Gràcies per visitar Nature.com. Esteu utilitzant una versió del navegador amb compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora. Feu servir els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora o feu servir els botons lliscants del final per moure's per tres diapositives alhora.
Amb el desenvolupament de nous materials ultrasuaus per a dispositius mèdics i aplicacions biomèdiques, la caracterització exhaustiva de les seves propietats físiques i mecàniques és important i alhora desafiant. Es va aplicar una tècnica de nanoindentació per microscòpia de força atòmica modificada (AFM) per caracteritzar el mòdul superficial extremadament baix de la nova lent de contacte biomimètica de silicona hidrogel lehfilcon A recoberta amb una capa d'estructures de raspall de polímer ramificat. Aquest mètode permet una determinació precisa dels punts de contacte sense els efectes de l'extrusió viscosa en aproximar-se a polímers ramificats. A més, permet determinar les característiques mecàniques dels elements individuals del raspall sense l'efecte de la poroelasticitat. Això s'aconsegueix seleccionant una sonda AFM amb un disseny (mida de la punta, geometria i velocitat de la molla) que és particularment adequat per mesurar les propietats de materials tous i mostres biològiques. Aquest mètode millora la sensibilitat i la precisió per a la mesura precisa del material molt tou lehfilcon A, que té un mòdul d'elasticitat extremadament baix a la superfície (fins a 2 kPa) i una elasticitat extremadament alta en l'entorn aquós intern (gairebé 100%). Els resultats de l'estudi de la superfície no només van revelar les propietats superficials ultrasuaves de la lent lehfilcon A, sinó que també van mostrar que el mòdul dels raspalls de polímer ramificat era comparable al del substrat de silici-hidrogen. Aquesta tècnica de caracterització de la superfície es pot aplicar a altres materials ultrasuaves i dispositius mèdics.
Les propietats mecàniques dels materials dissenyats per al contacte directe amb teixits vius sovint estan determinades per l'entorn biològic. La coincidència perfecta d'aquestes propietats del material ajuda a aconseguir les característiques clíniques desitjades del material sense causar respostes cel·lulars adverses1,2,3. Per a materials homogenis a granel, la caracterització de les propietats mecàniques és relativament fàcil a causa de la disponibilitat de procediments i mètodes d'assaig estàndard (per exemple, microindentació4,5,6). Tanmateix, per a materials ultra tous com ara gels, hidrogels, biopolímers, cèl·lules vives, etc., aquests mètodes d'assaig generalment no són aplicables a causa de les limitacions de resolució de mesura i la inhomogeneïtat d'alguns materials7. Al llarg dels anys, els mètodes d'indentació tradicionals s'han modificat i adaptat per caracteritzar una àmplia gamma de materials tous, però molts mètodes encara pateixen greus deficiències que limiten el seu ús8,9,10,11,12,13. La manca de mètodes d'assaig especialitzats que puguin caracteritzar amb precisió i fiabilitat les propietats mecàniques dels materials super tous i les capes superficials limita severament el seu ús en diverses aplicacions.
En el nostre treball anterior, vam introduir la lent de contacte lehfilcon A (CL), un material heterogeni suau amb totes les propietats superficials ultrasuaus derivades de dissenys potencialment biomimètics inspirats en la superfície de la còrnia de l'ull. Aquest biomaterial es va desenvolupar empeltant una capa de polímer ramificat i reticulat de poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) sobre un hidrogel de silicona (SiHy) 15 dissenyat per a dispositius mèdics basats en. Aquest procés d'empelt crea una capa a la superfície que consisteix en una estructura de raspall polimèric ramificat molt suau i altament elàstica. El nostre treball anterior ha confirmat que l'estructura biomimètica de lehfilcon A CL proporciona propietats superficials superiors, com ara una millora de la prevenció de la mulladura i la incrustació, una major lubricitat i una reducció de l'adhesió cel·lular i bacteriana 15,16. A més, l'ús i el desenvolupament d'aquest material biomimètic també suggereix una major expansió a altres dispositius biomèdics. Per tant, és fonamental caracteritzar les propietats superficials d'aquest material ultrasuau i comprendre la seva interacció mecànica amb l'ull per tal de crear una base de coneixement completa que doni suport a futurs desenvolupaments i aplicacions. La majoria de les lents de contacte de SiHy disponibles comercialment estan compostes per una barreja homogènia de polímers hidròfils i hidròfobs que formen una estructura de material uniforme17. S'han dut a terme diversos estudis per investigar les seves propietats mecàniques mitjançant mètodes tradicionals de compressió, tracció i microindentació18,19,20,21. Tanmateix, el nou disseny biomimètic del lehfilcon A CL el converteix en un material heterogeni únic en què les propietats mecàniques de les estructures de raspall de polímer ramificat difereixen significativament de les del substrat base de SiHy. Per tant, és molt difícil quantificar amb precisió aquestes propietats mitjançant mètodes convencionals i d'indentació. Un mètode prometedor utilitza el mètode de prova de nanoindentació implementat en microscòpia de força atòmica (AFM), un mètode que s'ha utilitzat per determinar les propietats mecàniques de materials viscoelàstics tous com ara cèl·lules i teixits biològics, així com polímers tous22,23,24,25. ,26,27,28,29,30. En la nanoindentació AFM, els fonaments de les proves de nanoindentació es combinen amb els darrers avenços en la tecnologia AFM per proporcionar una major sensibilitat de mesura i proves d'una àmplia gamma de materials inherentment supertous31,32,33,34,35,36. A més, la tecnologia ofereix altres avantatges importants mitjançant l'ús de diferents geometries, indentador i sonda, i la possibilitat de fer proves en diversos medis líquids.
