Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Pro nejlepší možný zážitek doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v prohlížeči Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Abychom zajistili neustálou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel se třemi snímky najednou. Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet tři snímky najednou nebo pomocí posuvníků na konci můžete procházet tři snímky najednou.
S vývojem nových ultraměkkých materiálů pro zdravotnické prostředky a biomedicínské aplikace je komplexní charakterizace jejich fyzikálních a mechanických vlastností důležitá i náročná. Pro charakterizaci extrémně nízkého povrchového modulu nové biomimetické silikon-hydrogelové kontaktní čočky lehfilcon A potažené vrstvou rozvětvených polymerních kartáčových struktur byla použita modifikovaná technika nanoindentace atomární silové mikroskopie (AFM). Tato metoda umožňuje přesné stanovení kontaktních bodů bez účinků viskózní extruze při přiblížení k rozvětveným polymerům. Kromě toho umožňuje stanovit mechanické vlastnosti jednotlivých kartáčových prvků bez vlivu poroelasticity. Toho je dosaženo výběrem AFM sondy s konstrukcí (velikost hrotu, geometrie a tuhost pružiny), která je obzvláště vhodná pro měření vlastností měkkých materiálů a biologických vzorků. Tato metoda zlepšuje citlivost a přesnost pro přesné měření velmi měkkého materiálu lehfilcon A, který má extrémně nízký modul pružnosti na povrchu (až 2 kPa) a extrémně vysokou elasticitu ve vnitřním (téměř 100%) vodném prostředí. Výsledky studie povrchu nejen odhalily ultraměkké povrchové vlastnosti čočky lehfilcon A, ale také ukázaly, že modul rozvětvených polymerních kartáčů byl srovnatelný s modulem křemíkovo-vodíkového substrátu. Tuto techniku ​​charakterizace povrchu lze použít i na jiné ultraměkké materiály a zdravotnické prostředky.
Mechanické vlastnosti materiálů určených pro přímý kontakt s živou tkání jsou často určeny biologickým prostředím. Dokonalá shoda těchto materiálových vlastností pomáhá dosáhnout požadovaných klinických charakteristik materiálu, aniž by to způsobovalo nežádoucí buněčné reakce1,2,3. U objemových homogenních materiálů je charakterizace mechanických vlastností relativně snadná díky dostupnosti standardních postupů a zkušebních metod (např. mikroindentace4,5,6). U ultraměkkých materiálů, jako jsou gely, hydrogely, biopolymery, živé buňky atd., však tyto zkušební metody obecně nejsou použitelné kvůli omezením rozlišení měření a nehomogenitě některých materiálů7. V průběhu let byly tradiční metody vtlačování modifikovány a upraveny tak, aby charakterizovaly širokou škálu měkkých materiálů, ale mnoho metod stále trpí vážnými nedostatky, které omezují jejich použití8,9,10,11,12,13. Nedostatek specializovaných zkušebních metod, které by dokázaly přesně a spolehlivě charakterizovat mechanické vlastnosti superměkkých materiálů a povrchových vrstev, výrazně omezuje jejich použití v různých aplikacích.
V naší předchozí práci jsme představili kontaktní čočku lehfilcon A (CL), měkký heterogenní materiál se všemi ultraměkkými povrchovými vlastnostmi odvozenými z potenciálně biomimetických designů inspirovaných povrchem rohovky oka. Tento biomateriál byl vyvinut roubováním rozvětvené, zesítěné polymerní vrstvy poly(2-methakryloyloxyethylfosforylcholinu (MPC)) (PMPC) na silikonový hydrogel (SiHy) 15 určený pro zdravotnické prostředky na bázi. Tento proces roubování vytváří na povrchu vrstvu sestávající z velmi měkké a vysoce elastické rozvětvené polymerní kartáčové struktury. Naše předchozí práce potvrdila, že biomimetická struktura lehfilcon A CL poskytuje vynikající povrchové vlastnosti, jako je zlepšená smáčivost a prevence znečištění, zvýšená lubrikace a snížená adheze buněk a bakterií 15,16. Kromě toho použití a vývoj tohoto biomimetického materiálu také naznačuje další rozšíření na další biomedicínské prostředky. Proto je zásadní charakterizovat povrchové vlastnosti tohoto ultraměkkého materiálu a pochopit jeho mechanickou interakci s okem, aby se vytvořila komplexní znalostní základna pro podporu budoucího vývoje a aplikací. Většina komerčně dostupných SiHy kontaktních čoček se skládá z homogenní směsi hydrofilních a hydrofobních polymerů, které tvoří jednotnou materiálovou strukturu17. Bylo provedeno několik studií za účelem zkoumání jejich mechanických vlastností pomocí tradičních metod komprese, tahu a mikroindentačního testování18,19,20,21. Nový biomimetický design lehfilconu A CL z něj však činí unikátní heterogenní materiál, u kterého se mechanické vlastnosti rozvětvených polymerních kartáčových struktur výrazně liší od vlastností základního SiHy substrátu. Proto je velmi obtížné tyto vlastnosti přesně kvantifikovat pomocí konvenčních a indentačních metod. Slibná metoda využívá metodu nanoindentačního testování implementovanou v atomární silové mikroskopii (AFM), což je metoda, která se používá ke stanovení mechanických vlastností měkkých viskoelastických materiálů, jako jsou biologické buňky a tkáně, a také měkkých polymerů22,23,24,25, ,26,27,28,29,30. V AFM nanoindentaci jsou základy nanoindentačního testování kombinovány s nejnovějšími pokroky v technologii AFM, což zajišťuje zvýšenou citlivost měření a testování široké škály inherentně superměkkých materiálů31,32,33,34,35,36. Technologie navíc nabízí další důležité výhody díky použití různých geometrií vnikácího tělesa a sondy a možnosti testování v různých kapalných médiích.
