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Cù u sviluppu di novi materiali ultra-morbidi per i dispositivi medichi è l'applicazioni biomediche, a caratterizazione cumpleta di e so proprietà fisiche è meccaniche hè à tempu impurtante è sfida. Una tecnica di nanoindentazione di microscopia à forza atomica (AFM) mudificata hè stata applicata per caratterizà u modulu superficiale estremamente bassu di a nova lente à cuntattu in silicone idrogel biomimetica lehfilcon A rivestita cù un stratu di strutture di spazzola polimerica ramificata. Stu metudu permette una determinazione precisa di i punti di cuntattu senza l'effetti di l'estrusione viscosa quandu si avvicina à polimeri ramificati. Inoltre, rende pussibule determinà e caratteristiche meccaniche di i singoli elementi di spazzola senza l'effettu di a poroelasticità. Questu hè ottenutu selezziunendu una sonda AFM cù un design (dimensione di a punta, geometria è velocità di a molla) chì hè particularmente adatta per misurà e proprietà di materiali morbidi è campioni biologichi. Stu metudu migliora a sensibilità è a precisione per una misurazione precisa di u materiale assai morbidu lehfilcon A, chì hà un modulu di elasticità estremamente bassu nantu à a superficia (finu à 2 kPa) è una elasticità estremamente alta in l'ambiente acquoso internu (quasi 100%). I risultati di u studiu di a superficia ùn anu micca solu rivelatu e proprietà di a superficia ultra-morbida di a lente lehfilcon A, ma anu ancu dimustratu chì u modulu di e spazzole di polimeru ramificatu era paragunabile à quellu di u sustratu di siliciu-idrogenu. Sta tecnica di caratterizazione di a superficia pò esse applicata à altri materiali ultra-morbidi è dispositivi medichi.
E proprietà meccaniche di i materiali cuncepiti per u cuntattu direttu cù i tessuti viventi sò spessu determinate da l'ambiente biologicu. A currispundenza perfetta di queste proprietà di u materiale aiuta à ottene e caratteristiche cliniche desiderate di u materiale senza causà risposte cellulari avverse1,2,3. Per i materiali omogenei in massa, a caratterizazione di e proprietà meccaniche hè relativamente faciule per via di a dispunibilità di procedure è metudi di prova standard (per esempiu, microindentazione4,5,6). Tuttavia, per i materiali ultra-morbidi cum'è gel, idrogel, biopolimeri, cellule viventi, ecc., questi metudi di prova ùn sò generalmente applicabili per via di limitazioni di risoluzione di misurazione è di l'inomogeneità di certi materiali7. Annantu à l'anni, i metudi tradiziunali di indentazione sò stati mudificati è adattati per caratterizà una vasta gamma di materiali morbidi, ma parechji metudi soffrenu sempre di gravi carenze chì limitanu u so usu8,9,10,11,12,13. A mancanza di metudi di prova specializati chì ponu caratterizà in modu precisu è affidabile e proprietà meccaniche di i materiali supermorbidi è di i strati superficiali limita severamente u so usu in varie applicazioni.
In u nostru travagliu precedente, avemu introduttu a lente à cuntattu lehfilcon A (CL), un materiale eterogeneu dolce cù tutte e proprietà di superficia ultra-morbida derivate da disinni potenzialmente biomimetici ispirati da a superficia di a cornea di l'ochju. Stu biomateriale hè statu sviluppatu innestendu un stratu polimericu ramificatu è reticolatu di poli(2-metacriloilossietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) nantu à un idrogel di silicone (SiHy) 15 cuncipitu per dispositivi medichi basati nantu à. Stu prucessu d'innestu crea un stratu nantu à a superficia custituitu da una struttura di spazzola polimerica ramificata assai dolce è altamente elastica. U nostru travagliu precedente hà cunfirmatu chì a struttura biomimetica di lehfilcon A CL furnisce proprietà di superficia superiori cum'è una migliore prevenzione di bagnatura è incrostazioni, una maggiore lubricità è una ridotta adesione cellulare è batterica15,16. Inoltre, l'usu è u sviluppu di stu materiale biomimeticu suggerisce ancu un'ulteriore espansione à altri dispositivi biomedicali. Dunque, hè cruciale di caratterizà e proprietà superficiali di questu materiale ultra-morbido è di capisce a so interazione meccanica cù l'ochju per creà una basa di cunniscenza cumpleta per sustene i sviluppi è l'applicazioni futuri. A maiò parte di e lenti a cuntattu SiHy dispunibili in cummerciu sò cumposte da una mistura omogenea di polimeri idrofili è idrofobi chì formanu una struttura di materiale uniforme17. Parechji studii sò stati realizati per investigà e so proprietà meccaniche utilizendu i metudi tradiziunali di prova di compressione, trazione è microindentazione18,19,20,21. Tuttavia, u novu disignu biomimeticu di lehfilcon A CL ne face un materiale eterogeneu unicu in u quale e proprietà meccaniche di e strutture di spazzola polimerica ramificata differiscenu significativamente da quelle di u sustratu di basa SiHy. Dunque, hè assai difficiule di quantificà accuratamente queste proprietà utilizendu i metudi cunvenziunali è di indentazione. Un metudu promettente utilizza u metudu di prova di nanoindentazione implementatu in a microscopia di forza atomica (AFM), un metudu chì hè statu utilizatu per determinà e proprietà meccaniche di materiali viscoelastici morbidi cum'è cellule è tessuti biologichi, è ancu polimeri morbidi22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. In a nanoindentazione AFM, i fundamenti di i testi di nanoindentazione sò cumminati cù l'ultimi avanzamenti in a tecnulugia AFM per furnisce una maggiore sensibilità di misurazione è testi di una vasta gamma di materiali intrinsecamente super morbidi31,32,33,34,35,36. Inoltre, a tecnulugia offre altri vantaghji impurtanti per via di l'usu di diverse geometrie, indentatore è sonda, è a pussibilità di fà testi in diversi mezzi liquidi.
