Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje karusel od tri slajda odjednom. Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće za kretanje kroz tri slajda odjednom ili koristite klizače na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Razvojem novih ultra-mekih materijala za medicinske uređaje i biomedicinske primjene, sveobuhvatna karakterizacija njihovih fizičkih i mehaničkih svojstava je i važna i izazovna. Modificirana tehnika nanoindentacije atomskom silovitom mikroskopijom (AFM) primijenjena je za karakterizaciju izuzetno niskog površinskog modula nove biomimetičke silikonske hidrogel kontaktne leće lehfilcon A, obložene slojem razgranatih polimernih četkastih struktura. Ova metoda omogućava precizno određivanje kontaktnih tačaka bez efekata viskozne ekstruzije pri približavanju razgranatim polimerima. Osim toga, omogućava određivanje mehaničkih karakteristika pojedinačnih elemenata četke bez efekta poroelastičnosti. To se postiže odabirom AFM sonde s dizajnom (veličina vrha, geometrija i čvrstoća opruge) koji je posebno pogodan za mjerenje svojstava mekih materijala i bioloških uzoraka. Ova metoda poboljšava osjetljivost i tačnost za precizno mjerenje vrlo mekog materijala lehfilcon A, koji ima izuzetno nizak modul elastičnosti na površini (do 2 kPa) i izuzetno visoku elastičnost u unutrašnjem (skoro 100%) vodenom okruženju. Rezultati studije površine nisu samo otkrili ultra-meka površinska svojstva lehfilcon A sočiva, već su pokazali i da je modul razgranatih polimernih četkica uporediv s modulom silicijum-vodonične podloge. Ova tehnika karakterizacije površine može se primijeniti na druge ultra-meke materijale i medicinske uređaje.
Mehanička svojstva materijala dizajniranih za direktan kontakt sa živim tkivom često su određena biološkim okruženjem. Savršeno usklađivanje ovih svojstava materijala pomaže u postizanju željenih kliničkih karakteristika materijala bez izazivanja neželjenih ćelijskih reakcija1,2,3. Za homogene materijale u rasutom stanju, karakterizacija mehaničkih svojstava je relativno jednostavna zbog dostupnosti standardnih postupaka i metoda ispitivanja (npr. mikroutiskivanje4,5,6). Međutim, za ultra-meke materijale kao što su gelovi, hidrogeli, biopolimeri, žive ćelije itd., ove metode ispitivanja uglavnom nisu primjenjive zbog ograničenja rezolucije mjerenja i nehomogenosti nekih materijala7. Tokom godina, tradicionalne metode utiskivanja su modificirane i prilagođene za karakterizaciju širokog spektra mekih materijala, ali mnoge metode i dalje pate od ozbiljnih nedostataka koji ograničavaju njihovu upotrebu8,9,10,11,12,13. Nedostatak specijaliziranih metoda ispitivanja koje mogu precizno i ​​pouzdano karakterizirati mehanička svojstva supermekih materijala i površinskih slojeva ozbiljno ograničava njihovu upotrebu u različitim primjenama.
U našem prethodnom radu predstavili smo kontaktnu leću lehfilcon A (CL), mekani heterogeni materijal sa svim ultra-mekim površinskim svojstvima izvedenim iz potencijalno biomimetičkih dizajna inspirisanih površinom rožnjače oka. Ovaj biomaterijal je razvijen kalemljenjem razgranatog, umreženog polimernog sloja poli(2-metakriloiloksietilfosforilholina (MPC)) (PMPC) na silikonski hidrogel (SiHy) 15 dizajniran za medicinske uređaje na bazi. Ovaj proces kalemljenja stvara sloj na površini koji se sastoji od vrlo meke i visoko elastične razgranate polimerne četkaste strukture. Naš prethodni rad je potvrdio da biomimetička struktura lehfilcon A CL pruža superiorna površinska svojstva kao što su poboljšano vlaženje i sprječavanje onečišćenja, povećana podmazivanje i smanjena adhezija ćelija i bakterija 15,16. Osim toga, upotreba i razvoj ovog biomimetičkog materijala također sugerira daljnje širenje na druge biomedicinske uređaje. Stoga je ključno karakterizirati površinska svojstva ovog ultra-mekog materijala i razumjeti njegovu mehaničku interakciju s okom kako bi se stvorila sveobuhvatna baza znanja koja će podržati budući razvoj i primjenu. Većina komercijalno dostupnih SiHy kontaktnih leća sastoji se od homogene mješavine hidrofilnih i hidrofobnih polimera koji formiraju ujednačenu strukturu materijala17. Provedeno je nekoliko studija kako bi se istražila njihova mehanička svojstva korištenjem tradicionalnih metoda ispitivanja kompresije, zatezanja i mikroudubljenja18,19,20,21. Međutim, novi biomimetički dizajn lehfilcon A CL čini ga jedinstvenim heterogenim materijalom u kojem se mehanička svojstva razgranatih polimernih četkastih struktura značajno razlikuju od svojstava SiHy osnovne podloge. Stoga je vrlo teško precizno kvantificirati ova svojstva korištenjem konvencionalnih metoda i metoda udubljenja. Obećavajuća metoda koristi metodu ispitivanja nanoindentacijom implementiranu u mikroskopiji atomskih sila (AFM), metodu koja se koristi za određivanje mehaničkih svojstava mekih viskoelastičnih materijala kao što su biološke ćelije i tkiva, kao i meki polimeri22,23,24,25, ,26,27,28,29,30. U AFM nanoindentaciji, osnove nanoindentacijskog ispitivanja kombinovane su sa najnovijim dostignućima u AFM tehnologiji kako bi se obezbedila povećana osetljivost merenja i testiranje širokog spektra inherentno supermekih materijala31,32,33,34,35,36. Pored toga, tehnologija nudi i druge važne prednosti kroz upotrebu različitih geometrija utiskivača i sonde i mogućnost ispitivanja u različitim tečnim medijima.
