnede overfladestruktur af det biomimetiske CL-materiale er morfologisk forskellig fra SiHy-substratmaterialets. Denne forskel i deres overflademorfologi kan blive tydelig under deres mekaniske interaktion med den indrykkende AFM-sonde og efterfølgende i de målte modulværdier.
Tværsnits-STEM-billeder af (a) lehfilcon A CL og (b) SiHy-substrat. Målestok, 500 nm. AFM-billeder af overfladen af ​​lehfilcon A CL-substratet (c) og SiHy-basissubstratet (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirerede polymerer og polymerbørstestrukturer er i sagens natur bløde og er blevet grundigt undersøgt og anvendt i forskellige biomedicinske anvendelser74,75,76,77. Derfor er det vigtigt at bruge AFM-nanoindentationsmetoden, som præcist og pålideligt kan måle deres mekaniske egenskaber. Men samtidig gør de unikke egenskaber ved disse ultrabløde materialer, såsom ekstremt lav elasticitetsmodul, højt væskeindhold og høj elasticitet, det ofte vanskeligt at vælge det rigtige materiale, form og størrelse på indenteringssonden. Dette er vigtigt, så indenteren ikke gennemborer den bløde overflade af prøven, hvilket ville føre til fejl i bestemmelsen af ​​kontaktpunktet med overfladen og kontaktområdet.
Til dette formål er en omfattende forståelse af morfologien af ​​ultrabløde biomimetiske materialer (lehfilcon A CL) afgørende. Information om størrelsen og strukturen af ​​de forgrenede polymerbørster opnået ved hjælp af billeddannelsesmetoden danner grundlag for den mekaniske karakterisering af overfladen ved hjælp af AFM-nanoindentationsteknikker. I stedet for sfæriske kolloidale prober i mikronstørrelse valgte vi PFQNM-LC-A-CAL siliciumnitridproben (Bruker) med en spidsdiameter på 140 nm, specielt designet til kvantitativ kortlægning af de mekaniske egenskaber af biologiske prøver 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Begrundelsen for at bruge relativt skarpe prober sammenlignet med konventionelle kolloidale prober kan forklares med materialets strukturelle egenskaber. Ved at sammenligne probespidsens størrelse (~140 nm) med de forgrenede polymerbørster på overfladen af ​​CL lehfilcon A, vist i figur 3a, kan det konkluderes, at spidsen er stor nok til at komme i direkte kontakt med disse børstestrukturer, hvilket reducerer risikoen for, at spidsen gennemborer dem. For at illustrere dette er der i figur 4 et STEM-billede af lehfilcon A CL og den indrykkede spids af AFM-proben (tegnet i målestok).
Skematisk illustration af STEM-billede af lehfilcon A CL og en ACM-indrykningssonde (tegnet i målestok).
Derudover er spidsstørrelsen på 140 nm lille nok til at undgå risikoen for de klæbrige ekstruderingseffekter, der tidligere er rapporteret for polymerbørster produceret ved CP-AFM nanoindentationsmetoden69,71. Vi antager, at på grund af den specielle keglesfæriske form og relativt lille størrelse af denne AFM-spids (fig. 1), vil arten af ​​den kraftkurve, der genereres af lehfilcon A CL nanoindentation, ikke afhænge af indrykningshastigheden eller indlæsnings-/aflæsningshastigheden. Derfor påvirkes den ikke af poroelastiske effekter. For at teste denne hypotese blev lehfilcon A CL-prøver indrykket ved en fast maksimal kraft ved hjælp af en PFQNM-LC-A-CAL-sonde, men ved to forskellige hastigheder, og de resulterende træk- og tilbagetrækningskraftkurver blev brugt til at plotte kraften (nN) i separation (µm), som vist i figur 5a. Det er tydeligt, at kraftkurverne under belastning og aflastning overlapper fuldstændigt, og der er ingen klare beviser for, at kraftforskydningen ved nul indrykningsdybde stiger med indrykningshastigheden i figuren, hvilket tyder på, at de individuelle børsteelementer blev karakteriseret uden en poroelastisk effekt. I modsætning hertil er væskeretentionseffekter (viskøs ekstrudering og poroelasticitetseffekter) tydelige for AFM-sonden med en diameter på 45 µm ved samme indrykningshastighed og fremhæves af hysteresen mellem stræk- og tilbagetrækningskurverne, som vist i figur 5b. Disse resultater understøtter hypotesen og antyder, at sonder med en diameter på 140 nm er et godt valg til karakterisering af sådanne bløde overflader.
