Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Използвате версия на браузъра с ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва карусел от три слайда едновременно. Използвайте бутоните „Предишна“ и „Следваща“, за да се придвижвате през три слайда едновременно, или използвайте плъзгачите в края, за да се придвижвате през три слайда едновременно.
С разработването на нови ултрамеки материали за медицински изделия и биомедицински приложения, цялостното характеризиране на техните физични и механични свойства е едновременно важно и предизвикателно. Модифицирана техника на наноиндентиране с атомно-силова микроскопия (АСМ) беше приложена за характеризиране на изключително ниския повърхностен модул на новата биомиметична силикон-хидрогелна контактна леща lehfilcon A, покрита със слой от разклонени полимерни четкови структури. Този метод позволява прецизно определяне на точките на контакт без ефектите на вискозна екструзия при приближаване до разклонени полимери. Освен това, той прави възможно определянето на механичните характеристики на отделните четкови елементи без ефекта на пороеластичност. Това се постига чрез избор на АСМ сонда с дизайн (размер на върха, геометрия и якост на пружината), който е особено подходящ за измерване на свойствата на меки материали и биологични проби. Този метод подобрява чувствителността и точността за точно измерване на много мекия материал lehfilcon A, който има изключително нисък модул на еластичност на повърхността (до 2 kPa) и изключително висока еластичност във вътрешната (почти 100%) водна среда. Резултатите от изследването на повърхността не само разкриха ултрамеките повърхностни свойства на лещата lehfilcon A, но също така показаха, че модулът на разклонените полимерни четки е сравним с този на силициево-водородния субстрат. Тази техника за характеризиране на повърхността може да се приложи към други ултрамеки материали и медицински устройства.
Механичните свойства на материалите, предназначени за директен контакт с жива тъкан, често се определят от биологичната среда. Перфектното съвпадение на тези свойства на материала помага за постигане на желаните клинични характеристики на материала, без да се причиняват неблагоприятни клетъчни реакции1,2,3. За обемни хомогенни материали характеризирането на механичните свойства е сравнително лесно поради наличието на стандартни процедури и методи за изпитване (напр. микроиндентиране4,5,6). Въпреки това, за ултрамеки материали като гелове, хидрогелове, биополимери, живи клетки и др., тези методи за изпитване обикновено не са приложими поради ограниченията на разделителната способност на измерването и нехомогенността на някои материали7. През годините традиционните методи за индентиране са били модифицирани и адаптирани за характеризиране на широк спектър от меки материали, но много методи все още страдат от сериозни недостатъци, които ограничават тяхното използване8,9,10,11,12,13. Липсата на специализирани методи за изпитване, които могат точно и надеждно да характеризират механичните свойства на свръхмеките материали и повърхностните слоеве, силно ограничава тяхното използване в различни приложения.