AFM nanoindentacija se uslovno može podijeliti na tri glavne komponente: (1) opremu (senzore, detektore, sonde itd.); (2) parametre mjerenja (kao što su sila, pomak, brzina, veličina rampe itd.); (3) obradu podataka (korekciju osnovne linije, procjenu tačke dodira, prilagođavanje podataka, modeliranje itd.). Značajan problem kod ove metode je što nekoliko studija u literaturi koje koriste AFM nanoindentaciju izvještavaju o vrlo različitim kvantitativnim rezultatima za isti uzorak/ćeliju/tip materijala37,38,39,40,41. Na primjer, Lekka i saradnici su proučavali i upoređivali uticaj geometrije AFM sonde na izmjereni Youngov modul uzoraka mehanički homogenog hidrogela i heterogenih ćelija. Oni izvještavaju da vrijednosti modula uveliko zavise od odabira konzole i oblika vrha, sa najvećom vrijednošću za sondu u obliku piramide i najnižom vrijednošću od 42 za sfernu sondu. Slično tome, Selhuber-Unkel i saradnici... Pokazano je kako brzina utiskivanja, veličina utiskivača i debljina uzoraka poliakrilamida (PAAM) utiču na Youngov modul elastičnosti mjeren ACM43 nanoindentacijom. Još jedan otežavajući faktor je nedostatak standardnih materijala za ispitivanje izuzetno niskog modula i besplatnih procedura ispitivanja. Zbog toga je vrlo teško dobiti tačne rezultate sa sigurnošću. Međutim, metoda je vrlo korisna za relativna mjerenja i komparativne evaluacije između sličnih tipova uzoraka, na primjer korištenjem AFM nanoindentacije za razlikovanje normalnih ćelija od ćelija raka 44, 45.
Prilikom testiranja mekih materijala AFM nanoindentacijom, opće pravilo je korištenje sonde s niskom konstantom opruge (k) koja se blisko podudara s modulom uzorka i hemisferičnim/okruglim vrhom tako da prva sonda ne probije površine uzorka pri prvom kontaktu s mekim materijalima. Također je važno da signal otklona koji generira sonda bude dovoljno jak da ga detektira laserski detektorski sistem24,34,46,47. U slučaju ultra-mekih heterogenih ćelija, tkiva i gelova, još jedan izazov je savladati silu adhezije između sonde i površine uzorka kako bi se osigurala ponovljiva i pouzdana mjerenja48,49,50. Do nedavno, većina radova na AFM nanoindentaciji fokusirala se na proučavanje mehaničkog ponašanja bioloških ćelija, tkiva, gelova, hidrogelova i biomolekula korištenjem relativno velikih sfernih sondi, koje se obično nazivaju koloidnim sondama (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Ovi vrhovi imaju radijus od 1 do 50 µm i obično se izrađuju od borosilikatnog stakla, polimetil metakrilata (PMMA), polistirena (PS), silicijum dioksida (SiO2) i dijamantskog ugljika (DLC). Iako je CP-AFM nanoindentacija često prvi izbor za karakterizaciju mekih uzoraka, ona ima svoje probleme i ograničenja. Upotreba velikih, mikronskih sfernih vrhova povećava ukupnu kontaktnu površinu vrha s uzorkom i rezultira značajnim gubitkom prostorne rezolucije. Za meke, nehomogene uzorke, gdje se mehanička svojstva lokalnih elemenata mogu značajno razlikovati od prosjeka na širem području, CP utiskivanje može sakriti svaku nehomogenost u svojstvima na lokalnoj skali52. Koloidne sonde se obično izrađuju pričvršćivanjem koloidnih sfera mikronske veličine na konzole bez vrhova pomoću epoksidnih ljepila. Sam proces proizvodnje prepun je mnogih problema i može dovesti do nedosljednosti u procesu kalibracije sonde. Osim toga, veličina i masa koloidnih čestica direktno utiču na glavne parametre kalibracije konzole, kao što su rezonantna frekvencija, krutost opruge i osjetljivost na otklon 56,57,58. Stoga, uobičajeno korištene metode za konvencionalne AFM sonde, kao što je kalibracija temperature, možda neće pružiti tačnu kalibraciju za CP, te mogu biti potrebne druge metode za izvođenje ovih korekcija 57, 59, 60, 61. Tipični eksperimenti utiskivanja CP koriste konzolu s velikim odstupanjima za proučavanje svojstava mekih uzoraka, što stvara još jedan problem pri kalibraciji nelinearnog ponašanja konzole pri relativno velikim odstupanjima 62,63,64. Moderne metode utiskivanja koloidnih sondi obično uzimaju u obzir geometriju konzole koja se koristi za kalibraciju sonde, ali zanemaruju utjecaj koloidnih čestica, što stvara dodatnu nesigurnost u tačnosti metode 38,61. Slično tome, elastični moduli izračunati prilagođavanjem kontaktnog modela direktno zavise od geometrije sonde za utiskivanje, a neusklađenost između karakteristika vrha i površine uzorka može dovesti do netačnosti27, 65, 66, 67, 68. Istaknuti su neki nedavni radovi Spencera i saradnika. Istaknuti su faktori koje treba uzeti u obzir prilikom karakterizacije mekih polimernih četkica korištenjem CP-AFM metode nanoindentacije. Izvijestili su da zadržavanje viskozne tekućine u polimernim četkicama kao funkcija brzine rezultira povećanjem opterećenja glave i stoga različitim mjerenjima svojstava zavisnih od brzine30,69,70,71.