lehfilcon A CL indrykningskraftkurver ved hjælp af ACM; (a) ved hjælp af en probe med en diameter på 140 nm ved to belastningshastigheder, hvilket demonstrerer fraværet af en poroelastisk effekt under overfladeindrykning; (b) ved hjælp af prober med en diameter på 45 µm og 140 nm. s viser virkningerne af viskøs ekstrudering og poroelasticitet for store prober sammenlignet med mindre prober.
For at karakterisere ultrabløde overflader skal AFM-nanoindentationsmetoder have den bedste probe til at studere egenskaberne af det undersøgte materiale. Ud over spidsens form og størrelse spiller AFM-detektorsystemets følsomhed, følsomheden over for spidsudbøjning i testmiljøet og udkragningsstivheden en vigtig rolle i at bestemme nøjagtigheden og pålideligheden af ​​nanoindentationsmålinger. For vores AFM-system er den positionsfølsomme detektor (PSD) detektionsgrænse cirka 0,5 mV og er baseret på den prækalibrerede fjederhastighed og den beregnede væskeudbøjningsfølsomhed for PFQNM-LC-A-CAL-proben, hvilket svarer til den teoretiske belastningsfølsomhed, der er mindre end 0,1 pN. Derfor tillader denne metode måling af en minimal indrykningskraft ≤ 0,1 pN uden nogen perifer støjkomponent. Det er dog næsten umuligt for et AFM-system at reducere perifer støj til dette niveau på grund af faktorer som mekanisk vibration og væskedynamik. Disse faktorer begrænser den samlede følsomhed af AFM-nanoindentationsmetoden og resulterer også i et baggrundsstøjsignal på cirka ≤ 10 pN. Til overfladekarakterisering blev lehfilcon A CL- og SiHy-substratprøver indrykket under fuldt hydrerede forhold ved hjælp af en 140 nm probe til SEM-karakterisering, og de resulterende kraftkurver blev overlejret mellem kraft (pN) og tryk. Separationsplottet (µm) er vist i figur 6a. Sammenlignet med SiHy-basissubstratet viser lehfilcon A CL-kraftkurven tydeligt en overgangsfase, der starter ved kontaktpunktet med den gaffelformede polymerbørste og slutter med en skarp ændring i hældningen, der markerer spidsens kontakt med det underliggende materiale. Denne overgangsdel af kraftkurven fremhæver den forgrenede polymerbørstes virkelig elastiske opførsel på overfladen, hvilket fremgår af kompressionskurven, der nøje følger spændingskurven, og kontrasten i mekaniske egenskaber mellem børstestrukturen og det voluminøse SiHy-materiale. Ved sammenligning af lefilcon. Adskillelsen af ​​den gennemsnitlige længde af en forgrenet polymerbørste i STEM-billedet af PCS (fig. 3a) og dens kraftkurve langs abscissen i fig. 3a. 6a viser, at metoden er i stand til at detektere spidsen og den forgrenede polymer, der når den øverste del af overfladen. Kontakt mellem børstestrukturer. Derudover indikerer tæt overlapning af kraftkurverne ingen væskeretentionseffekt. I dette tilfælde er der absolut ingen adhæsion mellem nålen og prøvens overflade. De øverste sektioner af kraftkurverne for de to prøver overlapper hinanden, hvilket afspejler ligheden mellem substratmaterialernes mekaniske egenskaber.
(a) AFM nanoindentationskraftkurver for lehfilcon A CL-substrater og SiHy-substrater, (b) kraftkurver, der viser kontaktpunktsestimering ved hjælp af baggrundsstøjtærskelmetoden.