AFM nanoindentaci lze podmíněně rozdělit na tři hlavní složky: (1) vybavení (senzory, detektory, sondy atd.); (2) parametry měření (jako je síla, posunutí, rychlost, velikost náběhu atd.); (3) zpracování dat (korekce základní linie, odhad bodu dotyku, fitování dat, modelování atd.). Významným problémem této metody je, že několik studií v literatuře používajících AFM nanoindentaci uvádí velmi odlišné kvantitativní výsledky pro stejný typ vzorku/buňky/materiálu37,38,39,40,41. Například Lekka a kol. studovali a porovnávali vliv geometrie AFM sondy na naměřený Youngův modul vzorků mechanicky homogenního hydrogelu a heterogenních buněk. Uvádějí, že hodnoty modulů jsou vysoce závislé na výběru konzoly a tvaru hrotu, s nejvyšší hodnotou pro sondu ve tvaru pyramidy a nejnižší hodnotou 42 pro kulovou sondu. Podobně Selhuber-Unkel a kol. Bylo prokázáno, jak rychlost vtlačování, velikost vtlačovacího tělesa a tloušťka vzorků polyakrylamidu (PAAM) ovlivňují Youngův modul pružnosti měřený nanoindentací ACM43. Dalším komplikujícím faktorem je nedostatek standardních testovacích materiálů s extrémně nízkým modulem a bezplatných testovacích postupů. To velmi ztěžuje získání přesných výsledků s jistotou. Metoda je však velmi užitečná pro relativní měření a srovnávací hodnocení mezi podobnými typy vzorků, například pomocí nanoindentace AFM k rozlišení normálních buněk od rakovinných buněk 44, 45.
Při testování měkkých materiálů pomocí AFM nanoindentace platí obecné pravidlo používat sondu s nízkou konstantou pružiny (k), která se co nejvíce shoduje s modulem vzorku, a polokulovým/kulatým hrotem, aby první sonda při prvním kontaktu s měkkými materiály nepropíchla povrch vzorku. Je také důležité, aby signál vychýlení generovaný sondou byl dostatečně silný, aby jej detekoval laserový detektor24,34,46,47. V případě ultraměkkých heterogenních buněk, tkání a gelů je další výzvou překonání adhezní síly mezi sondou a povrchem vzorku, aby se zajistila reprodukovatelná a spolehlivá měření48,49,50. Až donedávna se většina prací na AFM nanoindentaci zaměřovala na studium mechanického chování biologických buněk, tkání, gelů, hydrogelů a biomolekul s použitím relativně velkých sférických sond, běžně označovaných jako koloidní sondy (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Tyto hroty mají poloměr 1 až 50 µm a běžně se vyrábějí z borosilikátového skla, polymethylmethakrylátu (PMMA), polystyrenu (PS), oxidu křemičitého (SiO2) a diamantu podobného uhlíku (DLC). Ačkoli je nanoindentace CP-AFM často první volbou pro charakterizaci měkkých vzorků, má své vlastní problémy a omezení. Použití velkých kulovitých hrotů o velikosti mikronů zvětšuje celkovou kontaktní plochu hrotu se vzorkem a vede k významné ztrátě prostorového rozlišení. U měkkých, nehomogenních vzorků, kde se mechanické vlastnosti lokálních prvků mohou výrazně lišit od průměru v širší oblasti, může indentace CP skrýt jakoukoli nehomogenitu vlastností v lokálním měřítku52. Koloidní sondy se obvykle vyrábějí připevněním koloidních kuliček o velikosti mikronů k bezhrotovým konzolám pomocí epoxidových lepidel. Samotný výrobní proces je plný mnoha problémů a může vést k nekonzistencím v procesu kalibrace sondy. Kromě toho velikost a hmotnost koloidních částic přímo ovlivňují hlavní kalibrační parametry konzoly, jako je rezonanční frekvence, tuhost pružiny a citlivost na vychýlení56,57,58. Běžně používané metody pro konvenční AFM sondy, jako je kalibrace teploty, proto nemusí poskytovat přesnou kalibraci pro CP a k provedení těchto korekcí mohou být vyžadovány jiné metody57, 59, 60, 61. Typické experimenty s vtlačováním CP používají konzolu s velkými odchylkami ke studiu vlastností měkkých vzorků, což vytváří další problém při kalibraci nelineárního chování konzoly při relativně velkých odchylkách62,63,64. Moderní metody vtlačování koloidních sond obvykle berou v úvahu geometrii konzoly použité ke kalibraci sondy, ale ignorují vliv koloidních částic, což vytváří další nejistotu v přesnosti metody38,61. Podobně jsou elastické moduly vypočítané pomocí fitování kontaktního modelu přímo závislé na geometrii vtlačovací sondy a nesoulad mezi charakteristikami hrotu a povrchu vzorku může vést k nepřesnostem27, 65, 66, 67, 68. Zdůrazňují se některé nedávné práce Spencera a kol., které zdůrazňují faktory, které je třeba vzít v úvahu při charakterizaci měkkých polymerních kartáčů pomocí nanoindentační metody CP-AFM. Uvádějí, že zadržování viskózní tekutiny v polymerních kartáčích v závislosti na rychlosti vede ke zvýšení zatížení hlavy, a tedy k různým měřením vlastností závislých na rychlosti30,69,70,71.