A nanoindentazione AFM pò esse divisa cundiziunalmente in trè cumpunenti principali: (1) apparecchiature (sensori, rilevatori, sonde, ecc.); (2) parametri di misurazione (cum'è forza, spustamentu, velocità, dimensione di a rampa, ecc.); (3) Trasfurmazione di dati (currezzione di basa, stima di u puntu di cuntattu, adattamentu di dati, modellazione, ecc.). Un prublema significativu cù questu metudu hè chì parechji studii in a literatura chì utilizanu a nanoindentazione AFM riportanu risultati quantitativi assai diversi per u listessu tipu di campione/cellula/materiale37,38,39,40,41. Per esempiu, Lekka et al. L'influenza di a geometria di a sonda AFM nantu à u modulu di Young misuratu di campioni di idrogel meccanicamente omogeneu è cellule eterogenee hè stata studiata è paragunata. Riportanu chì i valori di u modulu dipendenu assai da a selezzione di u cantilever è da a forma di a punta, cù u valore più altu per una sonda à forma di piramide è u valore più bassu di 42 per una sonda sferica. In listessu modu, Selhuber-Unkel et al. Hè statu dimustratu cumu a velocità di l'indentatore, a dimensione di l'indentatore è u spessore di i campioni di poliacrilamide (PAAM) affettanu u modulu di Young misuratu da a nanoindentazione ACM43. Un altru fattore cumplicante hè a mancanza di materiali di prova standard à modulu estremamente bassu è di procedure di prova gratuite. Questu rende assai difficiule ottene risultati precisi cun fiducia. Tuttavia, u metudu hè assai utile per misurazioni relative è valutazioni comparative trà tipi di campioni simili, per esempiu aduprendu a nanoindentazione AFM per distingue e cellule nurmali da e cellule cancerose 44, 45.
Quandu si testanu materiali morbidi cù a nanoindentazione AFM, una regula generale hè di utilizà una sonda cù una bassa costante di elasticità (k) chì currisponde strettamente à u modulu di u campione è una punta emisferica/tonda in modu chì a prima sonda ùn perfori micca e superfici di u campione à u primu cuntattu cù materiali morbidi. Hè ancu impurtante chì u signale di deflessione generatu da a sonda sia abbastanza forte per esse rilevatu da u sistema di rilevatore laser24,34,46,47. In u casu di cellule, tessuti è gel eterogenei ultra-morbidi, un'altra sfida hè di superà a forza adesiva trà a sonda è a superficia di u campione per assicurà misurazioni riproducibili è affidabili48,49,50. Finu à pocu tempu fà, a maiò parte di u travagliu nantu à a nanoindentazione AFM si hè cuncentratu nantu à u studiu di u cumpurtamentu meccanicu di e cellule biologiche, tessuti, gel, idrogel è biomolecule utilizendu sonde sferiche relativamente grande, comunemente chjamate sonde colloidali (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Queste punte anu un raghju da 1 à 50 µm è sò cumunamente fatte di vetru borosilicatu, polimetilmetacrilatu (PMMA), polistirene (PS), diossidu di siliciu (SiO2) è carbone simile à u diamante (DLC). Ancu s'è a nanoindentazione CP-AFM hè spessu a prima scelta per a caratterizazione di campioni morbidi, hà i so prublemi è limitazioni. L'usu di punte sferiche di dimensioni micron aumenta l'area di cuntattu tutale di a punta cù u campione è risulta in una perdita significativa di risoluzione spaziale. Per campioni morbidi è inomogenei, induve e proprietà meccaniche di l'elementi lucali ponu differisce significativamente da a media nantu à una area più larga, l'indentazione CP pò ammuccià qualsiasi inomogeneità in e proprietà à scala lucale52. E sonde colloidali sò tipicamente fatte attaccendu sfere colloidali di dimensioni micron à cantilever senza punta utilizendu adesivi epossidichi. U prucessu di fabricazione stessu hè pienu di parechji prublemi è pò purtà à incongruenze in u prucessu di calibrazione di a sonda. Inoltre, a dimensione è a massa di e particelle colloidali affettanu direttamente i principali parametri di calibrazione di u cantilever, cum'è a frequenza di risonanza, a rigidità di a molla è a sensibilità di deflessione56,57,58. Cusì, i metudi cumunimenti usati per e sonde AFM convenzionali, cum'è a calibrazione di a temperatura, ùn ponu micca furnisce una calibrazione precisa per CP, è altri metudi ponu esse richiesti per eseguisce queste correzioni57, 59, 60, 61. L'esperimenti tipici di indentazione CP utilizanu cantilever di grande deviazione per studià e proprietà di campioni morbidi, ciò chì crea un altru prublema quandu si calibra u cumpurtamentu non lineare di u cantilever à deviazioni relativamente grandi62,63,64. I metudi muderni di indentazione di a sonda colloidale di solitu tenenu contu di a geometria di u cantilever utilizatu per calibrà a sonda, ma ignoranu l'influenza di e particelle colloidali, ciò chì crea incertezza supplementaria in a precisione di u metudu38,61. In listessu modu, i moduli elastichi calculati da l'adattamentu di u mudellu di cuntattu dipendenu direttamente da a geometria di a sonda d'indentazione, è a discrepanza trà e caratteristiche di a punta è di a superficia di u campione pò purtà à inaccuratezze27, 65, 66, 67, 68. Alcuni travagli recenti di Spencer et al. I fattori chì devenu esse presi in contu quandu si caratterizanu e spazzole di polimeri morbidi utilizendu u metudu di nanoindentazione CP-AFM sò messi in risaltu. Anu signalatu chì a ritenzione di un fluidu viscosu in e spazzole di polimeri in funzione di a velocità si traduce in un aumentu di u caricu di a testa è dunque in diverse misurazioni di e proprietà dipendenti da a velocità30,69,70,71.