La nanoindentació AFM es pot dividir condicionalment en tres components principals: (1) equip (sensors, detectors, sondes, etc.); (2) paràmetres de mesura (com ara força, desplaçament, velocitat, mida de la rampa, etc.); (3) processament de dades (correcció de la línia base, estimació del punt de contacte, ajust de dades, modelització, etc.). Un problema significatiu amb aquest mètode és que diversos estudis a la literatura que utilitzen la nanoindentació AFM informen de resultats quantitatius molt diferents per al mateix tipus de mostra/cèl·lula/material37,38,39,40,41. Per exemple, Lekka et al. Es va estudiar i comparar la influència de la geometria de la sonda AFM en el mòdul de Young mesurat de mostres d'hidrogel mecànicament homogeni i cèl·lules heterogènies. Informen que els valors del mòdul depenen en gran mesura de la selecció del voladís i la forma de la punta, amb el valor més alt per a una sonda en forma de piràmide i el valor més baix de 42 per a una sonda esfèrica. De la mateixa manera, Selhuber-Unkel et al. S'ha demostrat com la velocitat de l'indentador, la mida de l'indentador i el gruix de les mostres de poliacrilamida (PAAM) afecten el mòdul de Young mesurat per nanoindentació ACM43. Un altre factor que ho complica és la manca de materials de prova estàndard de mòdul extremadament baix i de procediments de prova gratuïts. Això fa que sigui molt difícil obtenir resultats precisos amb confiança. Tanmateix, el mètode és molt útil per a mesures relatives i avaluacions comparatives entre tipus de mostres similars, per exemple, utilitzant la nanoindentació AFM per distingir les cèl·lules normals de les cèl·lules canceroses 44, 45.
Quan es proven materials tous amb nanoindentació AFM, una regla general és utilitzar una sonda amb una constant de ressort (k) baixa que coincideixi estretament amb el mòdul de la mostra i una punta semiesfèrica/rodona perquè la primera sonda no perfori les superfícies de la mostra en el primer contacte amb materials tous. També és important que el senyal de desviació generat per la sonda sigui prou fort per ser detectat pel sistema de detector làser24,34,46,47. En el cas de cèl·lules, teixits i gels heterogenis ultra tous, un altre repte és superar la força adhesiva entre la sonda i la superfície de la mostra per garantir mesures reproduïbles i fiables48,49,50. Fins fa poc, la majoria del treball sobre nanoindentació AFM s'ha centrat en l'estudi del comportament mecànic de cèl·lules biològiques, teixits, gels, hidrogels i biomolècules utilitzant sondes esfèriques relativament grans, comunament anomenades sondes col·loïdals (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Aquestes puntes tenen un radi d'1 a 50 µm i solen estar fetes de vidre borosilicat, polimetacrilat de metil (PMMA), poliestirè (PS), diòxid de silici (SiO2) i carboni similar al diamant (DLC). Tot i que la nanoindentació CP-AFM sovint és la primera opció per a la caracterització de mostres toves, té els seus propis problemes i limitacions. L'ús de puntes esfèriques grans, de mida micromètrica, augmenta l'àrea de contacte total de la punta amb la mostra i provoca una pèrdua significativa de resolució espacial. Per a mostres toves i heterogènies, on les propietats mecàniques dels elements locals poden diferir significativament de la mitjana en una àrea més àmplia, la indentació CP pot ocultar qualsevol heterogeneïtat en les propietats a escala local52. Les sondes col·loïdals es fabriquen normalment unint esferes col·loïdals de mida micromètrica a voladissos sense punta mitjançant adhesius epoxi. El procés de fabricació en si està ple de molts problemes i pot provocar inconsistències en el procés de calibratge de la sonda. A més, la mida i la massa de les partícules col·loïdals afecten directament els principals paràmetres de calibratge del cantilever, com ara la freqüència de ressonància, la rigidesa de la molla i la sensibilitat a la desviació56,57,58. Per tant, els mètodes utilitzats habitualment per a les sondes AFM convencionals, com ara la calibració de la temperatura, poden no proporcionar una calibració precisa per a la CP, i poden ser necessaris altres mètodes per realitzar aquestes correccions57, 59, 60, 61. Els experiments típics d'indentació de CP utilitzen cantilever de grans desviacions per estudiar les propietats de mostres toves, cosa que crea un altre problema a l'hora de calibrar el comportament no lineal del cantilever a desviacions relativament grans62,63,64. Els mètodes moderns d'indentació de sondes col·loïdals solen tenir en compte la geometria del cantilever utilitzat per calibrar la sonda, però ignoren la influència de les partícules col·loïdals, cosa que crea una incertesa addicional en la precisió del mètode38,61. De la mateixa manera, els mòduls elàstics calculats mitjançant l'ajust del model de contacte depenen directament de la geometria de la sonda d'indentació, i la discrepància entre les característiques de la punta i la superfície de la mostra pot conduir a inexactituds27, 65, 66, 67, 68. Alguns treballs recents de Spencer et al. destaquen els factors que s'han de tenir en compte a l'hora de caracteritzar els raspalls de polímer tous mitjançant el mètode de nanoindentació CP-AFM. Van informar que la retenció d'un fluid viscós en els raspalls de polímer en funció de la velocitat provoca un augment de la càrrega del capçal i, per tant, diferents mesures de les propietats dependents de la velocitat30,69,70,71.