For at studere de finere detaljer i kraftkurven er spændingskurven for lehfilcon A CL-prøven plottet igen i figur 6b med en maksimal kraft på 50 pN langs y-aksen. Denne graf giver vigtig information om den oprindelige baggrundsstøj. Støjen ligger i området ±10 pN, hvilket bruges til nøjagtigt at bestemme kontaktpunktet og beregne indrykningsdybden. Som rapporteret i litteraturen er identifikation af kontaktpunkter afgørende for nøjagtigt at vurdere materialeegenskaber såsom modulus85. En tilgang, der involverer automatisk behandling af kraftkurvedata, har vist en forbedret tilpasning mellem datatilpasning og kvantitative målinger for bløde materialer86. I dette arbejde er vores valg af kontaktpunkter relativt simpelt og objektivt, men det har sine begrænsninger. Vores konservative tilgang til at bestemme kontaktpunktet kan resultere i let overvurderede modulværdier for mindre indrykningsdybder (< 100 nm). Brugen af ​​algoritmebaseret berøringspunktsdetektion og automatiseret databehandling kan være en fortsættelse af dette arbejde i fremtiden for yderligere at forbedre vores metode. For intrinsisk baggrundsstøj i størrelsesordenen ±10 pN definerer vi således kontaktpunktet som det første datapunkt på x-aksen i figur 6b med en værdi på ≥10 pN. I overensstemmelse med støjtærsklen på 10 pN markerer en lodret linje på niveauet ~0,27 µm kontaktpunktet med overfladen, hvorefter strækningskurven fortsætter, indtil substratet når en indrykningsdybde på ~270 nm. Interessant nok er indrykningsdybden af ​​CL lehfilcon A-prøven observeret ved hjælp af baggrundsstøjtærskelmetoden omkring 270 nm, baseret på størrelsen af ​​de forgrenede polymerbørstefunktioner (300-400 nm) målt ved hjælp af billeddannelsesmetoden, omkring 270 nm, hvilket er meget tæt på målestørrelsen med STEM. Disse resultater bekræfter yderligere kompatibiliteten og anvendeligheden af ​​formen og størrelsen af ​​AFM-probespidsen til indrykning af denne meget bløde og yderst elastiske forgrenede polymerbørstestruktur. Disse data giver også stærke beviser for at understøtte vores metode til at bruge baggrundsstøj som en tærskel til at identificere kontaktpunkter. Således bør alle kvantitative resultater opnået fra matematisk modellering og kraftkurvetilpasning være relativt nøjagtige.
Kvantitative målinger ved hjælp af AFM-nanoindentationsmetoder er fuldstændig afhængige af de matematiske modeller, der anvendes til dataudvælgelse og efterfølgende analyse. Derfor er det vigtigt at overveje alle faktorer relateret til valg af indenter, materialeegenskaber og mekanikken i deres interaktion, før man vælger en bestemt model. I dette tilfælde blev spidsgeometrien omhyggeligt karakteriseret ved hjælp af SEM-mikrografer (fig. 1), og baseret på resultaterne er AFM-nanoindentationssonden med en diameter på 140 nm med en hård kegle og sfærisk spidsgeometri et godt valg til karakterisering af lehfilcon A CL79-prøver. En anden vigtig faktor, der skal evalueres omhyggeligt, er elasticiteten af ​​det polymermateriale, der testes. Selvom de indledende data for nanoindentation (fig. 5a og 6a) tydeligt skitserer træk ved overlapningen af ​​spændings- og kompressionskurverne, dvs. materialets fuldstændige elastiske genopretning, er det ekstremt vigtigt at bekræfte kontakternes rent elastiske natur. Til dette formål blev der udført to på hinanden følgende indrykninger på samme sted på overfladen af ​​lehfilcon A CL-prøven med en indrykningshastighed på 1 µm/s under fulde hydreringsforhold. De resulterende kraftkurvedata er vist i figur 7, og som forventet er ekspansions- og kompressionskurverne for de to tryk næsten identiske, hvilket fremhæver den høje elasticitet af den forgrenede polymerbørstestruktur.
To indrykningskraftkurver på samme sted på overfladen af ​​lehfilcon A CL angiver den ideelle elasticitet af linseoverfladen.