In questu studiu, avemu carattarizatu u modulu superficiale di u materiale ultra-dolce altamente elasticu lehfilcon A CL utilizendu un metudu di nanoindentazione AFM mudificatu. Date e proprietà è a nova struttura di questu materiale, a gamma di sensibilità di u metudu di indentazione tradiziunale hè chjaramente insufficiente per carattarizà u modulu di questu materiale estremamente dolce, dunque hè necessariu aduprà un metudu di nanoindentazione AFM cù una sensibilità più alta è un livellu di sensibilità più bassu. Dopu avè esaminatu i difetti è i prublemi di e tecniche di nanoindentazione di a sonda AFM colloidale esistenti, mostremu perchè avemu sceltu una sonda AFM più chjuca è cuncipita apposta per eliminà a sensibilità, u rumore di fondu, individuà u puntu di cuntattu, misurà u modulu di velocità di materiali eterogenei morbidi cum'è a dipendenza da a ritenzione di fluidi è una quantificazione precisa. Inoltre, simu stati capaci di misurà precisamente a forma è e dimensioni di a punta di indentazione, chì ci permette di utilizà u mudellu di adattazione conu-sfera per determinà u modulu di elasticità senza valutà l'area di cuntattu di a punta cù u materiale. E duie ipotesi implicite chì sò quantificate in questu travagliu sò e proprietà di u materiale cumpletamente elasticu è u modulu indipendente da a prufundità di indentazione. Cù stu metudu, avemu prima testatu standard ultra-soft cù un modulu cunnisciutu per quantificà u metudu, è dopu avemu utilizatu stu metudu per caratterizà e superfici di dui materiali di lenti a cuntattu diversi. Stu metudu di caratterizà e superfici di nanoindentazione AFM cù una sensibilità aumentata hè previstu per esse applicabile à una vasta gamma di materiali ultra-soft eterogenei biomimetici cù un usu putenziale in dispositivi medichi è applicazioni biomediche.
E lenti a cuntattu Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) è i so substrati di silicone idrogel sò stati scelti per l'esperimenti di nanoindentazione. Un supportu di lente appositamente cuncipitu hè statu utilizatu in l'esperimentu. Per installà a lente per a prova, hè stata piazzata cù cura nantu à u supportu in forma di cupola, assicurendusi chì ùn ci fussinu bolle d'aria à l'internu, è poi fissata cù i bordi. Un foru in u supportu in cima à u supportu di a lente furnisce l'accessu à u centru otticu di a lente per l'esperimenti di nanoindentazione mentre mantene u liquidu in u so postu. Questu mantene e lenti cumpletamente idratate. 500 μl di soluzione di imballaggio di lenti a cuntattu sò stati utilizati cum'è soluzione di prova. Per verificà i risultati quantitativi, l'idrogel di poliacrilamide non attivata (PAAM) dispunibili in cummerciu sò stati preparati da una cumpusizione di poliacrilamide-co-metilene-bisacrilamide (capsule di Petri Petrisoft da 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, USA), un modulu elasticu cunnisciutu di 1 kPa. Aduprate 4-5 gocce (circa 125 µl) di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS da Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) è 1 goccia di soluzione per lenti a contatto OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA). ) à l'interfaccia AFM idrogel-sonda.
Campioni di substrati Lehfilcon A CL è SiHy sò stati visualizati cù un sistema di microscopiu elettronicu à scansione à emissione di campu FEI Quanta 250 (FEG SEM) equipatu cù un detector di microscopiu elettronicu à scansione à trasmissione (STEM). Per preparà i campioni, e lenti sò state prima lavate cù acqua è tagliate in cunei in forma di torta. Per ottene un cuntrastu differenziale trà i cumpunenti idrofili è idrofobi di i campioni, hè stata aduprata una soluzione stabilizzata à 0,10% di RuO4 cum'è colorante, in a quale i campioni sò stati immersi per 30 minuti. A culurazione lehfilcon A CL RuO4 hè impurtante micca solu per ottene un cuntrastu differenziale miglioratu, ma aiuta ancu à priservà a struttura di e spazzole polimeriche ramificate in a so forma originale, chì sò poi visibili nantu à l'imaghjini STEM. Sò stati poi lavati è disidratati in una serie di miscele etanolu/acqua cù una concentrazione crescente di etanolu. I campioni sò stati poi colati cù resina epossidica EMBed 812/Araldite, chì hè stata polimerizzata durante a notte à 70°C. I blocchi di campioni ottenuti per polimerizazione di resina sò stati tagliati cù un ultramicrotomu, è e sezioni fini risultanti sò state visualizate cù un rilevatore STEM in modalità à bassu vuoto à una tensione di accelerazione di 30 kV. U listessu sistema SEM hè statu utilizatu per a caratterizazione dettagliata di a sonda AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA). L'imaghjini SEM di a sonda AFM sò state ottenute in una tipica modalità à altu vuoto cù una tensione di accelerazione di 30 kV. Acquisite imaghjini à diversi anguli è ingrandimenti per registrà tutti i dettagli di a forma è a dimensione di a punta di a sonda AFM. Tutte e dimensioni di a punta d'interessu in l'imaghjini sò state misurate digitalmente.