En aquest estudi, hem caracteritzat el mòdul superficial del material ultrasuau i altament elàstic lehfilcon A CL mitjançant un mètode de nanoindentació AFM modificat. Donades les propietats i la nova estructura d'aquest material, el rang de sensibilitat del mètode d'indentació tradicional és clarament insuficient per caracteritzar el mòdul d'aquest material extremadament suau, per la qual cosa cal utilitzar un mètode de nanoindentació AFM amb una sensibilitat més alta i un nivell de sensibilitat més baix. Després de revisar les deficiències i els problemes de les tècniques de nanoindentació de sondes AFM col·loïdals existents, mostrem per què vam triar una sonda AFM més petita i dissenyada a mida per eliminar la sensibilitat, el soroll de fons, localitzar el punt de contacte, mesurar el mòdul de velocitat de materials heterogenis tous com ara la dependència de la retenció de fluids i quantificar amb precisió. A més, vam poder mesurar amb precisió la forma i les dimensions de la punta d'indentació, cosa que ens va permetre utilitzar el model d'ajust con-esfera per determinar el mòdul d'elasticitat sense avaluar l'àrea de contacte de la punta amb el material. Les dues suposicions implícites que es quantifiquen en aquest treball són les propietats del material totalment elàstic i el mòdul independent de la profunditat d'indentació. Amb aquest mètode, primer vam provar estàndards ultra tous amb un mòdul conegut per quantificar el mètode i després vam utilitzar aquest mètode per caracteritzar les superfícies de dos materials de lents de contacte diferents. Es preveu que aquest mètode de caracterització de superfícies de nanoindentació AFM amb una sensibilitat augmentada sigui aplicable a una àmplia gamma de materials ultra tous heterogenis biomimètics amb ús potencial en dispositius mèdics i aplicacions biomèdiques.
Per als experiments de nanoindentació es van escollir lents de contacte Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EUA) i els seus substrats de silicona d'hidrogel. A l'experiment es va utilitzar una muntura de lent especialment dissenyada. Per instal·lar la lent per a la prova, es va col·locar amb cura sobre el suport en forma de cúpula, assegurant-se que no entréssin bombolles d'aire, i després es va fixar amb les vores. Un forat a la fixació a la part superior del portalents proporciona accés al centre òptic de la lent per als experiments de nanoindentació mentre manté el líquid al seu lloc. Això manté les lents completament hidratades. Es van utilitzar 500 μl de solució d'envasament de lents de contacte com a solució de prova. Per verificar els resultats quantitatius, es van preparar hidrogels de poliacrilamida no activada (PAAM) disponibles comercialment a partir d'una composició de poliacrilamida-co-metilè-bisacrilamida (plaques de Petri Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EUA), un mòdul elàstic conegut d'1 kPa. Utilitzeu 4-5 gotes (aproximadament 125 µl) de solució salina tamponada amb fosfat (PBS de Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EUA) i 1 gota de solució per a lents de contacte OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EUA) a la interfície entre l'hidrogel i la sonda de l'AFM.
Es van visualitzar mostres de substrats Lehfilcon A CL i SiHy mitjançant un sistema de microscopi electrònic d'escombratge d'emissió de camp (FEG SEM) FEI Quanta 250 equipat amb un detector de microscopi electrònic de transmissió d'escombratge (STEM). Per preparar les mostres, primer es van rentar les lents amb aigua i es van tallar en falques en forma de pastís. Per aconseguir un contrast diferencial entre els components hidròfils i hidròfobs de les mostres, es va utilitzar una solució estabilitzada al 0,10% de RuO4 com a colorant, en la qual es van submergir les mostres durant 30 minuts. La tinció de lehfilcon A CL RuO4 és important no només per aconseguir un millor contrast diferencial, sinó que també ajuda a preservar l'estructura dels raspalls de polímer ramificats en la seva forma original, que després són visibles a les imatges STEM. A continuació, es van rentar i deshidratar en una sèrie de mescles d'etanol/aigua amb una concentració d'etanol creixent. Les mostres es van colar amb epòxid EMBed 812/araldita, que es va curar durant la nit a 70 °C. Els blocs de mostra obtinguts per polimerització de resina es van tallar amb un ultramicrotom i les seccions primes resultants es van visualitzar amb un detector STEM en mode de baix buit a un voltatge d'acceleració de 30 kV. El mateix sistema SEM es va utilitzar per a la caracterització detallada de la sonda AFM PFQNM-LC-A-CAL (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA). Les imatges SEM de la sonda AFM es van obtenir en un mode típic d'alt buit amb un voltatge d'acceleració de 30 kV. Adquiriu imatges a diferents angles i augments per registrar tots els detalls de la forma i la mida de la punta de la sonda AFM. Totes les dimensions de la punta d'interès a les imatges es van mesurar digitalment.
Es va utilitzar un microscopi de força atòmica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA) amb el mode "PeakForce QNM in Fluid" per visualitzar i nanoindentar mostres de lehfilcon A CL, substrat SiHy i hidrogel PAAm. Per als experiments d'imatge, es va utilitzar una sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) amb un radi nominal de punta d'1 nm per capturar imatges d'alta resolució de la mostra a una velocitat d'escaneig de 0,50 Hz. Totes les imatges es van prendre en solució aquosa.