V této studii jsme charakterizovali povrchový modul ultraměkkého, vysoce elastického materiálu lehfilcon A CL pomocí modifikované metody AFM nanoindentace. Vzhledem k vlastnostem a nové struktuře tohoto materiálu je rozsah citlivosti tradiční metody vtlačování zjevně nedostatečný k charakterizaci modulu tohoto extrémně měkkého materiálu, proto je nutné použít metodu AFM nanoindentace s vyšší a nižší úrovní citlivosti. Po přezkoumání nedostatků a problémů stávajících technik koloidní AFM nanoindentace ukazujeme, proč jsme zvolili menší, na míru navrženou AFM sondu, abychom eliminovali citlivost, šum pozadí, přesně určili bod kontaktu, změřili modul rychlosti měkkých heterogenních materiálů, jako je závislost na retenci tekutin, a dosáhli přesné kvantifikace. Kromě toho jsme byli schopni přesně změřit tvar a rozměry vtlačovacího hrotu, což nám umožnilo použít model kuželo-koule k určení modulu pružnosti bez posouzení kontaktní plochy hrotu s materiálem. Dva implicitní předpoklady, které jsou v této práci kvantifikovány, jsou plně elastické vlastnosti materiálu a modul nezávislý na hloubce vtlačení. Touto metodou jsme nejprve testovali ultraměkké standardy se známým modulem pro kvantifikaci metody a poté jsme tuto metodu použili k charakterizaci povrchů dvou různých materiálů kontaktních čoček. Očekává se, že tato metoda charakterizace povrchů AFM nanoindentace se zvýšenou citlivostí bude použitelná pro širokou škálu biomimetických heterogenních ultraměkkých materiálů s potenciálním využitím v lékařských zařízeních a biomedicínských aplikacích.
Pro nanoindentační experimenty byly vybrány kontaktní čočky Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) a jejich silikon-hydrogelové substráty. V experimentu byl použit speciálně navržený bajonet čočky. Pro instalaci a testování byla čočka opatrně umístěna na kopulovitý stojan, přičemž bylo zajištěno, že se dovnitř nedostanou žádné vzduchové bubliny, a poté byla upevněna okraji. Otvor v úchytu v horní části držáku čočky umožňuje přístup k optickému středu čočky pro nanoindentační experimenty a zároveň drží kapalinu na místě. Tím jsou čočky plně hydratované. Jako testovací roztok bylo použito 500 μl roztoku na balení kontaktních čoček. Pro ověření kvantitativních výsledků byly připraveny komerčně dostupné neaktivované polyakrylamidové (PAAM) hydrogely z kompozice polyakrylamid-ko-methylen-bisakrylamid (100 mm Petriho misky Petrisoft, Matrigen, Irvine, CA, USA) se známým modulem pružnosti 1 kPa. Na rozhraní hydrogelu AFM a sondy kápněte 4–5 kapek (přibližně 125 µl) fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS od společnosti Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) a 1 kapku roztoku na kontaktní čočky OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA).
Vzorky substrátů Lehfilcon A CL a SiHy byly vizualizovány pomocí systému FEI Quanta 250 Field Emission Skenovací elektronový mikroskop (FEG SEM) vybaveného detektorem pro skenovací transmisní elektronový mikroskop (STEM). Pro přípravu vzorků byly čočky nejprve promyty vodou a nařezány na klínky ve tvaru koláče. Pro dosažení diferenciálního kontrastu mezi hydrofilní a hydrofobní složkou vzorků byl jako barvivo použit 0,10% stabilizovaný roztok RuO4, do kterého byly vzorky ponořeny na 30 minut. Barvení RuO4 s lehfilcon A CL je důležité nejen pro dosažení lepšího diferenciálního kontrastu, ale také pomáhá zachovat strukturu rozvětvených polymerních kartáčů v jejich původní podobě, které jsou pak viditelné na STEM snímcích. Poté byly promyty a dehydratovány v sérii směsí ethanolu a vody se zvyšující se koncentrací ethanolu. Vzorky byly následně odlity epoxidem EMBed 812/Araldite, který vytvrzoval přes noc při 70 °C. Vzorky získané polymerací pryskyřice byly nařezány ultramikrotomem a výsledné tenké řezy byly vizualizovány pomocí STEM detektoru v režimu nízkého vakua při urychlovacím napětí 30 kV. Stejný SEM systém byl použit pro podrobnou charakterizaci AFM sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). SEM snímky AFM sondy byly pořízeny v typickém režimu vysokého vakua s urychlovacím napětím 30 kV. Snímky byly pořízeny z různých úhlů a zvětšení, aby se zaznamenaly všechny detaily tvaru a velikosti hrotu AFM sondy. Všechny rozměry hrotu, které jsou na snímcích zajímavé, byly změřeny digitálně.
Pro vizualizaci a nanoindentaci vzorků lehfilcon A CL, SiHy substrátu a hydrogelu PAAm byl použit atomární silový mikroskop Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) s režimem „PeakForce QNM in Fluid“. Pro zobrazovací experimenty byla použita sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) s nominálním poloměrem hrotu 1 nm pro pořízení snímků vzorku s vysokým rozlišením při skenovací frekvenci 0,50 Hz. Všechny snímky byly pořízeny ve vodném roztoku.