Un microscopiu à forza atomica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) cù a modalità "PeakForce QNM in Fluid" hè statu utilizatu per visualizà è nanoindentà campioni di lehfilcon A CL, substratu SiHy è idrogel PAAm. Per l'esperimenti d'imaghjini, una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) cù un raghju nominale di punta di 1 nm hè stata utilizata per catturà immagini à alta risoluzione di u campione à una velocità di scansione di 0,50 Hz. Tutte l'imaghjini sò state scattate in soluzione acquosa.
L'esperimenti di nanoindentazione AFM sò stati realizati cù una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). A sonda AFM hà una punta di silicone nantu à un cantilever di nitruru di 345 nm di spessore, 54 µm di lunghezza è 4,5 µm di larghezza cù una frequenza di risonanza di 45 kHz. Hè specificamente cuncipita per caratterizà è realizà misurazioni nanomeccaniche quantitative nantu à campioni biologichi morbidi. I sensori sò calibrati individualmente in fabbrica cù impostazioni di molla precalibrate. E custanti di molla di e sonde aduprate in questu studiu eranu in l'intervallu di 0,05-0,1 N/m. Per determinà accuratamente a forma è a dimensione di a punta, a sonda hè stata caratterizata in dettagliu cù SEM. In a figura 1a mostra una micrografia elettronica à scansione à alta risoluzione è bassu ingrandimentu di a sonda PFQNM-LC-A-CAL, chì furnisce una vista olistica di u disignu di a sonda. In a figura 1b mostra una vista ingrandita di a cima di a punta di a sonda, chì furnisce informazioni nantu à a forma è a dimensione di a punta. À l'estremità, l'agulla hè un emisferu di circa 140 nm di diametru (Fig. 1c). Sottu à questu, a punta si assottiglia in una forma cònica, righjunghjendu una lunghezza misurata di circa 500 nm. Fora di a regione assottigliata, a punta hè cilindrica è termina in una lunghezza totale di a punta di 1,18 µm. Questa hè a parte funzionale principale di a punta di a sonda. Inoltre, una grande sonda sferica di polistirene (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) cù un diametru di punta di 45 µm è una costante di elasticità di 2 N/m hè stata ancu aduprata per a prova cum'è sonda colloidale. cù a sonda PFQNM-LC-A-CAL 140 nm per paragone.
Hè statu signalatu chì u liquidu pò esse intrappulatu trà a sonda AFM è a struttura di a spazzola polimerica durante a nanoindentazione, chì esercerà una forza ascendente nantu à a sonda AFM prima ch'ella tocchi effettivamente a superficia69. Questu effettu di estrusione viscosa per via di a ritenzione di fluidi pò cambià u puntu di cuntattu apparente, affettendu cusì e misurazioni di u modulu di a superficia. Per studià l'effettu di a geometria di a sonda è di a velocità di indentazione nantu à a ritenzione di fluidi, e curve di forza di indentazione sò state tracciate per i campioni di lehfilcon A CL utilizendu una sonda di 140 nm di diametru à velocità di spustamentu custanti di 1 µm/s è 2 µm/s. diametru di a sonda 45 µm, impostazione di forza fissa 6 nN ottenuta à 1 µm/s. Esperimenti cù una sonda di 140 nm di diametru sò stati realizati à una velocità di indentazione di 1 µm/s è una forza impostata di 300 pN, scelta per creà una pressione di cuntattu in l'intervallu fisiologicu (1-8 kPa) di a palpebra superiore. pressione 72. Campioni morbidi pronti di PAA idrogel cù una pressione di 1 kPa sò stati testati per una forza di indentazione di 50 pN à una velocità di 1 μm/s utilizendu una sonda cù un diametru di 140 nm.
Siccomu a lunghezza di a parte cunica di a punta di a sonda PFQNM-LC-A-CAL hè di circa 500 nm, per ogni prufundità d'indentazione < 500 nm si pò suppone cun sicurezza chì a geometria di a sonda durante l'indentazione resterà fidele à a so forma di conu. Inoltre, si suppone chì a superficia di u materiale sottu prova mostrerà una risposta elastica reversibile, chì serà ancu cunfirmata in e sezioni seguenti. Dunque, secondu a forma è a dimensione di a punta, avemu sceltu u mudellu di adattamentu conu-sfera sviluppatu da Briscoe, Sebastian è Adams, chì hè dispunibule in u software di u venditore, per processà i nostri esperimenti di nanoindentazione AFM (NanoScope). Software d'analisi di dati di separazione, Bruker) 73. U mudellu descrive a relazione forza-spostamentu F(δ) per un conu cù un difettu d'apice sfericu. In fig. A figura 2 mostra a geometria di cuntattu durante l'interazzione di un conu rigidu cù una punta sferica, induve R hè u raghju di a punta sferica, a hè u raghju di cuntattu, b hè u raghju di cuntattu à a fine di a punta sferica, δ hè u raghju di cuntattu. prufundità di indentazione, θ hè u mezu angulu di u conu. L'imagine SEM di sta sonda mostra chjaramente chì a punta sferica di 140 nm di diametru si fonde tangenzialmente in un conu, dunque quì b hè definitu solu per mezu di R, vale à dì b = R cos θ. U software furnitu da u venditore furnisce una relazione conu-sfera per calculà i valori di u modulu di Young (E) da i dati di separazione di forza assumendu a > b. Relazione:
induve F hè a forza d'indentazione, E hè u modulu di Young, ν hè u rapportu di Poisson. U raghju di cuntattu a pò esse stimatu aduprendu:
Schema di a geometria di cuntattu di un conu rigidu cù una punta sferica pressata in u materiale di una lente di cuntattu Lefilcon cù un stratu superficiale di spazzole polimeriche ramificate.