Els experiments de nanoindentació AFM es van dur a terme utilitzant una sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker). La sonda AFM té una punta de silici sobre un voladís de nitrur de 345 nm de gruix, 54 µm de llarg i 4,5 µm d'ample amb una freqüència de ressonància de 45 kHz. Està dissenyada específicament per caracteritzar i realitzar mesures nanomecàniques quantitatives en mostres biològiques toves. Els sensors es calibren individualment a la fàbrica amb configuracions de ressort precalibrades. Les constants de ressort de les sondes utilitzades en aquest estudi es van situar en el rang de 0,05-0,1 N/m. Per determinar amb precisió la forma i la mida de la punta, la sonda es va caracteritzar detalladament mitjançant SEM. A la figura 1a es mostra una micrografia electrònica de rastreig d'alta resolució i baix augment de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que proporciona una visió holística del disseny de la sonda. A la figura 1b es mostra una vista ampliada de la part superior de la punta de la sonda, que proporciona informació sobre la forma i la mida de la punta. A l'extrem, l'agulla és una hemisferi d'uns 140 nm de diàmetre (Fig. 1c). Per sota d'aquesta, la punta s'aprima en una forma cònica, assolint una longitud mesurada d'aproximadament 500 nm. Fora de la regió afilada, la punta és cilíndrica i acaba en una longitud total de punta d'1,18 µm. Aquesta és la part funcional principal de la punta de la sonda. A més, també es va utilitzar una sonda esfèrica gran de poliestirè (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EUA) amb un diàmetre de punta de 45 µm i una constant de ressort de 2 N/m per a proves com a sonda col·loïdal. amb una sonda PFQNM-LC-A-CAL de 140 nm per a la comparació.
S'ha informat que el líquid pot quedar atrapat entre la sonda AFM i l'estructura del raspall de polímer durant la nanoindentació, que exercirà una força ascendent sobre la sonda AFM abans que toqui realment la superfície69. Aquest efecte d'extrusió viscosa a causa de la retenció de fluids pot canviar el punt de contacte aparent, afectant així les mesures del mòdul superficial. Per estudiar l'efecte de la geometria de la sonda i la velocitat d'indentació sobre la retenció de fluids, es van representar corbes de força d'indentació per a mostres de lehfilcon A CL utilitzant una sonda de 140 nm de diàmetre a taxes de desplaçament constants d'1 µm/s i 2 µm/s. Diàmetre de la sonda de 45 µm, ajust de força fix de 6 nN aconseguit a 1 µm/s. Es van dur a terme experiments amb una sonda de 140 nm de diàmetre a una velocitat d'indentació d'1 µm/s i una força establerta de 300 pN, escollida per crear una pressió de contacte dins del rang fisiològic (1-8 kPa) de la parpella superior. pressió 72. Es van provar mostres toves ja preparades d'hidrogel PAA amb una pressió d'1 kPa per a una força d'indentació de 50 pN a una velocitat d'1 μm/s utilitzant una sonda amb un diàmetre de 140 nm.
Com que la longitud de la part cònica de la punta de la sonda PFQNM-LC-A-CAL és d'aproximadament 500 nm, per a qualsevol profunditat d'indentació < 500 nm es pot assumir amb seguretat que la geometria de la sonda durant la indentació es mantindrà fidel a la seva forma de con. A més, se suposa que la superfície del material a prova presentarà una resposta elàstica reversible, que també es confirmarà a les seccions següents. Per tant, depenent de la forma i la mida de la punta, hem triat el model d'ajust con-esfera desenvolupat per Briscoe, Sebastian i Adams, que està disponible al programari del proveïdor, per processar els nostres experiments de nanoindentació AFM (NanoScope). Programari d'anàlisi de dades de separació, Bruker) 73. El model descriu la relació força-desplaçament F(δ) per a un con amb un defecte d'àpex esfèric. A la fig. La figura 2 mostra la geometria del contacte durant la interacció d'un con rígid amb una punta esfèrica, on R és el radi de la punta esfèrica, a és el radi de contacte, b és el radi de contacte a l'extrem de la punta esfèrica, δ és la profunditat d'indentació del radi de contacte, θ és el semiangle del con. La imatge SEM d'aquesta sonda mostra clarament que la punta esfèrica de 140 nm de diàmetre es fusiona tangencialment amb un con, de manera que aquí b es defineix només a través de R, és a dir, b = R cos θ. El programari subministrat pel proveïdor proporciona una relació con-esfera per calcular els valors del mòdul de Young (E) a partir de les dades de separació de força assumint a > b. Relació:
on F és la força d'indentació, E és el mòdul de Young, ν és el coeficient de Poisson. El radi de contacte a es pot estimar mitjançant:
Esquema de la geometria de contacte d'un con rígid amb una punta esfèrica premsada al material d'una lent de contacte Lefilcon amb una capa superficial de raspalls de polímer ramificats.
Si a ≤ b, la relació es redueix a l'equació per a un indentador esfèric convencional;
Creiem que la interacció de la sonda d'indentació amb l'estructura ramificada del raspall de polímer PMPC farà que el radi de contacte a sigui més gran que el radi de contacte esfèric b. Per tant, per a totes les mesures quantitatives del mòdul elàstic realitzades en aquest estudi, hem utilitzat la dependència obtinguda per al cas a > b.