Experimenty s AFM nanoindentací byly provedeny s použitím sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). Sonda AFM má křemíkový hrot na nitridové konzole o tloušťce 345 nm, délce 54 µm a šířce 4,5 µm s rezonanční frekvencí 45 kHz. Je speciálně navržena pro charakterizaci a provádění kvantitativních nanomechanických měření na měkkých biologických vzorcích. Senzory jsou individuálně kalibrovány ve výrobě s předkalibrovaným nastavením pružin. Pružinové konstanty sond použitých v této studii byly v rozmezí 0,05–0,1 N/m. Pro přesné určení tvaru a velikosti hrotu byla sonda detailně charakterizována pomocí SEM. Na obr. Obrázek 1a ukazuje snímek sondy PFQNM-LC-A-CAL s vysokým rozlišením a nízkým zvětšením, který poskytuje ucelený pohled na konstrukci sondy. Na obr. 1b ukazuje zvětšený pohled na horní část hrotu sondy, který poskytuje informace o tvaru a velikosti hrotu. Na krajním konci má jehla tvar polokoule o průměru přibližně 140 nm (obr. 1c). Pod touto oblastí se hrot zužuje do kuželovitého tvaru a dosahuje naměřené délky přibližně 500 nm. Mimo zužující se oblast je hrot válcový a končí celkovou délkou hrotu 1,18 µm. Toto je hlavní funkční část hrotu sondy. Kromě toho byla pro testování jako koloidní sonda použita také velká sférická polystyrenová (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) s průměrem hrotu 45 µm a konstantou pružiny 2 N/m. Pro srovnání byla použita sonda PFQNM-LC-A-CAL 140 nm.
Bylo hlášeno, že během nanoindentace může být mezi AFM sondou a polymerní kartáčovou strukturou zachycena kapalina, která bude vyvíjet sílu směřující nahoru na AFM sondu ještě předtím, než se skutečně dotkne povrchu69. Tento viskózní extruzní efekt v důsledku zadržování tekutiny může změnit zdánlivý bod kontaktu, a tím ovlivnit měření modulu povrchu. Pro studium vlivu geometrie sondy a rychlosti vtlačování na retenci tekutiny byly vyneseny křivky síly vtlačování pro vzorky lehfilcon A CL s použitím sondy o průměru 140 nm při konstantních rychlostech posuvu 1 µm/s a 2 µm/s. Průměr sondy 45 µm, fixní nastavení síly 6 nN bylo dosaženo při rychlosti 1 µm/s. Experimenty se sondou o průměru 140 nm byly provedeny při rychlosti vtlačování 1 µm/s a nastavené síle 300 pN, zvolené tak, aby vytvořila kontaktní tlak ve fyziologickém rozsahu (1–8 kPa) horního víčka. tlak 72. Měkké hotové vzorky hydrogelu PAA s tlakem 1 kPa byly testovány na vtlačnou sílu 50 pN při rychlosti 1 μm/s pomocí sondy o průměru 140 nm.
Vzhledem k tomu, že délka kuželové části hrotu sondy PFQNM-LC-A-CAL je přibližně 500 nm, lze pro jakoukoli hloubku vtlačení < 500 nm bezpečně předpokládat, že geometrie sondy během vtlačování zůstane věrná svému kuželovému tvaru. Kromě toho se předpokládá, že povrch testovaného materiálu bude vykazovat reverzibilní elastickou odezvu, což bude také potvrzeno v následujících částech. Proto jsme v závislosti na tvaru a velikosti hrotu zvolili pro zpracování našich AFM nanoindentačních experimentů (NanoScope) model přizpůsobení kužel-koule vyvinutý Briscoem, Sebastianem a Adamsem, který je k dispozici v softwaru dodavatele. Software pro analýzu separačních dat, Bruker) 73. Model popisuje vztah síla-posun F(δ) pro kužel se sférickou vrcholovou vadou. Na obr. Obrázek 2 znázorňuje geometrii kontaktu během interakce tuhého kužele s kulovým hrotem, kde R je poloměr kulového hrotu, a je kontaktní poloměr, b je kontaktní poloměr na konci kulového hrotu, δ je kontaktní poloměr. θ je hloubka vtlačení, poloviční úhel kužele. SEM snímek této sondy jasně ukazuje, že kulový hrot o průměru 140 nm tečně přechází do kužele, takže zde je b definováno pouze prostřednictvím R, tj. b = R cos θ. Software dodaný dodavatelem poskytuje vztah kužel-koule pro výpočet hodnot Youngova modulu (E) z dat o separaci sil za předpokladu a > b. Vztah:
kde F je vtlačovací síla, E je Youngův modul pružnosti, ν je Poissonův poměr. Kontaktní poloměr a lze odhadnout pomocí:
Schéma kontaktní geometrie tuhého kužele s kulovým hrotem vtlačeným do materiálu kontaktní čočky Lefilcon s povrchovou vrstvou rozvětvených polymerních kartáčků.