Sè a ≤ b, a relazione si riduce à l'equazione per un indentatore sfericu cunvinziunale;
Credemu chì l'interazione di a sonda d'indentazione cù a struttura ramificata di a spazzola di polimeru PMPC farà chì u raghju di cuntattu a sia più grande di u raghju di cuntattu sfericu b. Dunque, per tutte e misurazioni quantitative di u modulu elasticu realizate in questu studiu, avemu utilizatu a dipendenza ottenuta per u casu a > b.
I materiali biomimetici ultramorbidi studiati in questu studiu sò stati imaghjinati in modu cumpletu utilizendu a microscopia elettronica à trasmissione à scansione (STEM) di a sezione trasversale di u campione è a microscopia à forza atomica (AFM) di a superficia. Questa caratterizazione dettagliata di a superficia hè stata realizata cum'è una estensione di u nostru travagliu publicatu prima, in u quale avemu determinatu chì a struttura di spazzola polimerica ramificata dinamicamente di a superficia di lehfilcon A CL mudificata da PMPC presentava proprietà meccaniche simili à u tissutu corneale nativu 14. Per questa ragione, ci riferemu à e superfici di lenti a cuntattu cum'è materiali biomimetici 14. In a figura 3a,b mostranu sezioni trasversali di strutture di spazzola polimerica PMPC ramificate nantu à a superficia di un substratu di lehfilcon A CL è un substratu di SiHy micca trattatu, rispettivamente. E superfici di i dui campioni sò state ulteriormente analizzate utilizendu immagini AFM ad alta risoluzione, chì anu cunfirmatu ulteriormente i risultati di l'analisi STEM (Fig. 3c, d). Pigliate inseme, queste immagini danu una lunghezza apprussimativa di a struttura di spazzola polimerica ramificata PMPC à 300-400 nm, chì hè critica per l'interpretazione di e misurazioni di nanoindentazione AFM. Un'altra osservazione chjave derivata da l'imagine hè chì a struttura superficiale generale di u materiale biomimeticu CL hè morfologicamente diversa da quella di u materiale di substratu SiHy. Sta differenza in a so morfologia superficiale pò diventà evidente durante a so interazione meccanica cù a sonda AFM di indentazione è successivamente in i valori di modulu misurati.
Imagine STEM trasversali di (a) lehfilcon A CL è (b) substratu SiHy. Barra di scala, 500 nm. Imagine AFM di a superficia di u substratu lehfilcon A CL (c) è di u substratu di basa SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
I polimeri bioispirati è e strutture di spazzole polimeriche sò intrinsecamente morbidi è sò stati ampiamente studiati è aduprati in varie applicazioni biomediche74,75,76,77. Dunque, hè impurtante aduprà u metudu di nanoindentazione AFM, chì pò misurà in modu precisu è affidabile e so proprietà meccaniche. Ma à u listessu tempu, e proprietà uniche di questi materiali ultra-morbidi, cum'è un modulu elasticu estremamente bassu, un altu cuntenutu di liquidu è un'alta elasticità, rendenu spessu difficiule a scelta di u materiale, a forma è a dimensione adatti di a sonda di indentazione. Questu hè impurtante affinchì l'indentatore ùn perfori micca a superficia morbida di u campione, ciò chì porterebbe à errori in a determinazione di u puntu di cuntattu cù a superficia è l'area di cuntattu.
Per questu, una cunniscenza cumpleta di a morfologia di i materiali biomimetici ultra-morbidi (lehfilcon A CL) hè essenziale. L'infurmazioni nantu à a dimensione è a struttura di e spazzole polimeriche ramificate ottenute cù u metudu d'imaghjini furniscenu a basa per a caratterizazione meccanica di a superficia utilizendu tecniche di nanoindentazione AFM. Invece di sonde colloidali sferiche di dimensioni microniche, avemu sceltu a sonda di nitruro di siliciu PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) cù un diametru di punta di 140 nm, appositamente cuncipita per a mappatura quantitativa di e proprietà meccaniche di campioni biologichi 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. A logica per l'usu di sonde relativamente affilate paragunate à e sonde colloidali convenzionali pò esse spiegata da e caratteristiche strutturali di u materiale. Cumparandu a dimensione di a punta di a sonda (~140 nm) cù e spazzole di polimeru ramificatu nantu à a superficia di CL lehfilcon A, mostrata in Fig. 3a, si pò cunclude chì a punta hè abbastanza grande per vene in cuntattu direttu cù queste strutture di spazzole, ciò chì riduce a pussibilità chì a punta li penetri. Per illustrà questu puntu, in Fig. 4 hè una maghjina STEM di u lehfilcon A CL è a punta indentante di a sonda AFM (disegnata in scala).
Schema chì mostra l'imagine STEM di lehfilcon A CL è una sonda d'indentazione ACM (disegnata à scala).