U ovoj studiji, okarakterizirali smo površinski modul ultra-mekog visokoelastičnog materijala lehfilcon A CL koristeći modificiranu AFM metodu nanoindentacije. S obzirom na svojstva i novu strukturu ovog materijala, raspon osjetljivosti tradicionalne metode utiskivanja je očito nedovoljan za karakterizaciju modula ovog izuzetno mekog materijala, tako da je potrebno koristiti AFM metodu nanoindentacije s većim i nižim nivoom osjetljivosti. Nakon pregleda nedostataka i problema postojećih tehnika nanoindentacije koloidnom AFM sondom, pokazujemo zašto smo odabrali manju, posebno dizajniranu AFM sondu kako bismo eliminirali osjetljivost, pozadinsku buku, precizno odredili tačku kontakta, izmjerili modul brzine mekih heterogenih materijala, kao što je ovisnost o zadržavanju tekućine, i precizno kvantificirali. Osim toga, uspjeli smo precizno izmjeriti oblik i dimenzije vrha utiskivanja, što nam je omogućilo korištenje modela konusno-sfernog prilagođavanja za određivanje modula elastičnosti bez procjene kontaktne površine vrha s materijalom. Dvije implicitne pretpostavke koje su kvantificirane u ovom radu su potpuno elastična svojstva materijala i modul neovisan o dubini utiskivanja. Koristeći ovu metodu, prvo smo testirali ultra-meke standarde sa poznatim modulom kako bismo kvantificirali metodu, a zatim smo koristili ovu metodu za karakterizaciju površina dva različita materijala kontaktnih sočiva. Očekuje se da će ova metoda karakterizacije AFM nanoindentacijskih površina sa povećanom osjetljivošću biti primjenjiva na širok spektar biomimetičkih heterogenih ultra-mekih materijala sa potencijalnom upotrebom u medicinskim uređajima i biomedicinskim primjenama.
Za eksperimente nanoindentacije odabrane su kontaktne leće Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, SAD) i njihove silikonske hidrogelne podloge. U eksperimentu je korišten posebno dizajniran nosač leće. Da bi se leća instalirala za testiranje, pažljivo je postavljena na stalak u obliku kupole, pazeći da unutra ne uđu mjehurići zraka, a zatim je fiksirana rubovima. Otvor u fiksatoru na vrhu držača leće omogućava pristup optičkom centru leće za eksperimente nanoindentacije, dok tekućina ostaje na mjestu. Ovo održava leće potpuno hidriranima. 500 μl otopine za pakiranje kontaktnih leća korišteno je kao otopina za testiranje. Za provjeru kvantitativnih rezultata, komercijalno dostupni neaktivirani poliakrilamidni (PAAM) hidrogeli pripremljeni su od sastava poliakrilamid-ko-metilen-bisakrilamid (100 mm Petrisoft Petrijeve zdjelice, Matrigen, Irvine, CA, SAD), poznatog modula elastičnosti od 1 kPa. Koristite 4-5 kapi (približno 125 µl) fosfatno puferovane fiziološke otopine (PBS od Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, SAD) i 1 kap OPTI-FREE Puremoist otopine za kontaktne leće (Alcon, Vaud, TX, SAD). ) na granici hidrogela i sonde AFM-a.
Uzorci Lehfilcon A CL i SiHy supstrata vizualizirani su korištenjem FEI Quanta 250 sistema skenirajućeg elektronskog mikroskopa s emisijom polja (FEG SEM) opremljenog detektorom skenirajućeg transmisionog elektronskog mikroskopa (STEM). Za pripremu uzoraka, sočiva su prvo isprana vodom i izrezana u klinove u obliku pite. Da bi se postigao diferencijalni kontrast između hidrofilnih i hidrofobnih komponenti uzoraka, kao boja je korišten 0,10% stabilizirani rastvor RuO4, u koji su uzorci uronjeni 30 minuta. Bojenje lehfilcon A CL RuO4 važno je ne samo za postizanje poboljšanog diferencijalnog kontrasta, već i pomaže u očuvanju strukture razgranatih polimernih četkica u njihovom izvornom obliku, koje su zatim vidljive na STEM slikama. Zatim su oprani i dehidrirani u nizu mješavina etanola/vode s povećanjem koncentracije etanola. Uzorci su zatim izliveni EMBed 812/Araldite epoksidom, koji se stvrdnjavao preko noći na 70°C. Uzorci blokova dobijeni polimerizacijom smole izrezani su ultramikrotomom, a dobijeni tanki presjeci vizualizirani su STEM detektorom u režimu niskog vakuuma pri ubrzavajućem naponu od 30 kV. Isti SEM sistem korišten je za detaljnu karakterizaciju PFQNM-LC-A-CAL AFM sonde (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornija, SAD). SEM slike AFM sonde dobivene su u tipičnom režimu visokog vakuuma s ubrzavajućim naponom od 30 kV. Snimljene su slike pod različitim uglovima i uvećanjima kako bi se zabilježili svi detalji oblika i veličine vrha AFM sonde. Sve dimenzije vrha od interesa na slikama izmjerene su digitalno.