Pokud a ≤ b, vztah se redukuje na rovnici pro konvenční kulový vtlačovací tělísko;
Domníváme se, že interakce vpichovací sondy s rozvětvenou strukturou polymerního kartáče PMPC způsobí, že kontaktní poloměr a bude větší než sférický kontaktní poloměr b. Proto jsme pro všechna kvantitativní měření modulu pružnosti provedená v této studii použili závislost získanou pro případ a > b.
Ultraměkké biomimetické materiály studované v této studii byly komplexně zobrazeny pomocí rastrovací transmisní elektronové mikroskopie (STEM) průřezu vzorku a mikroskopie atomárních sil (AFM) povrchu. Tato detailní charakterizace povrchu byla provedena jako rozšíření naší dříve publikované práce, ve které jsme zjistili, že dynamicky rozvětvená polymerní kartáčová struktura povrchu PMPC-modifikovaného lehfilconu A CL vykazuje podobné mechanické vlastnosti jako nativní tkáň rohovky 14. Z tohoto důvodu označujeme povrchy kontaktních čoček jako biomimetické materiály 14. Na obr. 3a,b jsou znázorněny průřezy rozvětvenými polymerními kartáčovými strukturami PMPC na povrchu substrátu lehfilconu A CL a neošetřeného SiHy substrátu. Povrchy obou vzorků byly dále analyzovány pomocí AFM snímků s vysokým rozlišením, které dále potvrdily výsledky STEM analýzy (obr. 3c, d). Dohromady tyto snímky poskytují přibližnou délku rozvětvené polymerní kartáčové struktury PMPC při 300–400 nm, což je klíčové pro interpretaci měření AFM nanoindentace. Dalším klíčovým pozorováním z obrázků je, že celková povrchová struktura biomimetického materiálu CL se morfologicky liší od struktury substrátového materiálu SiHy. Tento rozdíl v jejich povrchové morfologii se může projevit během jejich mechanické interakce s vtlačovací AFM sondou a následně v naměřených hodnotách modulu.
Průřezové STEM snímky (a) substrátu lehfilcon A CL a (b) SiHy. Měřítko, 500 nm. AFM snímky povrchu substrátu lehfilcon A CL (c) a základního SiHy substrátu (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirované polymery a polymerní kartáčové struktury jsou ze své podstaty měkké a byly široce studovány a používány v různých biomedicínských aplikacích74,75,76,77. Proto je důležité používat metodu AFM nanoindentace, která dokáže přesně a spolehlivě měřit jejich mechanické vlastnosti. Zároveň však jedinečné vlastnosti těchto ultraměkkých materiálů, jako je extrémně nízký modul pružnosti, vysoký obsah kapaliny a vysoká elasticita, často ztěžují výběr správného materiálu, tvaru a velikosti vtlačovací sondy. To je důležité, aby vtlačovací těleso nepropichovalo měkký povrch vzorku, což by vedlo k chybám při určování bodu kontaktu s povrchem a plochy kontaktu.
Pro tento účel je nezbytné komplexní pochopení morfologie ultraměkkých biomimetických materiálů (lehfilcon A CL). Informace o velikosti a struktuře rozvětvených polymerních kartáčů získané zobrazovací metodou poskytují základ pro mechanickou charakterizaci povrchu pomocí technik AFM nanoindentace. Místo sférických koloidních sond o mikronové velikosti jsme zvolili sondu z nitridu křemíku PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) s průměrem hrotu 140 nm, speciálně navrženou pro kvantitativní mapování mechanických vlastností biologických vzorků 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Důvod pro použití relativně ostrých sond ve srovnání s konvenčními koloidními sondami lze vysvětlit strukturními vlastnostmi materiálu. Porovnáním velikosti hrotu sondy (~140 nm) s rozvětvenými polymerními kartáči na povrchu CL lehfilcon A, znázorněnými na obr. 3a, lze usoudit, že hrot je dostatečně velký, aby se dostal do přímého kontaktu s těmito kartáčovými strukturami, což snižuje pravděpodobnost, že je hrot prorazí. Pro ilustraci tohoto bodu je na Obr. 4 znázorněn STEM snímek lehfilconu A CL a vtlačovacího hrotu AFM sondy (nakresleno v měřítku).
Schéma znázorňující STEM snímek lehfilconu A CL a vtlačovací sondy ACM (nakresleno v měřítku).
Velikost hrotu 140 nm je navíc dostatečně malá, aby se zabránilo riziku účinků lepkavé extruze, které byly dříve hlášeny u polymerních kartáčů vyrobených metodou nanoindentace CP-AFM69,71. Předpokládáme, že vzhledem ke speciálnímu kuželově kulovitému tvaru a relativně malé velikosti tohoto hrotu AFM (obr. 1) nebude povaha křivky síly generované nanoindentací lehfilcon A CL záviset na rychlosti vtlačování ani na rychlosti vkládání/vykládání. Proto není ovlivněna poroelastickými efekty. Pro ověření této hypotézy byly vzorky lehfilcon A CL vtlačovány pevnou maximální silou pomocí sondy PFQNM-LC-A-CAL, ale dvěma různými rychlostmi, a výsledné křivky tahové a zatahovací síly byly použity k vynesení síly (nN) v odstupu (µm) jak je znázorněno na obrázku 5a. Je zřejmé, že křivky síly během zatěžování a odtěžování se zcela překrývají a neexistuje žádný jasný důkaz o tom, že by se smyková síla při nulové hloubce vtlačení zvyšovala s rychlostí vtlačování na obrázku, což naznačuje, že jednotlivé kartáčové prvky byly charakterizovány bez poroelastického efektu. Naproti tomu jsou účinky zadržování tekutin (viskózní extruze a poroelasticity) patrné u AFM sondy o průměru 45 µm při stejné rychlosti vtlačování a jsou zdůrazněny hysterezí mezi křivkami roztažení a zatažení, jak je znázorněno na obrázku 5b. Tyto výsledky podporují hypotézu a naznačují, že sondy o průměru 140 nm jsou dobrou volbou pro charakterizaci takových měkkých povrchů.