Inoltre, a dimensione di a punta di 140 nm hè abbastanza chjuca per evità u risicu di qualsiasi di l'effetti di estrusione appiccicosa riportati prima per e spazzole polimeriche prodotte da u metudu di nanoindentazione CP-AFM69,71. Supponemu chì per via di a forma conica speciale è a dimensione relativamente chjuca di sta punta AFM (Fig. 1), a natura di a curva di forza generata da a nanoindentazione lehfilcon A CL ùn dipenderà micca da a velocità di indentazione o da a velocità di carica/scaricamentu. Dunque, ùn hè micca affettata da effetti poroelastici. Per pruvà sta ipotesi, i campioni di lehfilcon A CL sò stati indentati à una forza massima fissa utilizendu una sonda PFQNM-LC-A-CAL, ma à duie velocità diverse, è e curve di forza di trazione è retrazione risultanti sò state aduprate per tracciare a forza (nN) in separazione (µm) hè mostrata in a Figura 5a. Hè chjaru chì e curve di forza durante u caricamentu è u scaricamentu si sovrapponenu cumpletamente, è ùn ci hè nisuna prova chjara chì a forza di taglio à prufundità d'indentazione zero aumenta cù a velocità d'indentazione in a figura, ciò chì suggerisce chì l'elementi individuali di a spazzola sò stati caratterizati senza un effettu poroelasticu. In cuntrastu, l'effetti di ritenzione di fluidi (estrusione viscosa è effetti di poroelasticità) sò evidenti per a sonda AFM di 45 µm di diametru à a listessa velocità d'indentazione è sò evidenziati da l'isteresi trà e curve di stiramentu è di retrazione, cum'è mostratu in a Figura 5b. Quessi risultati sustenenu l'ipotesi è suggeriscenu chì e sonde di 140 nm di diametru sò una bona scelta per caratterizà tali superfici morbide.
Curve di forza d'indentazione lehfilcon A CL cù ACM; (a) cù una sonda cù un diametru di 140 nm à duie velocità di carica, dimustrendu l'assenza di un effettu poroelasticu durante l'indentazione superficiale; (b) cù sonde cù un diametru di 45 µm è 140 nm. s mostranu l'effetti di l'estrusione viscosa è di a poroelasticità per e sonde grande paragunate à e sonde più chjuche.
Per caratterizà e superfici ultramorbide, i metudi di nanoindentazione AFM devenu avè a megliu sonda per studià e proprietà di u materiale in studiu. In più di a forma è a dimensione di a punta, a sensibilità di u sistema di rilevatore AFM, a sensibilità à a deflessione di a punta in l'ambiente di prova è a rigidità di u cantilever ghjocanu un rolu impurtante in a determinazione di a precisione è di l'affidabilità di e misurazioni di nanoindentazione. Per u nostru sistema AFM, u limite di rilevazione di u Rivelatore Sensibile à a Posizione (PSD) hè di circa 0,5 mV è hè basatu annantu à a velocità di a molla precalibrata è a sensibilità di deflessione di u fluidu calculata di a sonda PFQNM-LC-A-CAL, chì currisponde à a sensibilità teorica di u caricu. hè menu di 0,1 pN. Dunque, questu metudu permette a misurazione di una forza minima di indentazione ≤ 0,1 pN senza alcuna cumpunente di rumore perifericu. Tuttavia, hè guasi impussibile per un sistema AFM di riduce u rumore perifericu à questu livellu per via di fattori cum'è a vibrazione meccanica è a dinamica di i fluidi. Questi fattori limitanu a sensibilità generale di u metudu di nanoindentazione AFM è risultanu ancu in un segnale di rumore di fondu di circa ≤ 10 pN. Per a caratterizazione di a superficia, i campioni di substratu lehfilcon A CL è SiHy sò stati indentati in cundizioni cumpletamente idratate utilizendu una sonda di 140 nm per a caratterizazione SEM, è e curve di forza risultanti sò state sovrapposte trà a forza (pN) è a pressione. U graficu di separazione (µm) hè mostratu in a Figura 6a. Paragunatu à u substratu di basa SiHy, a curva di forza lehfilcon A CL mostra chjaramente una fase di transizione chì principia à u puntu di cuntattu cù a spazzola polimerica bifurcata è finisce cù un cambiamentu bruscu in a pendenza chì marca u cuntattu di a punta cù u materiale sottostante. Questa parte di transizione di a curva di forza mette in risaltu u cumpurtamentu veramente elasticu di a spazzola polimerica ramificata nantu à a superficia, cum'è evidenziatu da a curva di compressione chì seguita da vicinu a curva di tensione è u cuntrastu in e proprietà meccaniche trà a struttura di a spazzola è u materiale SiHy ingombrante. Quandu si paraguna lefilcon. A separazione di a lunghezza media di una spazzola di polimeru ramificatu in l'imagine STEM di u PCS (Fig. 3a) è a so curva di forza longu l'ascissa in Fig. 3a. 6a mostra chì u metudu hè capace di rilevà a punta è u polimeru ramificatu chì righjunghjenu a cima di a superficia. Cuntattu trà e strutture di a spazzola. Inoltre, una stretta sovrapposizione di e curve di forza ùn indica alcun effettu di ritenzione di liquidu. In questu casu, ùn ci hè assolutamente nisuna adesione trà l'agulla è a superficia di u campione. E sezzioni più alte di e curve di forza per i dui campioni si sovrappongono, riflettendu a similitudine di e proprietà meccaniche di i materiali di u substratu.
(a) Curve di forza di nanoindentazione AFM per substrati di lehfilcon A CL è substrati di SiHy, (b) curve di forza chì mostranu a stima di u puntu di cuntattu utilizendu u metudu di a soglia di rumore di fondu.