Za vizualizaciju i nanoindentaciju uzoraka lehfilcon A CL, SiHy supstrata i PAAm hidrogela korišten je atomski mikroskop Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, Kalifornija, SAD) s načinom rada "PeakForce QNM in Fluid". Za eksperimente snimanja korištena je PEAKFORCE-HIRS-FA sonda (Bruker) s nominalnim radijusom vrha od 1 nm za snimanje slika visoke rezolucije uzorka brzinom skeniranja od 0,50 Hz. Sve slike su snimljene u vodenom rastvoru.
Eksperimenti AFM nanoindentacije provedeni su korištenjem PFQNM-LC-A-CAL sonde (Bruker). AFM sonda ima silikonski vrh na nitridnoj konzoli debljine 345 nm, dužine 54 µm i širine 4,5 µm s rezonantnom frekvencijom od 45 kHz. Posebno je dizajnirana za karakterizaciju i izvođenje kvantitativnih nanomehaničkih mjerenja na mekim biološkim uzorcima. Senzori su pojedinačno kalibrirani u tvornici s prethodno kalibriranim postavkama opruga. Konstante opruge sondi korištenih u ovoj studiji bile su u rasponu od 0,05–0,1 N/m. Da bi se precizno odredio oblik i veličina vrha, sonda je detaljno okarakterizirana pomoću SEM-a. Na slici 1a prikazana je skenirajuća elektronska mikrografija visoke rezolucije i malog uvećanja PFQNM-LC-A-CAL sonde, pružajući holistički pogled na dizajn sonde. Na slici 1b prikazan je uvećani pogled na vrh vrha sonde, pružajući informacije o obliku i veličini vrha. Na krajnjem kraju, igla je hemisfera promjera oko 140 nm (Sl. 1c). Ispod toga, vrh se sužava u konusni oblik, dostižući izmjerenu dužinu od približno 500 nm. Izvan područja sužavanja, vrh je cilindričan i završava ukupnom dužinom vrha od 1,18 µm. Ovo je glavni funkcionalni dio vrha sonde. Pored toga, za testiranje je korištena i velika sferna polistirenska (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, SAD) s promjerom vrha od 45 µm i konstantom opruge od 2 N/m kao koloidna sonda, sa PFQNM-LC-A-CAL sondom od 140 nm za poređenje.
Prijavljeno je da se tečnost može zarobiti između AFM sonde i strukture polimerne četke tokom nanoindentacije, što će vršiti silu prema gore na AFM sondu prije nego što ona zapravo dodirne površinu69. Ovaj efekat viskozne ekstruzije zbog zadržavanja tečnosti može promijeniti prividnu tačku kontakta, čime utiče na mjerenja modula površine. Da bi se proučio uticaj geometrije sonde i brzine utiskivanja na zadržavanje tečnosti, krivulje sile utiskivanja su nacrtane za uzorke lehfilcon A CL korištenjem sonde prečnika 140 nm pri konstantnim brzinama pomjeranja od 1 µm/s i 2 µm/s. Prečnik sonde 45 µm, fiksna postavka sile 6 nN postignuta je pri 1 µm/s. Eksperimenti sa sondom prečnika 140 nm provedeni su pri brzini utiskivanja od 1 µm/s i postavljenoj sili od 300 pN, odabranoj da stvori kontaktni pritisak unutar fiziološkog raspona (1–8 kPa) gornjeg kapka. pritisak 72. Meki gotovi uzorci PAA hidrogela s pritiskom od 1 kPa testirani su na silu utiskivanja od 50 pN pri brzini od 1 μm/s korištenjem sonde promjera 140 nm.
Budući da je dužina konusnog dijela vrha PFQNM-LC-A-CAL sonde približno 500 nm, za bilo koju dubinu utiskivanja < 500 nm može se sa sigurnošću pretpostaviti da će geometrija sonde tokom utiskivanja ostati vjerna svom konusnom obliku. Osim toga, pretpostavlja se da će površina ispitivanog materijala pokazivati ​​reverzibilni elastični odgovor, što će također biti potvrđeno u sljedećim odjeljcima. Stoga smo, ovisno o obliku i veličini vrha, odabrali model prilagođavanja konusa i sfere koji su razvili Briscoe, Sebastian i Adams, a koji je dostupan u softveru proizvođača, za obradu naših AFM eksperimenata nanoindentacije (NanoScope). Softver za analizu podataka o separaciji, Bruker) 73. Model opisuje odnos sile i pomaka F(δ) za konus sa sfernim defektom na vrhu. Na slici... Slika 2 prikazuje geometriju kontakta tokom interakcije krutog konusa sa sfernim vrhom, gdje je R poluprečnik sfernog vrha, a je poluprečnik kontakta, b je poluprečnik kontakta na kraju sfernog vrha, δ je poluprečnik kontakta. θ je dubina udubljenja, a je poluugao konusa. SEM slika ove sonde jasno pokazuje da se sferni vrh prečnika 140 nm tangencijalno spaja u konus, tako da je ovdje b definisan samo kroz R, tj. b = R cos θ. Softver koji isporučuje dobavljač pruža odnos konus-sfera za izračunavanje vrijednosti Youngovog modula (E) iz podataka o razdvajanju sila pod pretpostavkom da je a > b. Odnos:
gdje je F sila utiskivanja, E je Youngov modul, ν je Poissonov koeficijent. Kontaktni radijus a može se procijeniti pomoću:
Shema kontaktne geometrije krutog konusa sa sfernim vrhom utisnutim u materijal Lefilcon kontaktne leće s površinskim slojem razgranatih polimernih četkica.