Els materials biomimètics ultra tous estudiats en aquest estudi es van obtenir imatges exhaustives mitjançant microscòpia electrònica de transmissió d'escombratge (STEM) de la secció transversal de la mostra i microscòpia de força atòmica (AFM) de la superfície. Aquesta caracterització detallada de la superfície es va dur a terme com a extensió del nostre treball publicat anteriorment, en què vam determinar que l'estructura de raspall polimèric ramificada dinàmicament de la superfície de lehfilcon A CL modificada amb PMPC presentava propietats mecàniques similars al teixit corneal natiu 14. Per aquest motiu, ens referim a les superfícies de les lents de contacte com a materials biomimètics 14. A les figures 3a i 3b es mostren seccions transversals d'estructures de raspall de polímer PMPC ramificades a la superfície d'un substrat de lehfilcon A CL i un substrat de SiHy sense tractament, respectivament. Les superfícies d'ambdues mostres es van analitzar més a fons mitjançant imatges AFM d'alta resolució, que van confirmar encara més els resultats de l'anàlisi STEM (figures 3c i 3d). En conjunt, aquestes imatges donen una longitud aproximada de l'estructura de raspall de polímer ramificat PMPC a 300-400 nm, cosa que és fonamental per interpretar les mesures de nanoindentació AFM. Una altra observació clau derivada de les imatges és que l'estructura superficial general del material biomimètic CL és morfològicament diferent de la del material de substrat SiHy. Aquesta diferència en la seva morfologia superficial pot fer-se evident durant la seva interacció mecànica amb la sonda AFM d'indentació i, posteriorment, en els valors del mòdul mesurats.
Imatges STEM de secció transversal de (a) lehfilcon A CL i (b) substrat de SiHy. Barra d'escala, 500 nm. Imatges AFM de la superfície del substrat de lehfilcon A CL (c) i del substrat base de SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Els polímers bioinspirats i les estructures de raspall de polímer són inherentment tous i han estat àmpliament estudiats i utilitzats en diverses aplicacions biomèdiques74,75,76,77. Per tant, és important utilitzar el mètode de nanoindentació AFM, que pot mesurar amb precisió i fiabilitat les seves propietats mecàniques. Però al mateix temps, les propietats úniques d'aquests materials ultra tous, com ara un mòdul elàstic extremadament baix, un alt contingut de líquid i una alta elasticitat, sovint dificulten l'elecció del material, la forma i la mida adequats de la sonda d'indentació. Això és important perquè l'indentador no perfori la superfície tova de la mostra, cosa que provocaria errors en la determinació del punt de contacte amb la superfície i l'àrea de contacte.
Per això, és essencial una comprensió completa de la morfologia dels materials biomimètics ultrasuaus (lehfilcon A CL). La informació sobre la mida i l'estructura dels raspalls de polímer ramificat obtinguts mitjançant el mètode d'imatge proporciona la base per a la caracterització mecànica de la superfície mitjançant tècniques de nanoindentació AFM. En lloc de sondes col·loïdals esfèriques de mida micrònica, vam triar la sonda de nitrur de silici PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) amb un diàmetre de punta de 140 nm, especialment dissenyada per al mapatge quantitatiu de les propietats mecàniques de mostres biològiques 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. La raó per utilitzar sondes relativament afilades en comparació amb les sondes col·loïdals convencionals es pot explicar per les característiques estructurals del material. Si comparem la mida de la punta de la sonda (~140 nm) amb els raspalls de polímer ramificats a la superfície del lehfilcon A de CL, que es mostren a la figura 3a, es pot concloure que la punta és prou gran per entrar en contacte directe amb aquestes estructures de raspall, cosa que redueix la possibilitat que la punta les travessi. Per il·lustrar aquest punt, a la figura 4 es mostra una imatge STEM del lehfilcon A CL i la punta indentadora de la sonda AFM (dibuixada a escala).
Esquema que mostra una imatge STEM del lehfilcon A CL i una sonda d'indentació ACM (dibuixada a escala).
A més, la mida de la punta de 140 nm és prou petita per evitar el risc de qualsevol dels efectes d'extrusió enganxosa descrits anteriorment per a raspalls de polímer produïts pel mètode de nanoindentació CP-AFM69,71. Suposem que, a causa de la forma con-esfèrica especial i la mida relativament petita d'aquesta punta AFM (Fig. 1), la naturalesa de la corba de força generada per la nanoindentació de lehfilcon A CL no dependrà de la velocitat d'indentació ni de la velocitat de càrrega/descàrrega. Per tant, no es veu afectada pels efectes poroelàstics. Per provar aquesta hipòtesi, es van indentar mostres de lehfilcon A CL a una força màxima fixa mitjançant una sonda PFQNM-LC-A-CAL, però a dues velocitats diferents, i les corbes de força de tracció i retracció resultants es van utilitzar per representar la força (nN) en separació (µm) que es mostra a la Figura 5a. És evident que les corbes de força durant la càrrega i la descàrrega se superposen completament, i no hi ha proves clares que la força de cisallament a una profunditat d'indentació zero augmenti amb la velocitat d'indentació a la figura, cosa que suggereix que els elements individuals del raspall es van caracteritzar sense un efecte poroelàstic. En canvi, els efectes de retenció de fluids (extrusió viscosa i efectes de poroelasticitat) són evidents per a la sonda AFM de 45 µm de diàmetre a la mateixa velocitat d'indentació i es destaquen per la histèresi entre les corbes d'estirament i retracció, com es mostra a la Figura 5b. Aquests resultats donen suport a la hipòtesi i suggereixen que les sondes de 140 nm de diàmetre són una bona opció per caracteritzar aquestes superfícies toves.