В предишната ни работа представихме контактната леща lehfilcon A (CL), мек хетерогенен материал с всички ултрамеки повърхностни свойства, получени от потенциално биомиметични дизайни, вдъхновени от повърхността на роговицата на окото. Този биоматериал е разработен чрез присаждане на разклонен, омрежен полимерен слой от поли(2-метакрилоилоксиетилфосфорилхолин (MPC)) (PMPC) върху силиконов хидрогел (SiHy) 15, предназначен за медицински устройства на базата на. Този процес на присаждане създава слой върху повърхността, състоящ се от много мека и силно еластична разклонена полимерна четковидна структура. Предишната ни работа потвърди, че биомиметичната структура на lehfilcon A CL осигурява превъзходни повърхностни свойства, като подобрено омокряне и предотвратяване на замърсяване, повишена смазваща способност и намалена клетъчна и бактериална адхезия 15,16. Освен това, използването и разработването на този биомиметичен материал предполага и по-нататъшно разширяване към други биомедицински устройства. Следователно е изключително важно да се характеризират повърхностните свойства на този ултрамек материал и да се разбере неговото механично взаимодействие с окото, за да се създаде цялостна база от знания в подкрепа на бъдещите разработки и приложения. Повечето търговски достъпни SiHy контактни лещи са съставени от хомогенна смес от хидрофилни и хидрофобни полимери, които образуват еднородна материална структура17. Проведени са няколко проучвания за изследване на техните механични свойства, използвайки традиционни методи за изпитване на компресия, опън и микроиндентация18,19,20,21. Новият биомиметичен дизайн на lehfilcon A CL обаче го прави уникален хетерогенен материал, при който механичните свойства на разклонените полимерни четковидни структури се различават значително от тези на основния SiHy субстрат. Следователно е много трудно точно да се определят количествено тези свойства, използвайки конвенционални методи и методи за индентация. Един обещаващ метод използва метода за наноиндентиране, внедрен в атомно-силовата микроскопия (АСМ), метод, който се използва за определяне на механичните свойства на меки вискоеластични материали като биологични клетки и тъкани, както и меки полимери22,23,24,25, ,26,27,28,29,30. При AFM наноиндентирането, основите на наноиндентационния контрол се комбинират с най-новите постижения в AFM технологията, за да се осигури повишена чувствителност на измерване и тестване на широк спектър от присъщо свръхмеки материали31,32,33,34,35,36. В допълнение, технологията предлага други важни предимства чрез използването на различни геометрии на индентора и сондата и възможността за тестване в различни течни среди.
AFM наноиндентирането може условно да се раздели на три основни компонента: (1) оборудване (сензори, детектори, сонди и др.); (2) параметри на измерване (като сила, изместване, скорост, размер на наклона и др.); (3) Обработка на данни (корекция на базовата линия, оценка на точката на допир, напасване на данните, моделиране и др.). Съществен проблем с този метод е, че няколко изследвания в литературата, използващи AFM наноиндентиране, отчитат много различни количествени резултати за един и същ тип проба/клетка/материал37,38,39,40,41. Например, Lekka et al. е изследвано и сравнено влиянието на геометрията на AFM сондата върху измерения модул на Юнг на проби от механично хомогенен хидрогел и хетерогенни клетки. Те съобщават, че стойностите на модула са силно зависими от избора на конзола и формата на върха, с най-висока стойност за сонда с форма на пирамида и най-ниска стойност от 42 за сферична сонда. По подобен начин, Selhuber-Unkel et al. Показано е как скоростта на индентора, размерът на индентора и дебелината на полиакриламидните (PAAM) проби влияят върху модула на Юнг, измерен чрез наноиндентиране с ACM43. Друг усложняващ фактор е липсата на стандартни тестови материали с изключително нисък модул и безплатни тестови процедури. Това прави много трудно получаването на точни резултати с увереност. Методът обаче е много полезен за относителни измервания и сравнителни оценки между подобни типове проби, например чрез използване на AFM наноиндентиране за разграничаване на нормални клетки от ракови клетки 44, 45.