Baseret på information opnået fra SEM- og STEM-billeder af henholdsvis probespidsen og lehfilcon A CL-overfladen, er kegle-sfæremodellen en rimelig matematisk repræsentation af interaktionen mellem AFM-probespidsen og det bløde polymermateriale, der testes. Derudover gælder de grundlæggende antagelser om det prægede materiales elastiske egenskaber for denne kegle-sfæremodel for dette nye biomimetiske materiale og bruges til at kvantificere elasticitetsmodulet.
Efter en omfattende evaluering af AFM-nanoindentationsmetoden og dens komponenter, herunder indentationssondens egenskaber (form, størrelse og fjederstivhed), følsomhed (baggrundsstøj og kontaktpunktsestimering) og datatilpasningsmodeller (kvantitative modulmålinger), blev metoden anvendt til at karakterisere kommercielt tilgængelige ultrabløde prøver for at verificere kvantitative resultater. En kommerciel polyacrylamid (PAAM) hydrogel med et elasticitetsmodul på 1 kPa blev testet under hydrerede forhold ved hjælp af en 140 nm probe. Detaljer om modultestning og beregninger findes i den supplerende information. Resultaterne viste, at det gennemsnitlige målte modul var 0,92 kPa, og %RSD og procentvis (%) afvigelse fra det kendte modul var mindre end 10%. Disse resultater bekræfter nøjagtigheden og reproducerbarheden af ​​AFM-nanoindentationsmetoden, der blev anvendt i dette arbejde til at måle modulerne for ultrabløde materialer. Overfladerne af lehfilcon A CL-prøverne og SiHy-basesubstratet blev yderligere karakteriseret ved hjælp af den samme AFM-nanoindentationsmetode for at studere det tilsyneladende kontaktmodul for den ultrabløde overflade som en funktion af indentationsdybden. Indrykningskraftseparationskurver blev genereret for tre prøver af hver type (n = 3; én indrykning pr. prøve) ved en kraft på 300 pN, en hastighed på 1 µm/s og fuld hydrering. Indrykningskraftfordelingskurven blev tilnærmet ved hjælp af en kegle-sfære-model. For at opnå et modul afhængigt af indrykningsdybden blev en 40 nm bred del af kraftkurven indstillet ved hvert trin på 20 nm startende fra kontaktpunktet, og værdier for modulus blev målt ved hvert trin af kraftkurven. Spin Cy et al. En lignende tilgang er blevet brugt til at karakterisere modulgradienten af ​​poly(laurylmethacrylat) (P12MA) polymerbørster ved hjælp af kolloid AFM-probe-nanoindentation, og de er i overensstemmelse med data ved hjælp af Hertz-kontaktmodellen. Denne tilgang giver et plot af det tilsyneladende kontaktmodul (kPa) versus indrykningsdybde (nm), som vist i figur 8, som illustrerer den tilsyneladende kontaktmodul/dybdegradient. Det beregnede elasticitetsmodul for CL lehfilcon A-prøven ligger i området 2-3 kPa inden for de øvre 100 nm af prøven, hvorefter det begynder at stige med dybden. På den anden side, når SiHy-basesubstratet testes uden en børstelignende film på overfladen, er den maksimale indrykningsdybde, der opnås ved en kraft på 300 pN, mindre end 50 nm, og modulværdien opnået ud fra dataene er omkring 400 kPa, hvilket er sammenligneligt med værdierne for Youngs modul for bulkmaterialer.
Tilsyneladende kontaktmodul (kPa) vs. indrykningsdybde (nm) for lehfilcon A CL- og SiHy-substrater ved hjælp af AFM-nanoindenteringsmetode med kegle-sfæregeometri til måling af modul.
Den øverste overflade af den nye biomimetiske, forgrenede polymerbørstestruktur udviser et ekstremt lavt elasticitetsmodul (2-3 kPa). Dette vil matche den frithængende ende af den gaffelformede polymerbørste, som vist på STEM-billedet. Selvom der er tegn på en modulgradient ved den ydre kant af CL, er det primære substrat med højt modul mere indflydelsesrigt. De øverste 100 nm af overfladen ligger dog inden for 20 % af den samlede længde af den forgrenede polymerbørste, så det er rimeligt at antage, at de målte værdier for modulet i dette indrykningsdybdeområde er relativt nøjagtige og ikke stærkt afhænger af effekten af ​​det nederste objekt.