Corbes de força d'indentació de lehfilcon A CL mitjançant ACM; (a) utilitzant una sonda amb un diàmetre de 140 nm a dues velocitats de càrrega, demostrant l'absència d'un efecte poroelàstic durant la indentació superficial; (b) utilitzant sondes amb un diàmetre de 45 µm i 140 nm. Les figures mostren els efectes de l'extrusió viscosa i la poroelasticitat per a sondes grans en comparació amb sondes més petites.
Per caracteritzar superfícies ultratoves, els mètodes de nanoindentació AFM han de tenir la millor sonda per estudiar les propietats del material en estudi. A més de la forma i la mida de la punta, la sensibilitat del sistema detector AFM, la sensibilitat a la desviació de la punta en l'entorn de prova i la rigidesa del cantilever tenen un paper important a l'hora de determinar la precisió i la fiabilitat de les mesures de nanoindentació. Per al nostre sistema AFM, el límit de detecció del detector sensible a la posició (PSD) és d'aproximadament 0,5 mV i es basa en la velocitat de la molla precalibrada i la sensibilitat de desviació del fluid calculada de la sonda PFQNM-LC-A-CAL, que correspon a la sensibilitat teòrica de la càrrega, és inferior a 0,1 pN. Per tant, aquest mètode permet mesurar una força d'indentació mínima ≤ 0,1 pN sense cap component de soroll perifèric. Tanmateix, és gairebé impossible que un sistema AFM redueixi el soroll perifèric a aquest nivell a causa de factors com la vibració mecànica i la dinàmica de fluids. Aquests factors limiten la sensibilitat general del mètode de nanoindentació AFM i també donen lloc a un senyal de soroll de fons d'aproximadament ≤ 10 pN. Per a la caracterització de la superfície, les mostres de substrat de lehfilcon A CL i SiHy es van indentar en condicions completament hidratades utilitzant una sonda de 140 nm per a la caracterització SEM, i les corbes de força resultants es van superposar entre la força (pN) i la pressió. El gràfic de separació (µm) es mostra a la Figura 6a. En comparació amb el substrat base de SiHy, la corba de força de lehfilcon A CL mostra clarament una fase de transició que comença al punt de contacte amb el raspall de polímer bifurcat i acaba amb un canvi brusc en el pendent que marca el contacte de la punta amb el material subjacent. Aquesta part de transició de la corba de força destaca el comportament veritablement elàstic del raspall de polímer ramificat a la superfície, com ho demostra la corba de compressió que segueix de prop la corba de tensió i el contrast de propietats mecàniques entre l'estructura del raspall i el material SiHy voluminós. En comparar lefilcon. La separació de la longitud mitjana d'un raspall de polímer ramificat a la imatge STEM del PCS (Fig. 3a) i la seva corba de força al llarg de l'abscissa a la Fig. 3a. 6a mostra que el mètode és capaç de detectar la punta i el polímer ramificat que arriben a la part superior de la superfície. Contacte entre les estructures del raspall. A més, una estreta superposició de les corbes de força indica que no hi ha cap efecte de retenció de líquids. En aquest cas, no hi ha absolutament cap adherència entre l'agulla i la superfície de la mostra. Les seccions superiors de les corbes de força de les dues mostres se superposen, reflectint la similitud de les propietats mecàniques dels materials del substrat.
(a) Corbes de força de nanoindentació AFM per a substrats de lehfilcon A CL i substrats de SiHy, (b) corbes de força que mostren l'estimació del punt de contacte mitjançant el mètode del llindar de soroll de fons.
Per tal d'estudiar els detalls més precisos de la corba de força, la corba de tensió de la mostra lehfilcon A CL es torna a representar a la figura 6b amb una força màxima de 50 pN al llarg de l'eix y. Aquest gràfic proporciona informació important sobre el soroll de fons original. El soroll es troba en el rang de ±10 pN, que s'utilitza per determinar amb precisió el punt de contacte i calcular la profunditat d'indentació. Tal com s'informa a la literatura, la identificació dels punts de contacte és crítica per avaluar amb precisió les propietats del material, com ara el mòdul85. Un enfocament que implica el processament automàtic de dades de la corba de força ha demostrat un ajust millorat entre l'ajust de dades i les mesures quantitatives per a materials tous86. En aquest treball, la nostra elecció de punts de contacte és relativament senzilla i objectiva, però té les seves limitacions. El nostre enfocament conservador per determinar el punt de contacte pot donar lloc a valors de mòdul lleugerament sobreestimats per a profunditats d'indentació més petites (< 100 nm). L'ús de la detecció de punts de contacte basada en algoritmes i el processament automatitzat de dades podria ser una continuació d'aquest treball en el futur per millorar encara més el nostre mètode. Així, per a un soroll de fons intrínsec de l'ordre de ±10 pN, definim el punt de contacte com el primer punt de dades a l'eix x de la Figura 6b amb un valor de ≥10 pN. Aleshores, d'acord amb el llindar de soroll de 10 pN, una línia vertical al nivell de ~0,27 µm marca el punt de contacte amb la superfície, després del qual la corba d'estirament continua fins que el substrat arriba a la profunditat d'indentació de ~270 nm. Curiosament, basant-se en la mida de les característiques del raspall de polímer ramificat (300-400 nm) mesurades mitjançant el mètode d'imatge, la profunditat d'indentació de la mostra CL lehfilcon A observada mitjançant el mètode del llindar de soroll de fons és d'uns 270 nm, que és molt propera a la mida de mesura amb STEM. Aquests resultats confirmen encara més la compatibilitat i l'aplicabilitat de la forma i la mida de la punta de la sonda AFM per a la indentació d'aquesta estructura de raspall de polímer ramificat molt suau i altament elàstica. Aquestes dades també proporcionen proves sòlides per donar suport al nostre mètode d'utilitzar el soroll de fons com a llindar per localitzar punts de contacte. Per tant, qualsevol resultat quantitatiu obtingut a partir de la modelització matemàtica i l'ajust de la corba de força hauria de ser relativament precís.