Ako je a ≤ b, relacija se svodi na jednačinu za konvencionalni sferni utiskivač;
Vjerujemo da će interakcija sonde za utiskivanje s razgranatom strukturom PMPC polimerne četke uzrokovati da kontaktni radijus a bude veći od sfernog kontaktnog radijusa b. Stoga smo za sva kvantitativna mjerenja modula elastičnosti provedena u ovoj studiji koristili zavisnost dobivenu za slučaj a > b.
Ultramekani biomimetički materijali proučavani u ovoj studiji sveobuhvatno su snimljeni korištenjem skenirajuće transmisione elektronske mikroskopije (STEM) poprečnog presjeka uzorka i atomske silovne mikroskopije (AFM) površine. Ova detaljna karakterizacija površine izvršena je kao proširenje našeg prethodno objavljenog rada, u kojem smo utvrdili da dinamički razgranata polimerna četkasta struktura PMPC-modificirane površine lehfilcon A CL pokazuje slična mehanička svojstva kao i nativna tkiva rožnjače 14. Iz tog razloga, površine kontaktnih sočiva nazivamo biomimetičkim materijalima 14. Na slikama 3a i b prikazani su poprečni presjeci razgranatih PMPC polimernih četkastih struktura na površini lehfilcon A CL supstrata i netretiranog SiHy supstrata. Površine oba uzorka dalje su analizirane korištenjem AFM slika visoke rezolucije, što je dodatno potvrdilo rezultate STEM analize (slika 3c i d). Zajedno, ove slike daju približnu dužinu PMPC razgranate polimerne četkaste strukture na 300–400 nm, što je ključno za interpretaciju AFM nanoindentacijskih mjerenja. Još jedno ključno zapažanje izvedeno iz slika je da se ukupna površinska struktura CL biomimetičkog materijala morfološki razlikuje od strukture SiHy supstratnog materijala. Ova razlika u njihovoj površinskoj morfologiji može postati očigledna tokom njihove mehaničke interakcije sa AFM sondom za utiskivanje, a potom i u izmjerenim vrijednostima modula.
Presjeci STEM slika (a) lehfilcon A CL i (b) SiHy supstrata. Mjerilo, 500 nm. AFM slike površine lehfilcon A CL supstrata (c) i osnovnog SiHy supstrata (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirirani polimeri i polimerne četkaste strukture su inherentno mekani i široko su proučavani i korišteni u raznim biomedicinskim primjenama74,75,76,77. Stoga je važno koristiti AFM metodu nanoindentacije, koja može precizno i ​​pouzdano izmjeriti njihova mehanička svojstva. Ali istovremeno, jedinstvena svojstva ovih ultra-mekih materijala, kao što su izuzetno nizak modul elastičnosti, visok sadržaj tečnosti i visoka elastičnost, često otežavaju odabir pravog materijala, oblika i veličine sonde za utiskivanje. Ovo je važno kako utiskivač ne bi probio meku površinu uzorka, što bi dovelo do grešaka u određivanju tačke kontakta sa površinom i područja kontakta.
Za ovo je neophodno sveobuhvatno razumijevanje morfologije ultra-mekih biomimetičkih materijala (lehfilcon A CL). Informacije o veličini i strukturi razgranatih polimernih četkica dobijenih metodom snimanja pružaju osnovu za mehaničku karakterizaciju površine korištenjem AFM tehnika nanoindentacije. Umjesto sferičnih koloidnih sondi mikronske veličine, odabrali smo PFQNM-LC-A-CAL silicijum nitridno sondu (Bruker) sa prečnikom vrha od 140 nm, posebno dizajniranu za kvantitativno mapiranje mehaničkih svojstava bioloških uzoraka 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Razlog za korištenje relativno oštrih sondi u poređenju sa konvencionalnim koloidnim sondama može se objasniti strukturnim karakteristikama materijala. Upoređujući veličinu vrha sonde (~140 nm) sa razgranatim polimernim četkicama na površini CL lehfilcon A, prikazanim na slici 3a, može se zaključiti da je vrh dovoljno velik da dođe u direktan kontakt sa ovim strukturama četkica, što smanjuje mogućnost da vrh probije kroz njih. Da bi se ilustrovala ova tačka, na Sl. 4 je STEM slika lehfilcon A CL i utiskivačkog vrha AFM sonde (nacrtano u razmeri).
Shematski prikaz STEM slike lehfilcon A CL i ACM indentacijske sonde (nacrtano u mjerilu).
Osim toga, veličina vrha od 140 nm je dovoljno mala da se izbjegne rizik od bilo kojeg od efekata ljepljive ekstruzije koji su prethodno zabilježeni za polimerne četke proizvedene CP-AFM metodom nanoindentacije69,71. Pretpostavljamo da zbog posebnog konusno-sferičnog oblika i relativno male veličine ovog AFM vrha (Sl. 1), priroda krivulje sile generirane lehfilcon A CL nanoindentacijom neće ovisiti o brzini utiskivanja ili brzini utovara/istovara. Stoga na nju ne utječu poroelastični efekti. Da bi se testirala ova hipoteza, uzorci lehfilcon A CL su utisnuti pri fiksnoj maksimalnoj sili pomoću PFQNM-LC-A-CAL sonde, ali pri dvije različite brzine, a rezultirajuće krivulje sile zatezanja i uvlačenja korištene su za crtanje sile (nN) pri razmaku (µm) prikazanom na Slici 5a. Jasno je da se krivulje sile tokom opterećenja i rasterećenja potpuno preklapaju, i ne postoje jasni dokazi da se sila smicanja pri nultoj dubini utiskivanja povećava s brzinom utiskivanja na slici, što sugerira da su pojedinačni elementi četke okarakterizirani bez poroelastičnog efekta. Nasuprot tome, efekti zadržavanja fluida (viskozna ekstruzija i efekti poroelastičnosti) su evidentni za AFM sondu promjera 45 µm pri istoj brzini utiskivanja i istaknuti su histerezom između krivulja istezanja i uvlačenja, kao što je prikazano na slici 5b. Ovi rezultati podržavaju hipotezu i sugeriraju da su sonde promjera 140 nm dobar izbor za karakterizaciju takvih mekih površina.