På grund af det unikke biomimetiske design af lehfilcon A kontaktlinser, der består af forgrenede PMPC-polymerbørstestrukturer podet på overfladen af ​​SiHy-substrater, er det meget vanskeligt pålideligt at karakterisere de mekaniske egenskaber af deres overfladestrukturer ved hjælp af traditionelle målemetoder. Her præsenterer vi en avanceret AFM-nanoindenteringsmetode til nøjagtig karakterisering af ultrabløde materialer såsom lefilcon A med højt vandindhold og ekstremt høj elasticitet. Denne metode er baseret på brugen af ​​en AFM-probe, hvis spidsstørrelse og geometri er omhyggeligt valgt til at matche de strukturelle dimensioner af de ultrabløde overfladeegenskaber, der skal præges. Denne kombination af dimensioner mellem probe og struktur giver øget følsomhed, hvilket giver os mulighed for at måle det lave modul og de iboende elastiske egenskaber af forgrenede polymerbørsteelementer, uanset poroelastiske effekter. Resultaterne viste, at de unikke forgrenede PMPC-polymerbørster, der er karakteristiske for linseoverfladen, havde et ekstremt lavt elasticitetsmodul (op til 2 kPa) og meget høj elasticitet (næsten 100%), når de blev testet i et vandigt miljø. Resultaterne af AFM-nanoindentation gjorde det også muligt for os at karakterisere den tilsyneladende kontaktmodul/dybdegradient (30 kPa/200 nm) af den biomimetiske linseoverflade. Denne gradient kan skyldes modulforskellen mellem de forgrenede polymerbørster og SiHy-substratet, eller den forgrenede struktur/densitet af polymerbørsterne eller en kombination deraf. Yderligere dybdegående undersøgelser er dog nødvendige for fuldt ud at forstå forholdet mellem struktur og egenskaber, især effekten af ​​børsteforgrening på mekaniske egenskaber. Lignende målinger kan hjælpe med at karakterisere de mekaniske egenskaber af overfladen af ​​andre ultrabløde materialer og medicinsk udstyr.
Datasæt genereret og/eller analyseret i løbet af den aktuelle undersøgelse er tilgængelige fra de respektive forfattere efter rimelig anmodning.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. og Haugen, HJ Biologiske reaktioner på fysiske og kemiske egenskaber af overflader af biomaterialer. Chemical. Society. Red. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM og Liu, X. Forbedring af humant afledte biomaterialer til vævsteknologi. programmering. polymer. videnskaben. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Design, klinisk implementering og immunrespons af biomaterialer i regenerativ medicin. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK og Farr GM En forbedret metode til bestemmelse af hårdhed og elasticitetsmodul ved hjælp af indrykningsforsøg med belastnings- og forskydningsmålinger. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM. Historisk oprindelse af indentationshårdhedsprøvning. Alma Mater. Science. Technologies. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Målinger af indrykningshårdhed på makro-, mikro- og nanoskala: En kritisk gennemgang. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD og Clapperich, SM. Fejl i overfladedetektion fører til overvurdering af modulus i nanoindentation af bløde materialer. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR og Yahya M.Yu. Evaluering af nanoindentationsmetoden til bestemmelse af de mekaniske egenskaber ved heterogene nanokompositter ved hjælp af eksperimentelle og beregningsmetoder. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, og Owart, TS Mekanisk karakterisering af bløde viskoelastiske geler ved indrykning og optimeringsbaseret invers finite element-analyse. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J og Chaneler D. Optimering af viskoelasticitetsbestemmelse ved hjælp af kompatible målesystemer. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. og Pellillo, E. Nanoindentation af polymere overflader. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. og Van Vliet KJ Karakterisering af viskoelastiske mekaniske egenskaber af højelastiske polymerer og biologiske væv ved hjælp af stødindrykning. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluering af elasticitetsmodulet og adhæsionsarbejdet for bløde materialer ved hjælp af den udvidede Borodich-Galanov (BG) metode og dyb indrykning. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Nanoskalamorfologi og mekaniske egenskaber af biomimetiske polymeroverflader af silikonehydrogelkontaktlinser. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).