Les mesures quantitatives mitjançant mètodes de nanoindentació AFM depenen completament dels models matemàtics utilitzats per a la selecció de dades i l'anàlisi posterior. Per tant, és important tenir en compte tots els factors relacionats amb l'elecció de l'indentador, les propietats del material i la mecànica de la seva interacció abans d'escollir un model concret. En aquest cas, la geometria de la punta es va caracteritzar acuradament mitjançant micrografies SEM (Fig. 1) i, basant-se en els resultats, la sonda de nanoindentació AFM de 140 nm de diàmetre amb un con dur i una geometria de punta esfèrica és una bona opció per caracteritzar mostres de lehfilcon A CL79. Un altre factor important que cal avaluar acuradament és l'elasticitat del material polimèric que s'està provant. Tot i que les dades inicials de nanoindentació (Figs. 5a i 6a) descriuen clarament les característiques de la superposició de les corbes de tensió i compressió, és a dir, la recuperació elàstica completa del material, és extremadament important confirmar la naturalesa purament elàstica dels contactes. Amb aquesta finalitat, es van realitzar dues indentacions successives al mateix lloc de la superfície de la mostra de lehfilcon A CL a una velocitat d'indentació d'1 µm/s en condicions d'hidratació completa. Les dades de la corba de força resultant es mostren a la figura 7 i, com s'esperava, les corbes d'expansió i compressió de les dues impressions són gairebé idèntiques, cosa que destaca l'alta elasticitat de l'estructura de raspall de polímer ramificat.
Dues corbes de força d'indentació al mateix lloc a la superfície de lehfilcon A CL indiquen l'elasticitat ideal de la superfície de la lent.
Basant-se en la informació obtinguda de les imatges SEM i STEM de la punta de la sonda i la superfície de lehfilcon A CL, respectivament, el model con-esfera és una representació matemàtica raonable de la interacció entre la punta de la sonda AFM i el material polimèric tou que s'està provant. A més, per a aquest model con-esfera, les suposicions fonamentals sobre les propietats elàstiques del material imprès són vàlides per a aquest nou material biomimètic i s'utilitzen per quantificar el mòdul elàstic.
Després d'una avaluació exhaustiva del mètode de nanoindentació AFM i els seus components, incloent-hi les propietats de la sonda d'indentació (forma, mida i rigidesa de la molla), la sensibilitat (soroll de fons i estimació del punt de contacte) i els models d'ajust de dades (mesures quantitatives del mòdul), es va utilitzar el mètode per caracteritzar mostres ultrasuaves disponibles comercialment per verificar els resultats quantitatius. Es va provar un hidrogel de poliacrilamida (PAAM) comercial amb un mòdul elàstic d'1 kPa en condicions hidratades utilitzant una sonda de 140 nm. Els detalls de les proves i els càlculs del mòdul es proporcionen a la informació suplementària. Els resultats van mostrar que el mòdul mitjà mesurat va ser de 0,92 kPa, i el %RSD i el percentatge (%) de desviació del mòdul conegut van ser inferiors al 10%. Aquests resultats confirmen la precisió i la reproductibilitat del mètode de nanoindentació AFM utilitzat en aquest treball per mesurar els mòduls de materials ultrasuaves. Les superfícies de les mostres de lehfilcon A CL i el substrat base de SiHy es van caracteritzar més a fons utilitzant el mateix mètode de nanoindentació AFM per estudiar el mòdul de contacte aparent de la superfície ultrasuave en funció de la profunditat d'indentació. Es van generar corbes de separació de la força d'indentació per a tres mostres de cada tipus (n = 3; una indentació per mostra) a una força de 300 pN, una velocitat d'1 µm/s i hidratació completa. La corba de repartiment de la força d'indentació es va aproximar mitjançant un model de con-esfera. Per obtenir un mòdul dependent de la profunditat d'indentació, es va establir una porció de 40 nm d'amplada de la corba de força a cada increment de 20 nm a partir del punt de contacte i es van mesurar els valors del mòdul a cada pas de la corba de força. Spin Cy et al. S'ha utilitzat un enfocament similar per caracteritzar el gradient de mòdul dels raspalls de polímer de poli(metacrilat de lauril) (P12MA) mitjançant nanoindentació de sonda AFM col·loïdal, i són consistents amb les dades que utilitzen el model de contacte de Hertz. Aquest enfocament proporciona un gràfic del mòdul de contacte aparent (kPa) versus la profunditat d'indentació (nm), com es mostra a la Figura 8, que il·lustra el gradient de mòdul/profunditat de contacte aparent. El mòdul elàstic calculat de la mostra CL lehfilcon A es troba en el rang de 2-3 kPa dins dels 100 nm superiors de la mostra, a partir del qual comença a augmentar amb la profunditat. D'altra banda, quan es prova el substrat base de SiHy sense una pel·lícula semblant a un pinzell a la superfície, la profunditat màxima d'indentació aconseguida a una força de 300 pN és inferior a 50 nm, i el valor del mòdul obtingut de les dades és d'uns 400 kPa, cosa que és comparable als valors del mòdul de Young per a materials a granel.