lehfilcon A CL krivulje sile utiskivanja korištenjem ACM-a; (a) korištenje sonde promjera 140 nm pri dvije brzine opterećenja, demonstrirajući odsustvo poroelastičnog efekta tokom površinskog utiskivanja; (b) korištenje sondi promjera 45 µm i 140 nm. s pokazuju efekte viskozne ekstruzije i poroelastičnosti za velike sonde u poređenju s manjim sondama.
Da bi se karakterizirale ultrameke površine, AFM metode nanoindentacije moraju imati najbolju sondu za proučavanje svojstava materijala koji se proučava. Pored oblika i veličine vrha, osjetljivost AFM detektorskog sistema, osjetljivost na otklon vrha u ispitnom okruženju i krutost konzole igraju važnu ulogu u određivanju tačnosti i pouzdanosti mjerenja nanoindentacije. Za naš AFM sistem, granica detekcije poziciono osjetljivog detektora (PSD) je približno 0,5 mV i zasniva se na prethodno kalibriranoj čvrstoći opruge i izračunatoj osjetljivosti otklona fluida PFQNM-LC-A-CAL sonde, što odgovara teorijskoj osjetljivosti opterećenja, je manja od 0,1 pN. Stoga, ova metoda omogućava mjerenje minimalne sile utiskivanja ≤ 0,1 pN bez ikakve periferne komponente šuma. Međutim, gotovo je nemoguće da AFM sistem smanji periferni šum na ovaj nivo zbog faktora kao što su mehaničke vibracije i dinamika fluida. Ovi faktori ograničavaju ukupnu osjetljivost AFM metode nanoindentacije i također rezultiraju signalom pozadinske buke od približno ≤ 10 pN. Za karakterizaciju površine, uzorci lehfilcon A CL i SiHy supstrata su utisnuti pod potpuno hidratiziranim uslovima korištenjem sonde od 140 nm za SEM karakterizaciju, a rezultirajuće krivulje sile su superponirane između sile (pN) i pritiska. Grafik separacije (µm) je prikazan na slici 6a. U poređenju sa SiHy osnovnom supstratom, krivulja sile lehfilcon A CL jasno pokazuje prelaznu fazu koja počinje u tački kontakta sa račvastom polimernom četkom i završava oštrom promjenom nagiba koja označava kontakt vrha sa podložnim materijalom. Ovaj prelazni dio krivulje sile ističe istinski elastično ponašanje razgranate polimerne četke na površini, što se vidi po krivulji kompresije koja blisko prati krivulju napetosti i kontrastu u mehaničkim svojstvima između strukture četke i glomaznog SiHy materijala. Prilikom poređenja lefilcona. Razdvajanje prosječne dužine razgranate polimerne četke na STEM slici PCS-a (slika 3a) i njene krivulje sile duž apscise na slici 3a. Slika 6a pokazuje da metoda može detektovati vrh i razgranati polimer koji dosežu sam vrh površine. Kontakt između struktura četkica. Osim toga, blisko preklapanje krivulja sile ukazuje na odsustvo efekta zadržavanja tečnosti. U ovom slučaju, nema apsolutno nikakve adhezije između igle i površine uzorka. Najgornji dijelovi krivulja sile za dva uzorka se preklapaju, što odražava sličnost mehaničkih svojstava materijala supstrata.
(a) AFM krivulje sile nanoindentacije za lehfilcon A CL podloge i SiHy podloge, (b) krivulje sile koje prikazuju procjenu kontaktne tačke korištenjem metode praga pozadinske buke.
Kako bi se proučili finiji detalji krive sile, krivulja napetosti uzorka lehfilcon A CL ponovo je prikazana na slici 6b s maksimalnom silom od 50 pN duž y-ose. Ovaj grafikon pruža važne informacije o originalnoj pozadinskoj buci. Buka je u rasponu od ±10 pN, što se koristi za precizno određivanje kontaktne tačke i izračunavanje dubine udubljenja. Kao što je navedeno u literaturi, identifikacija kontaktnih tačaka je ključna za preciznu procjenu svojstava materijala kao što je modul85. Pristup koji uključuje automatsku obradu podataka krive sile pokazao je poboljšano usklađivanje između prilagođavanja podataka i kvantitativnih mjerenja za meke materijale86. U ovom radu, naš izbor tačaka kontakta je relativno jednostavan i objektivan, ali ima svoja ograničenja. Naš konzervativni pristup određivanju tačke kontakta može rezultirati blago precijenjenim vrijednostima modula za manje dubine udubljenja (< 100 nm). Korištenje detekcije tačaka dodira zasnovane na algoritmu i automatizovane obrade podataka moglo bi biti nastavak ovog rada u budućnosti kako bi se dalje poboljšala naša metoda. Dakle, za intrinzičnu pozadinsku buku reda veličine ±10 pN, definiramo kontaktnu tačku kao prvu podatkovnu tačku na x-osi na slici 6b s vrijednošću ≥10 pN. Zatim, u skladu s pragom buke od 10 pN, vertikalna linija na nivou od ~0,27 µm označava tačku kontakta s površinom, nakon čega se krivulja istezanja nastavlja sve dok podloga ne dostigne dubinu udubljenja od ~270 nm. Zanimljivo je da, na osnovu veličine karakteristika razgranate polimerne četke (300–400 nm) izmjerene metodom snimanja, dubina udubljenja uzorka CL lehfilcon A, posmatrana metodom praga pozadinske buke, iznosi oko 270 nm, što je vrlo blizu veličini mjerenja sa STEM-om. Ovi rezultati dodatno potvrđuju kompatibilnost i primjenjivost oblika i veličine vrha AFM sonde za utiskivanje ove vrlo mekane i visoko elastične strukture razgranate polimerne četke. Ovi podaci također pružaju snažne dokaze koji podržavaju našu metodu korištenja pozadinske buke kao praga za precizno određivanje kontaktnih tačaka. Stoga bi svi kvantitativni rezultati dobijeni matematičkim modeliranjem i prilagođavanjem krivulje sile trebali biti relativno tačni.