Křivky vtlačovací síly lehfilcon A CL s použitím ACM; (a) s použitím sondy o průměru 140 nm při dvou rychlostech zatěžování, demonstrující absenci poroelastického efektu během povrchového vtlačování; (b) s použitím sond o průměru 45 µm a 140 nm. s ukazují účinky viskózní extruze a poroelasticity u velkých sond ve srovnání s menšími sondami.
Pro charakterizaci ultraměkkých povrchů musí mít metody AFM nanoindentace nejlepší sondu pro studium vlastností studovaného materiálu. Kromě tvaru a velikosti hrotu hraje důležitou roli při určování přesnosti a spolehlivosti nanoindentačních měření citlivost AFM detektorového systému, citlivost na vychýlení hrotu v testovacím prostředí a tuhost konzoly. Pro náš AFM systém je limit detekce polohově citlivého detektoru (PSD) přibližně 0,5 mV a je založen na předkalibrované tuhosti pružiny a vypočítané citlivosti sondy PFQNM-LC-A-CAL na vychýlení kapaliny, která odpovídá teoretické citlivosti na zatížení. Tato metoda proto umožňuje měření minimální vtlačovací síly ≤ 0,1 pN bez jakékoli periferní šumové složky. Pro AFM systém je však téměř nemožné snížit periferní šum na tuto úroveň kvůli faktorům, jako jsou mechanické vibrace a dynamika tekutin. Tyto faktory omezují celkovou citlivost metody AFM nanoindentace a také vedou k signálu šumu pozadí přibližně ≤ 10 pN. Pro charakterizaci povrchu byly vzorky substrátů lehfilcon A CL a SiHy vtlačeny za plně hydratovaných podmínek pomocí 140 nm sondy pro SEM charakterizaci a výsledné silové křivky byly superponovány mezi silou (pN) a tlakem. Separační graf (µm) je znázorněn na obrázku 6a. Ve srovnání se základním substrátem SiHy ukazuje silová křivka lehfilcon A CL jasně přechodovou fázi začínající v bodě kontaktu s vidlicovitým polymerním kartáčem a končící ostrou změnou sklonu, která označuje kontakt hrotu s podkladovým materiálem. Tato přechodová část silové křivky zdůrazňuje skutečně elastické chování rozvětveného polymerního kartáče na povrchu, o čemž svědčí kompresní křivka těsně sledující křivku napětí a kontrast v mechanických vlastnostech mezi strukturou kartáče a objemným SiHy materiálem. Při porovnání lefilconu. Separace průměrné délky rozvětveného polymerního kartáče na STEM snímku PCS (obr. 3a) a jeho silová křivka podél osy x na obr. 3a. Obrázek 6a ukazuje, že metoda je schopna detekovat špičku a rozvětvený polymer dosahující až na samý vrchol povrchu. Kontakt mezi kartáčovými strukturami. Kromě toho těsné překrývání silových křivek neznamená žádný efekt zadržování kapaliny. V tomto případě neexistuje absolutně žádná adheze mezi jehlou a povrchem vzorku. Nejvyšší části silových křivek obou vzorků se překrývají, což odráží podobnost mechanických vlastností substrátových materiálů.
(a) Křivky síly AFM nanoindentační pro substráty lehfilcon A CL a substráty SiHy, (b) křivky síly znázorňující odhad kontaktního bodu pomocí metody prahu šumu pozadí.
Aby bylo možné studovat jemnější detaily křivky síly, je na obr. 6b znovu vynesena křivka napětí vzorku lehfilcon A CL s maximální silou 50 pN podél osy y. Tento graf poskytuje důležité informace o původním šumu pozadí. Šum je v rozsahu ±10 pN, což se používá k přesnému určení kontaktního bodu a výpočtu hloubky vtisku. Jak je uváděno v literatuře, identifikace kontaktních bodů je zásadní pro přesné posouzení materiálových vlastností, jako je modul85. Přístup zahrnující automatické zpracování dat křivky síly ukázal lepší shodu mezi fitováním dat a kvantitativními měřeními pro měkké materiály86. V této práci je náš výběr kontaktních bodů relativně jednoduchý a objektivní, ale má svá omezení. Náš konzervativní přístup k určení kontaktního bodu může vést k mírně nadhodnoceným hodnotám modulu pro menší hloubky vtisku (< 100 nm). Použití algoritmické detekce kontaktních bodů a automatizovaného zpracování dat by mohlo být v budoucnu pokračováním této práce s cílem dále zlepšit naši metodu. Pro vnitřní šum pozadí řádově ±10 pN tedy definujeme kontaktní bod jako první datový bod na ose x na obrázku 6b s hodnotou ≥10 pN. Poté, v souladu s prahovou hodnotou šumu 10 pN, svislá čára na úrovni ~0,27 µm označuje bod kontaktu s povrchem, po kterém křivka natahování pokračuje, dokud substrát nedosáhne hloubky vtisku ~270 nm. Je zajímavé, že na základě velikosti rozvětvených polymerních kartáčových struktur (300–400 nm) měřené zobrazovací metodou je hloubka vtisku vzorku CL lehfilcon A pozorovaná metodou prahové hodnoty šumu pozadí přibližně 270 nm, což je velmi blízké velikosti měření pomocí STEM. Tyto výsledky dále potvrzují kompatibilitu a použitelnost tvaru a velikosti hrotu sondy AFM pro vtisknutí této velmi měkké a vysoce elastické rozvětvené polymerní kartáčové struktury. Tato data také poskytují silný důkaz na podporu naší metody použití šumu pozadí jako prahové hodnoty pro přesné určení kontaktních bodů. Veškeré kvantitativní výsledky získané z matematického modelování a fitování křivky síly by tedy měly být relativně přesné.