Mòdul de contacte aparent (kPa) vs. profunditat d'indentació (nm) per a substrats de lehfilcon A CL i SiHy utilitzant el mètode de nanoindentació AFM amb geometria de con-esfera per mesurar el mòdul.
La superfície superior de la nova estructura de raspall de polímer ramificat biomimètic presenta un mòdul d'elasticitat extremadament baix (2-3 kPa). Això coincidirà amb l'extrem lliure penjant del raspall de polímer bifurcat, tal com es mostra a la imatge STEM. Si bé hi ha alguna evidència d'un gradient de mòdul a la vora exterior del CL, el substrat principal d'alt mòdul és més influent. Tanmateix, els 100 nm superiors de la superfície es troben dins del 20% de la longitud total del raspall de polímer ramificat, per la qual cosa és raonable suposar que els valors mesurats del mòdul en aquest rang de profunditat d'indentació són relativament precisos i no depenen en gran mesura de l'efecte de l'objecte inferior.
A causa del disseny biomimètic únic de les lents de contacte lehfilcon A, que consisteixen en estructures de raspall de polímer PMPC ramificades empeltades a la superfície de substrats de SiHy, és molt difícil caracteritzar de manera fiable les propietats mecàniques de les seves estructures superficials mitjançant mètodes de mesurament tradicionals. Aquí presentem un mètode avançat de nanoindentació AFM per caracteritzar amb precisió materials ultrasuaus com el lefilcon A amb un alt contingut d'aigua i una elasticitat extremadament alta. Aquest mètode es basa en l'ús d'una sonda AFM la mida de la punta i la geometria de la qual es trien acuradament per coincidir amb les dimensions estructurals de les característiques de la superfície ultrasuaus que s'han d'imprimir. Aquesta combinació de dimensions entre la sonda i l'estructura proporciona una major sensibilitat, cosa que ens permet mesurar el mòdul baix i les propietats elàstiques inherents dels elements de raspall de polímer ramificat, independentment dels efectes poroelàstics. Els resultats van mostrar que els raspalls de polímer PMPC ramificats únics característics de la superfície de la lent tenien un mòdul elàstic extremadament baix (fins a 2 kPa) i una elasticitat molt alta (gairebé el 100%) quan es van provar en un ambient aquós. Els resultats de la nanoindentació AFM també ens van permetre caracteritzar el gradient de mòdul de contacte/profunditat aparent (30 kPa/200 nm) de la superfície de la lent biomimètica. Aquest gradient pot ser degut a la diferència de mòdul entre els raspalls de polímer ramificats i el substrat de SiHy, o a l'estructura/densitat ramificada dels raspalls de polímer, o a una combinació d'aquests factors. Tanmateix, calen estudis més exhaustius per comprendre completament la relació entre l'estructura i les propietats, especialment l'efecte de la ramificació dels raspalls sobre les propietats mecàniques. Mesures similars poden ajudar a caracteritzar les propietats mecàniques de la superfície d'altres materials ultrasuaus i dispositius mèdics.
Els conjunts de dades generats i/o analitzats durant l'estudi actual estan disponibles a través dels respectius autors si es sol·liciten de manera raonable.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Reaccions biològiques a les propietats físiques i químiques de les superfícies de biomaterials. Chemical Society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Millora de biomaterials derivats d'humans per a l'enginyeria de teixits. Programació. Polímer. La ciència. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Disseny, implementació clínica i resposta immunitària de biomaterials en medicina regenerativa. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Un mètode millorat per determinar la duresa i el mòdul elàstic mitjançant experiments d'indentació amb mesures de càrrega i desplaçament. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Orígens històrics de les proves de duresa per indentació. Alma Mater. La ciència. Tecnologies. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Mesures de duresa per indentació a macro, micro i nanoescala: una revisió crítica. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Els errors de detecció de superfícies condueixen a una sobreestimació del mòdul en la nanoindentació de materials tous. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu. Avaluació del mètode de nanoindentació per determinar les característiques mecàniques de nanocompostos heterogenis mitjançant mètodes experimentals i computacionals. the science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, i Owart, TS Caracterització mecànica de gels viscoelàstics tous mitjançant indentació i anàlisi d'elements finits inversos basada en l'optimització. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optimització de la determinació de la viscoelasticitat mitjançant sistemes de mesura compatibles. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentació de superfícies polimèriques. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Caracterització de les propietats mecàniques viscoelàstiques de polímers altament elàstics i teixits biològics mitjançant indentació de xoc. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Avaluació del mòdul elàstic i el treball d'adhesió de materials tous mitjançant el mètode Borodich-Galanov (BG) ampliat i indentació profunda. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Morfologia a nanoescala i propietats mecàniques de superfícies polimèriques biomimètiques de lents de contacte d'hidrogel de silicona. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).