Per studià i dettagli più fini di a curva di forza, a curva di tensione di u campione lehfilcon A CL hè tracciata di novu in Fig. 6b cù una forza massima di 50 pN longu l'asse y. Stu graficu furnisce informazioni impurtanti nantu à u rumore di fondu originale. U rumore hè in l'intervallu di ±10 pN, chì hè adupratu per determinà accuratamente u puntu di cuntattu è calculà a prufundità di indentazione. Cum'è riportatu in a literatura, l'identificazione di i punti di cuntattu hè critica per valutà accuratamente e proprietà di i materiali cum'è u modulu85. Un approcciu chì implica l'elaborazione automatica di i dati di a curva di forza hà mostratu una migliore adattazione trà l'adattamentu di i dati è e misurazioni quantitative per i materiali morbidi86. In questu travagliu, a nostra scelta di punti di cuntattu hè relativamente simplice è obiettiva, ma hà i so limiti. U nostru approcciu cunservatore per determinà u puntu di cuntattu pò risultà in valori di modulu ligeramente sovrastimati per prufundità di indentazione più chjuche (<100 nm). L'usu di a rilevazione di punti di cuntattu basata nantu à algoritmi è l'elaborazione automatizata di i dati puderia esse una continuazione di questu travagliu in u futuru per migliurà ulteriormente u nostru metudu. Cusì, per un rumore di fondu intrinsecu di l'ordine di ±10 pN, definimu u puntu di cuntattu cum'è u primu puntu di dati nantu à l'asse x in a Figura 6b cù un valore di ≥10 pN. Dopu, in cunfurmità cù a soglia di rumore di 10 pN, una linea verticale à u livellu di ~0,27 µm marca u puntu di cuntattu cù a superficia, dopu à quale a curva di stiramentu cuntinueghja finu à chì u sustratu scontra a prufundità di indentazione di ~270 nm. Hè interessante nutà chì, basatu annantu à a dimensione di e caratteristiche di a spazzola polimerica ramificata (300-400 nm) misurate cù u metudu di imaging, a prufundità di indentazione di u campione CL lehfilcon A osservatu cù u metudu di a soglia di rumore di fondu hè di circa 270 nm, chì hè assai vicinu à a dimensione di misurazione cù STEM. Quessi risultati cunfermanu ulteriormente a cumpatibilità è l'applicabilità di a forma è di a dimensione di a punta di a sonda AFM per l'indentazione di sta struttura di spazzola polimerica ramificata assai dolce è altamente elastica. Quessi dati furniscenu ancu una forte evidenza per sustene u nostru metudu di utilizà u rumore di fondu cum'è soglia per individuà i punti di cuntattu. Cusì, qualsiasi risultatu quantitativu ottenutu da a modelizazione matematica è l'adattamentu di a curva di forza deve esse relativamente precisu.
E misurazioni quantitative per mezu di i metudi di nanoindentazione AFM sò cumpletamente dipendenti da i mudelli matematichi utilizati per a selezzione di i dati è l'analisi successiva. Dunque, hè impurtante cunsiderà tutti i fattori ligati à a scelta di l'indentatore, e proprietà di u materiale è a meccanica di a so interazione prima di sceglie un mudellu particulare. In questu casu, a geometria di a punta hè stata attentamente caratterizata utilizendu micrografie SEM (Fig. 1), è in basa à i risultati, a sonda di nanoindentazione AFM di 140 nm di diametru cù un conu duru è una geometria di punta sferica hè una bona scelta per caratterizà i campioni di lehfilcon A CL79. Un altru fattore impurtante chì deve esse valutatu attentamente hè l'elasticità di u materiale polimeru chì hè testatu. Ancu s'è i dati iniziali di nanoindentazione (Fig. 5a è 6a) delineanu chjaramente e caratteristiche di a sovrapposizione di e curve di tensione è compressione, vale à dì, a cumpleta ripresa elastica di u materiale, hè estremamente impurtante cunfirmà a natura puramente elastica di i cuntatti. À questu scopu, duie indentazioni successive sò state realizate in u listessu locu nantu à a superficia di u campione di lehfilcon A CL à una velocità di indentazione di 1 µm/s in cundizioni di piena idratazione. I dati di a curva di forza risultante sò mostrati in a fig. 7 è, cum'è previstu, e curve di espansione è di cumpressione di e duie stampe sò guasi identiche, mettendu in risaltu l'alta elasticità di a struttura di a spazzola polimerica ramificata.
Dui curve di forza d'indentazione in u listessu locu nantu à a superficia di lehfilcon A CL indicanu l'elasticità ideale di a superficia di a lente.
Basatu annantu à l'infurmazioni ottenute da l'imagine SEM è STEM di a punta di a sonda è di a superficia lehfilcon A CL, rispettivamente, u mudellu conu-sfera hè una rapprisentazione matematica raghjonevule di l'interazzione trà a punta di a sonda AFM è u materiale polimericu dolce chì hè statu testatu. Inoltre, per questu mudellu conu-sfera, l'ipotesi fundamentali nantu à e proprietà elastiche di u materiale stampatu sò valide per questu novu materiale biomimeticu è sò aduprate per quantificà u modulu elasticu.