При тестване на меки материали с AFM наноиндентиране, общо правило е да се използва сонда с ниска константа на пружината (k), която съответства точно на модула на пробата, и полусферичен/кръгъл връх, така че първата сонда да не пробива повърхностите на пробата при първия контакт с меки материали. Важно е също така сигналът за отклонение, генериран от сондата, да е достатъчно силен, за да бъде открит от лазерната детекторна система24,34,46,47. В случай на ултрамеки хетерогенни клетки, тъкани и гелове, друго предизвикателство е преодоляването на адхезионната сила между сондата и повърхността на пробата, за да се осигурят възпроизводими и надеждни измервания48,49,50. Доскоро по-голямата част от работата по AFM наноиндентиране се фокусираше върху изучаването на механичното поведение на биологични клетки, тъкани, гелове, хидрогелове и биомолекули, използвайки относително големи сферични сонди, обикновено наричани колоидни сонди (CP). , 47, 51, 52, 53, 54, 55. Тези върхове имат радиус от 1 до 50 µm и обикновено се изработват от боросиликатно стъкло, полиметилметакрилат (PMMA), полистирен (PS), силициев диоксид (SiO2) и диамантоподобен въглерод (DLC). Въпреки че CP-AFM наноиндентирането често е първият избор за характеризиране на меки проби, то има своите проблеми и ограничения. Използването на големи сферични върхове с микронен размер увеличава общата контактна площ на върха с пробата и води до значителна загуба на пространствена разделителна способност. За меки, нееднородни образци, където механичните свойства на локалните елементи могат да се различават значително от средните в по-широка област, CP индентирането може да скрие всяка нееднородност в свойствата в локален мащаб52. Колоидните сонди обикновено се изработват чрез закрепване на колоидни сфери с микронен размер към безвърхови конзоли с помощта на епоксидни лепила. Самият производствен процес е изпълнен с много проблеми и може да доведе до несъответствия в процеса на калибриране на сондата. Освен това, размерът и масата на колоидните частици влияят директно върху основните параметри на калибриране на конзолата, като резонансна честота, твърдост на пружината и чувствителност на отклонение56,57,58. По този начин, често използваните методи за конвенционални AFM сонди, като например температурно калибриране, може да не осигурят точно калибриране за CP и може да са необходими други методи за извършване на тези корекции57, 59, 60, 61. Типичните експерименти с CP индентиране използват конзола с големи отклонения, за да изследват свойствата на меки проби, което създава друг проблем при калибрирането на нелинейното поведение на конзолата при относително големи отклонения62,63,64. Съвременните методи за индентиране на колоидни сонди обикновено отчитат геометрията на конзолата, използвана за калибриране на сондата, но игнорират влиянието на колоидните частици, което създава допълнителна несигурност в точността на метода38,61. По подобен начин, еластичните модули, изчислени чрез напасване на контактния модел, са пряко зависими от геометрията на сондата за вдлъбване, а несъответствието между характеристиките на върха и повърхността на пробата може да доведе до неточности27, 65, 66, 67, 68. Подчертани са някои скорошни трудове на Spencer et al. Подчертани са факторите, които трябва да се вземат предвид при характеризиране на меки полимерни четки, използвайки метода за наноиндентиране CP-AFM. Те съобщават, че задържането на вискозен флуид в полимерните четки като функция на скоростта води до увеличаване на натоварването на главата и следователно до различни измервания на свойствата, зависими от скоростта30,69,70,71.
В това изследване ние характеризирахме повърхностния модул на ултрамекия високоеластичен материал lehfilcon A CL, използвайки модифициран AFM метод за наноиндентиране. Предвид свойствата и новата структура на този материал, диапазонът на чувствителност на традиционния метод за вдлъбване е очевидно недостатъчен, за да характеризира модула на този изключително мек материал, така че е необходимо да се използва AFM метод за наноиндентиране с по-високо и по-ниско ниво на чувствителност. След преглед на недостатъците и проблемите на съществуващите техники за наноиндентиране с колоидна AFM сонда, ние показваме защо избрахме по-малка, специално проектирана AFM сонда, за да елиминираме чувствителността, фоновия шум, да определим точно точката на контакт, да измерим модула на скоростта на меки хетерогенни материали, като например зависимостта от задържане на течности, и да определим точно количество. Освен това успяхме да измерим точно формата и размерите на върха на вдлъбването, което ни позволи да използваме модела на конусно-сферично напасване, за да определим модула на еластичност, без да оценяваме контактната площ на върха с материала. Двете имплицитни предположения, които са количествено определени в тази работа, са напълно еластичните свойства на материала и модулът, независим от дълбочината на вдлъбване. Използвайки този метод, първо тествахме ултрамеки стандарти с известен модул, за да определим количествено метода, а след това го използвахме за характеризиране на повърхностите на два различни материала за контактни лещи. Очаква се този метод за характеризиране на AFM наноиндентационни повърхности с повишена чувствителност да бъде приложим за широк спектър от биомиметични хетерогенни ултрамеки материали с потенциално приложение в медицински устройства и биомедицински приложения.