Kvantitativna mjerenja metodama AFM nanoindentacije u potpunosti zavise od matematičkih modela korištenih za odabir podataka i naknadnu analizu. Stoga je važno uzeti u obzir sve faktore vezane za izbor utiskivača, svojstva materijala i mehaniku njihove interakcije prije odabira određenog modela. U ovom slučaju, geometrija vrha je pažljivo okarakterizirana korištenjem SEM mikrografija (Sl. 1), i na osnovu rezultata, AFM nanoindentacijska sonda promjera 140 nm s tvrdim konusom i sfernom geometrijom vrha je dobar izbor za karakterizaciju uzoraka lehfilcon A CL79. Još jedan važan faktor koji treba pažljivo procijeniti je elastičnost polimernog materijala koji se testira. Iako početni podaci nanoindentacije (Sl. 5a i 6a) jasno ocrtavaju karakteristike preklapanja krivulja zatezanja i kompresije, tj. potpuni elastični oporavak materijala, izuzetno je važno potvrditi čisto elastičnu prirodu kontakata. U tu svrhu, dva uzastopna utiskivanja su izvršena na istoj lokaciji na površini uzorka lehfilcon A CL brzinom utiskivanja od 1 µm/s pod uslovima pune hidratacije. Rezultirajući podaci krive sile prikazani su na slici 7 i, kao što se i očekivalo, krive širenja i kompresije dva otiska su gotovo identične, što ističe visoku elastičnost razgranate strukture polimerne četke.
Dvije krivulje sile udubljenja na istoj lokaciji na površini lehfilcon A CL ukazuju na idealnu elastičnost površine sočiva.
Na osnovu informacija dobijenih iz SEM i STEM snimaka vrha sonde i površine lehfilcon A CL, respektivno, model konusa i sfere je razuman matematički prikaz interakcije između vrha AFM sonde i mekog polimernog materijala koji se testira. Pored toga, za ovaj model konusa i sfere, fundamentalne pretpostavke o elastičnim svojstvima otisnutog materijala važe i za ovaj novi biomimetički materijal i koriste se za kvantifikaciju modula elastičnosti.
Nakon sveobuhvatne evaluacije AFM metode nanoindentacije i njenih komponenti, uključujući svojstva sonde za utiskivanje (oblik, veličina i krutost opruge), osjetljivost (pozadinska buka i procjena kontaktne tačke) i modele prilagođavanja podataka (mjerenja kvantitativnog modula), korištena je ova metoda. Za karakterizaciju komercijalno dostupnih ultra mekih uzoraka radi provjere kvantitativnih rezultata, testiran je komercijalni poliakrilamidni (PAAM) hidrogel s modulom elastičnosti od 1 kPa pod hidratiziranim uvjetima korištenjem sonde od 140 nm. Detalji testiranja modula i proračuna dati su u Dodatnim informacijama. Rezultati su pokazali da je prosječni izmjereni modul bio 0,92 kPa, a %RSD i postotak (%) odstupanja od poznatog modula bili su manji od 10%. Ovi rezultati potvrđuju tačnost i ponovljivost AFM metode nanoindentacije korištene u ovom radu za mjerenje modula ultra mekih materijala. Površine uzoraka lehfilcon A CL i SiHy osnovne podloge dodatno su karakterizirane korištenjem iste AFM metode nanoindentacije kako bi se proučavao prividni kontaktni modul ultrameke površine kao funkcija dubine udubljenja. Krivulje razdvajanja sile udubljenja generirane su za tri uzorka svakog tipa (n = 3; jedno udubljenje po uzorku) pri sili od 300 pN, brzini od 1 µm/s i punoj hidrataciji. Krivulja dijeljenja sile udubljenja aproksimirana je korištenjem modela konus-sfera. Da bi se dobio modul koji ovisi o dubini udubljenja, dio krivulje sile širine 40 nm postavljen je na svaki korak od 20 nm počevši od točke kontakta, a izmjerene su vrijednosti modula u svakom koraku krivulje sile. Spin Cy i dr. Sličan pristup korišten je za karakterizaciju gradijenta modula četkica od polimera poli(lauril metakrilata) (P12MA) korištenjem koloidne AFM nanoindentacije sondom, a oni su u skladu s podacima korištenjem Hertzovog kontaktnog modela. Ovaj pristup pruža grafikon prividnog kontaktnog modula (kPa) u odnosu na dubinu udubljenja (nm), kao što je prikazano na Slici 8, koja ilustruje gradijent prividnog kontaktnog modula/dubine. Izračunati modul elastičnosti uzorka CL lehfilcon A je u rasponu od 2-3 kPa unutar gornjih 100 nm uzorka, nakon čega počinje da se povećava s dubinom. S druge strane, prilikom ispitivanja SiHy osnovne podloge bez filma nalik četkici na površini, maksimalna dubina udubljenja postignuta pri sili od 300 pN je manja od 50 nm, a vrijednost modula dobijena iz podataka je oko 400 kPa, što je uporedivo sa vrijednostima Youngovog modula za rasute materijale.