Dopu una valutazione cumpleta di u metudu di nanoindentazione AFM è di i so cumpunenti, cumprese e proprietà di a sonda di indentazione (forma, dimensione è rigidità di a molla), a sensibilità (rumore di fondu è stima di u puntu di cuntattu) è i mudelli di adattamentu di dati (misure quantitative di u modulu), u metudu hè statu utilizatu per caratterizà i campioni ultra-morbidi dispunibili in cummerciu per verificà i risultati quantitativi. Un idrogel di poliacrilamide cummerciale (PAAM) cù un modulu elasticu di 1 kPa hè statu testatu in cundizioni idratate utilizendu una sonda di 140 nm. I dettagli di e prove di u modulu è i calculi sò furniti in l'infurmazioni supplementari. I risultati anu dimustratu chì u modulu mediu misuratu era 0,92 kPa, è a deviazione %RSD è a percentuale (%) da u modulu cunnisciutu eranu menu di 10%. Quessi risultati cunfermanu l'accuratezza è a riproducibilità di u metudu di nanoindentazione AFM utilizatu in questu travagliu per misurà i moduli di materiali ultramorbidi. E superfici di i campioni lehfilcon A CL è u substratu di basa SiHy sò state ulteriormente caratterizate utilizendu u listessu metudu di nanoindentazione AFM per studià u modulu di cuntattu apparente di a superficia ultramorbida in funzione di a prufundità di indentazione. E curve di separazione di a forza di indentazione sò state generate per trè campioni di ogni tipu (n = 3; una indentazione per campione) à una forza di 300 pN, una velocità di 1 µm/s, è una idratazione cumpleta. A curva di spartera di a forza di indentazione hè stata apprussimata aduprendu un mudellu conu-sfera. Per ottene un modulu dipendente da a prufundità di indentazione, una parte di a curva di forza larga 40 nm hè stata impostata à ogni incrementu di 20 nm à partesi da u puntu di cuntattu, è i valori misurati di u modulu à ogni passu di a curva di forza. Spin Cy et al. Un approcciu simile hè statu adupratu per caratterizà u gradiente di modulu di e spazzole polimeriche di poli(lauril metacrilato) (P12MA) aduprendu a nanoindentazione di sonda AFM colloidale, è sò coerenti cù i dati chì utilizanu u mudellu di cuntattu Hertz. Questu approcciu furnisce un graficu di u modulu di cuntattu apparente (kPa) versus a prufundità di indentazione (nm), cum'è mostratu in a Figura 8, chì illustra u gradiente di modulu di cuntattu/prufundità apparente. U modulu elasticu calculatu di u campione CL lehfilcon A hè in l'intervallu di 2-3 kPa in i primi 100 nm di u campione, oltre u quale cumencia à aumentà cù a prufundità. D’altronde, quandu si prova u sustratu di basa SiHy senza una pellicola simile à una spazzola nantu à a superficia, a prufundità massima di indentazione ottenuta à una forza di 300 pN hè inferiore à 50 nm, è u valore di u modulu ottenutu da i dati hè di circa 400 kPa, chì hè paragunabile à i valori di u modulu di Young per i materiali sfusi.
Modulu di cuntattu apparente (kPa) vs. prufundità d'indentazione (nm) per substrati di lehfilcon A CL è SiHy utilizendu u metudu di nanoindentazione AFM cù geometria di sfera-conu per misurà u modulu.
A superficia superiore di a nova struttura di spazzola polimerica ramificata biomimetica presenta un modulu di elasticità estremamente bassu (2-3 kPa). Questu currisponderà à l'estremità libera pendente di a spazzola polimerica bifurcata cum'è mostratu in l'imagine STEM. Mentre ci sò alcune evidenze di un gradiente di modulu à u bordu esternu di u CL, u principale substratu à modulu altu hè più influente. Tuttavia, i primi 100 nm di a superficia sò in u 20% di a lunghezza tutale di a spazzola polimerica ramificata, dunque hè ragiunevule suppone chì i valori misurati di u modulu in questu intervallu di prufundità di indentazione sò relativamente precisi è ùn dipendenu micca assai da l'effettu di l'ughjettu inferiore.
A causa di u disignu biomimeticu unicu di e lenti a cuntattu lehfilcon A, custituite da strutture di spazzole polimeriche PMPC ramificate innestate nantu à a superficia di substrati SiHy, hè assai difficiule di caratterizà in modu affidabile e proprietà meccaniche di e so strutture superficiali utilizendu i metudi di misurazione tradiziunali. Quì presentemu un metudu avanzatu di nanoindentazione AFM per caratterizà accuratamente materiali ultra-morbidi cum'è lefilcon A cù un altu cuntenutu d'acqua è una elasticità estremamente alta. Stu metudu hè basatu annantu à l'usu di una sonda AFM chì a dimensione di a punta è a geometria sò scelte cù cura per currisponde à e dimensioni strutturali di e caratteristiche di a superficia ultra-morbida da imprime. Sta cumbinazione di dimensioni trà sonda è struttura furnisce una maggiore sensibilità, chì ci permette di misurà u modulu bassu è e proprietà elastiche inerenti di l'elementi di spazzola polimerica ramificata, indipendentemente da l'effetti poroelastici. I risultati anu dimustratu chì e spazzole polimeriche PMPC ramificate uniche caratteristiche di a superficia di a lente avianu un modulu elasticu estremamente bassu (finu à 2 kPa) è una elasticità assai alta (quasi 100%) quandu sò state testate in un ambiente acquoso. I risultati di a nanoindentazione AFM ci anu ancu permessu di caratterizà u gradiente apparente di modulu di cuntattu/prufundità (30 kPa/200 nm) di a superficia di a lente biomimetica. Stu gradiente pò esse duvutu à a differenza di modulu trà e spazzole polimeriche ramificate è u substratu SiHy, o a struttura/densità ramificata di e spazzole polimeriche, o una cumminazione di queste. Tuttavia, sò necessarii studii più approfonditi per capisce cumpletamente a relazione trà struttura è proprietà, in particulare l'effettu di a ramificazione di e spazzole nantu à e proprietà meccaniche. Misurazioni simili ponu aiutà à caratterizà e proprietà meccaniche di a superficia di altri materiali ultra-morbidi è dispositivi medichi.
I datasets generati è/o analizzati durante u studiu attuale sò dispunibili da i rispettivi autori nantu à dumanda raghjonevule.
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