Kvantitativní měření metodami AFM nanoindentace jsou zcela závislá na matematických modelech použitých pro výběr dat a následnou analýzu. Proto je důležité před volbou konkrétního modelu zvážit všechny faktory související s výběrem vtlačovacího tělesa, vlastnostmi materiálu a mechanikou jejich interakce. V tomto případě byla geometrie hrotu pečlivě charakterizována pomocí SEM mikrofotografií (obr. 1) a na základě výsledků je AFM nanoindentační sonda o průměru 140 nm s tvrdým kuželem a kulovou geometrií hrotu dobrou volbou pro charakterizaci vzorků lehfilcon A CL79. Dalším důležitým faktorem, který je třeba pečlivě vyhodnotit, je elasticita testovaného polymerního materiálu. Ačkoli počáteční data nanoindentace (obr. 5a a 6a) jasně naznačují znaky překrývání křivek napětí a tlaku, tj. úplné elastické zotavení materiálu, je nesmírně důležité potvrdit čistě elastickou povahu kontaktů. Za tímto účelem byly provedeny dva po sobě jdoucí vtisky na stejném místě na povrchu vzorku lehfilcon A CL rychlostí vtisku 1 µm/s za podmínek plné hydratace. Výsledná data křivky síly jsou znázorněna na obr. 7 a jak se očekávalo, křivky roztažnosti a komprese obou výtisků jsou téměř identické, což zdůrazňuje vysokou elasticitu rozvětvené polymerní kartáčové struktury.
Dvě křivky vtlačovací síly na stejném místě na povrchu čočky lehfilcon A CL ukazují ideální elasticitu povrchu čočky.
Na základě informací získaných ze SEM a STEM snímků hrotu sondy a povrchu lehfilcon A CL je kuželo-sférický model rozumnou matematickou reprezentací interakce mezi hrotem AFM sondy a testovaným měkkým polymerním materiálem. Kromě toho u tohoto kuželo-sférického modelu platí základní předpoklady o elastických vlastnostech otiskovaného materiálu i pro tento nový biomimetický materiál a používají se ke kvantifikaci modulu pružnosti.
Po komplexním vyhodnocení metody AFM nanoindentace a jejích složek, včetně vlastností vtlačovací sondy (tvar, velikost a tuhost pružiny), citlivosti (šum pozadí a odhad kontaktního bodu) a modelů pro fitování dat (kvantitativní měření modulu), byla tato metoda použita k charakterizaci komerčně dostupných ultraměkkých vzorků za účelem ověření kvantitativních výsledků. Komerční polyakrylamidový (PAAM) hydrogel s modulem pružnosti 1 kPa byl testován za hydratovaných podmínek pomocí sondy o velikosti 140 nm. Podrobnosti o testování modulů a výpočtech jsou uvedeny v doplňkových informacích. Výsledky ukázaly, že průměrný naměřený modul byl 0,92 kPa a %RSD a procentuální (%) odchylka od známého modulu byly menší než 10 %. Tyto výsledky potvrzují přesnost a reprodukovatelnost metody AFM nanoindentace použité v této práci k měření modulů ultraměkkých materiálů. Povrchy vzorků lehfilcon A CL a základního substrátu SiHy byly dále charakterizovány stejnou metodou AFM nanoindentace za účelem studia zdánlivého kontaktního modulu ultraměkkého povrchu v závislosti na hloubce vtisku. Pro tři vzorky každého typu (n = 3; jeden vtisk na vzorek) při síle 300 pN, rychlosti 1 µm/s a plné hydrataci byly generovány separační křivky vtlačné síly. Křivka rozdělení vtlačné síly byla aproximována pomocí kuželo-koule. Pro získání modulu závislého na hloubce vtisku byla nastavena 40 nm široká část křivky síly v každém kroku 20 nm počínaje bodem kontaktu a v každém kroku křivky síly byly naměřeny hodnoty modulu. Spin Cy a kol. Podobný přístup byl použit k charakterizaci gradientu modulu polymerních kartáčů z poly(laurylmethakrylátu) (P12MA) pomocí koloidní AFM nanoindentace sondou a jsou v souladu s daty získanými pomocí Hertzova kontaktního modelu. Tento přístup poskytuje graf zdánlivého kontaktního modulu (kPa) v závislosti na hloubce vtlačení (nm), jak je znázorněno na obrázku 8, který ilustruje gradient zdánlivého kontaktního modulu/hloubky. Vypočítaný modul pružnosti vzorku CL lehfilcon A je v rozmezí 2–3 kPa v horních 100 nm vzorku, za kterým se s hloubkou začíná zvyšovat. Na druhou stranu, při testování substrátu SiHy bez kartáčovitého filmu na povrchu je maximální dosažená hloubka vtlačení při síle 300 pN menší než 50 nm a hodnota modulu získaná z dat je přibližně 400 kPa, což je srovnatelné s hodnotami Youngova modulu pro sypké materiály.