Prividni kontaktni modul (kPa) u odnosu na dubinu udubljenja (nm) za lehfilcon A CL i SiHy podloge korištenjem AFM metode nanoindentacije s geometrijom konusa i sfere za mjerenje modula.
Najgornja površina nove biomimetičke strukture razgranate polimerne četke pokazuje izuzetno nizak modul elastičnosti (2–3 kPa). To će se podudarati sa slobodno visećim krajem račvaste polimerne četke kao što je prikazano na STEM slici. Iako postoje neki dokazi o gradijentu modula na vanjskom rubu CL-a, glavni supstrat visokog modula je utjecajniji. Međutim, gornjih 100 nm površine nalazi se unutar 20% ukupne dužine razgranate polimerne četke, tako da je razumno pretpostaviti da su izmjerene vrijednosti modula u ovom rasponu dubine udubljenja relativno tačne i da ne ovise u velikoj mjeri o utjecaju donjeg objekta.
Zbog jedinstvenog biomimetičkog dizajna kontaktnih sočiva lehfilcon A, koji se sastoje od razgranatih PMPC polimernih četkastih struktura kalemljenih na površinu SiHy supstrata, vrlo je teško pouzdano karakterizirati mehanička svojstva njihovih površinskih struktura korištenjem tradicionalnih metoda mjerenja. Ovdje predstavljamo naprednu AFM metodu nanoindentacije za preciznu karakterizaciju ultra-mekih materijala kao što je lefilcon A s visokim sadržajem vode i izuzetno visokom elastičnošću. Ova metoda se zasniva na upotrebi AFM sonde čija su veličina i geometrija vrha pažljivo odabrani kako bi odgovarali strukturnim dimenzijama ultra-mekih površinskih karakteristika koje se otiskuju. Ova kombinacija dimenzija između sonde i strukture pruža povećanu osjetljivost, omogućavajući nam mjerenje niskog modula i inherentnih elastičnih svojstava elemenata razgranatih polimernih četkastih elemenata, bez obzira na poroelastične efekte. Rezultati su pokazali da jedinstvene razgranate PMPC polimerne četke karakteristične za površinu sočiva imaju izuzetno nizak modul elastičnosti (do 2 kPa) i vrlo visoku elastičnost (skoro 100%) kada se testiraju u vodenom okruženju. Rezultati AFM nanoindentacije su nam također omogućili da karakteriziramo prividni gradijent kontaktnog modula/dubine (30 kPa/200 nm) površine biomimetičke leće. Ovaj gradijent može biti posljedica razlike u modulu između razgranatih polimernih četkica i SiHy podloge, ili razgranate strukture/gustoće polimernih četkica, ili kombinacije navedenog. Međutim, potrebna su daljnja dubinska istraživanja kako bi se u potpunosti razumio odnos između strukture i svojstava, posebno utjecaj grananja četkice na mehanička svojstva. Slična mjerenja mogu pomoći u karakterizaciji mehaničkih svojstava površine drugih ultra-mekih materijala i medicinskih uređaja.
Skupovi podataka generirani i/ili analizirani tokom trenutne studije dostupni su od odgovarajućih autora na razuman zahtjev.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Biološke reakcije na fizička i hemijska svojstva površina biomaterijala. Chemical society. Ur. 49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Poboljšanje biomaterijala ljudskog porijekla za tkivni inženjering. programiranje. polimer. nauka. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. i dr. Dizajn, klinička primjena i imunološki odgovor biomaterijala u regenerativnoj medicini. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Poboljšana metoda za određivanje tvrdoće i modula elastičnosti korištenjem eksperimenata udubljenja s mjerenjima opterećenja i pomaka. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historijsko porijeklo ispitivanja tvrdoće udubljenjem. alma mater. nauka. tehnologije. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Mjerenja tvrdoće udubljenjem na makro, mikro i nanoskali: Kritički pregled. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Greške u detekciji površine dovode do precjenjivanja modula pri nanoindentaciji mekih materijala. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu. Evaluacija metode nanoindentacije za određivanje mehaničkih karakteristika heterogenih nanokompozita korištenjem eksperimentalnih i računarskih metoda. The Science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR i Owart, TS Mehanička karakterizacija mekih viskoelastičnih gelova utiskivanjem i optimizacijom zasnovanom inverznom analizom konačnih elemenata. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optimizacija određivanja viskoelastičnosti korištenjem kompatibilnih mjernih sistema. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentacija polimernih površina. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Karakterizacija viskoelastičnih mehaničkih svojstava visokoelastičnih polimera i bioloških tkiva korištenjem udarnog utiskivanja. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluacija modula elastičnosti i rada adhezije mekih materijala korištenjem proširene Borodich-Galanov (BG) metode i dubokog utiskivanja. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. i dr. Nanoskalna morfologija i mehanička svojstva biomimetičkih polimernih površina silikonskih hidrogel kontaktnih leća. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).