Zdánlivý kontaktní modul (kPa) vs. hloubka vtlačení (nm) pro substráty lehfilcon A CL a SiHy s použitím metody AFM nanoindentace s geometrií kužel-koule pro měření modulu.
Nejvyšší povrch nové biomimetické rozvětvené polymerní kartáčové struktury vykazuje extrémně nízký modul pružnosti (2–3 kPa). To odpovídá volně visícímu konci vidlicového polymerního kartáče, jak je znázorněno na snímku STEM. I když existují určité důkazy o gradientu modulu na vnějším okraji CL, hlavní substrát s vysokým modulem je vlivnější. Horních 100 nm povrchu se však nachází do 20 % celkové délky rozvětveného polymerního kartáče, takže je rozumné předpokládat, že naměřené hodnoty modulu v tomto rozsahu hloubky vtlačení jsou relativně přesné a nezávisí silně na vlivu spodního objektu.
Vzhledem k unikátnímu biomimetickému designu kontaktních čoček lehfilcon A, které se skládají z rozvětvených kartáčových struktur z polymeru PMPC naroubovaných na povrch SiHy substrátů, je velmi obtížné spolehlivě charakterizovat mechanické vlastnosti jejich povrchových struktur pomocí tradičních metod měření. Zde představujeme pokročilou metodu AFM nanoindentace pro přesnou charakterizaci ultraměkkých materiálů, jako je lefilcon A, s vysokým obsahem vody a extrémně vysokou elasticitou. Tato metoda je založena na použití AFM sondy, jejíž velikost a geometrie hrotu jsou pečlivě zvoleny tak, aby odpovídaly strukturálním rozměrům ultraměkkých povrchových prvků, které mají být otištěny. Tato kombinace rozměrů mezi sondou a strukturou poskytuje zvýšenou citlivost, která nám umožňuje měřit nízký modul pružnosti a inherentní elastické vlastnosti rozvětvených polymerních kartáčových prvků bez ohledu na poroelastické efekty. Výsledky ukázaly, že unikátní rozvětvené kartáčové struktury z polymeru PMPC charakteristické pro povrch čočky měly extrémně nízký modul pružnosti (až 2 kPa) a velmi vysokou elasticitu (téměř 100 %) při testování ve vodném prostředí. Výsledky AFM nanoindentace nám také umožnily charakterizovat zdánlivý gradient kontaktního modulu/hloubky (30 kPa/200 nm) povrchu biomimetické čočky. Tento gradient může být způsoben rozdílem modulů mezi rozvětvenými polymerními kartáči a substrátem SiHy, nebo rozvětvenou strukturou/hustotou polymerních kartáčů, či jejich kombinací. Pro plné pochopení vztahu mezi strukturou a vlastnostmi, zejména vlivu větvení kartáčů na mechanické vlastnosti, jsou však zapotřebí další hloubkové studie. Podobná měření mohou pomoci charakterizovat mechanické vlastnosti povrchu jiných ultraměkkých materiálů a zdravotnických prostředků.
Datové soubory generované a/nebo analyzované během aktuální studie jsou k dispozici u příslušných autorů na základě přiměřené žádosti.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. a Haugen, HJ Biologické reakce na fyzikální a chemické vlastnosti povrchů biomateriálů. Chemical society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM a Liu, X. Zlepšení biomateriálů lidského původu pro tkáňové inženýrství. programování. polymer. věda. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. a kol. Návrh, klinické využití a imunitní odpověď biomateriálů v regenerativní medicíně. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK a Farr GM Vylepšená metoda pro stanovení tvrdosti a modulu pružnosti pomocí vtlačovacích experimentů s měřením zatížení a posunutí. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historické počátky zkoušení tvrdosti vtiskováním. alma mater. the science. technologies. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Měření tvrdosti vtisknutím v makro-, mikro- a nanoměřítku: Kritický přehled. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD a Clapperich, SM Chyby v detekci povrchu vedou k nadhodnocení modulu pružnosti při nanoindentaci měkkých materiálů. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR a Yahya M.Yu. Vyhodnocení metody nanoindentace pro stanovení mechanických vlastností heterogenních nanokompozitů s využitím experimentálních a výpočetních metod. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR a Owart, TS Mechanická charakterizace měkkých viskoelastických gelů pomocí vtlačování a optimalizační inverzní analýzy konečných prvků. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J a Chaneler D. Optimalizace stanovení viskoelasticity pomocí kompatibilních měřicích systémů. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. a Pellillo, E. Nanoindentace polymerních povrchů. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. a Van Vliet KJ Charakterizace viskoelastických mechanických vlastností vysoce elastických polymerů a biologických tkání pomocí rázového vtlačování. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Vyhodnocení modulu pružnosti a adhezní práce měkkých materiálů s využitím rozšířené metody Borodich-Galanov (BG) a hlubokého vtlačování. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. a kol. Nanoměřítková morfologie a mechanické vlastnosti biomimetických polymerních povrchů silikon-hydrogelových kontaktních čoček. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).