За експерименти с наноиндентиране бяха избрани контактни лещи Lehfilcon A (Alcon, Форт Уърт, Тексас, САЩ) и техните силикон-хидрогелни субстрати. В експеримента беше използван специално проектиран държач за лещи. За да се монтира лещата за тестване, тя беше внимателно поставена върху куполообразната стойка, като се внимаваше да не попаднат въздушни мехурчета вътре, и след това фиксирана с краищата. Отвор в приспособлението в горната част на държача на лещите осигурява достъп до оптичния център на лещата за експерименти с наноиндентиране, като същевременно течността се държи на място. Това поддържа лещите напълно хидратирани. Като тестов разтвор беше използван 500 μl разтвор за опаковане на контактни лещи. За да се проверят количествените резултати, бяха приготвени търговски достъпни неактивирани полиакриламидни (PAAM) хидрогелове от полиакриламид-ко-метилен-бисакриламиден състав (100 mm Petrisoft Петриеви панички, Matrigen, Irvine, CA, САЩ), с известен модул на еластичност от 1 kPa. Използвайте 4-5 капки (приблизително 125 µl) фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS от Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, САЩ) и 1 капка разтвор за контактни лещи OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, САЩ). ) на границата между хидрогел и сонда на AFM.
Проби от Lehfilcon A CL и SiHy субстрати бяха визуализирани с помощта на FEI Quanta 250 система за сканиращ електронен микроскоп с полева емисия (FEG SEM), оборудвана със сканиращ трансмисионен електронен микроскоп (STEM) детектор. За подготовката на пробите, лещите първо бяха измити с вода и нарязани на клинове с форма на пай. За да се постигне диференциален контраст между хидрофилните и хидрофобните компоненти на пробите, като багрило беше използван 0,10% стабилизиран разтвор на RuO4, в който пробите бяха потопени за 30 минути. Оцветяването с lehfilcon A CL RuO4 е важно не само за постигане на подобрен диференциален контраст, но и помага за запазване на структурата на разклонените полимерни четки в оригиналната им форма, които след това са видими на STEM изображения. След това те бяха измити и дехидратирани в серия от смеси етанол/вода с нарастваща концентрация на етанол. След това пробите бяха отлети с EMBed 812/Araldite епоксидна смола, която се втвърди за една нощ при 70°C. Пробни блокове, получени чрез полимеризация на смола, бяха изрязани с ултрамикротом, а получените тънки срези бяха визуализирани със STEM детектор в режим на нисък вакуум при ускоряващо напрежение от 30 kV. Същата SEM система беше използвана за детайлно характеризиране на PFQNM-LC-A-CAL AFM сондата (Bruker Nano, Санта Барбара, Калифорния, САЩ). SEM изображенията на AFM сондата бяха получени в типичен режим на висок вакуум с ускоряващо напрежение от 30 kV. Изображенията бяха получени под различни ъгли и увеличения, за да се запишат всички детайли на формата и размера на върха на AFM сондата. Всички интересуващи ни размери на върха в изображенията бяха измерени дигитално.
За визуализиране и наноиндентиране на проби от lehfilcon A CL, SiHy субстрат и PAAm хидрогел е използван атомно-силов микроскоп Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Санта Барбара, Калифорния, САЩ) с режим „PeakForce QNM in Fluid“. За експерименти с изображения е използвана сонда PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) с номинален радиус на върха 1 nm за заснемане на изображения с висока резолюция на пробата при скорост на сканиране 0,50 Hz. Всички изображения са направени във воден разтвор.
Експериментите с AFM наноиндентиране бяха проведени с помощта на PFQNM-LC-A-CAL сонда (Bruker). AFM сондата има силициев връх върху нитридна конзола с дебелина 345 nm, дължина 54 µm и ширина 4,5 µm с резонансна честота 45 kHz. Тя е специално проектирана за характеризиране и извършване на количествени наномеханични измервания върху меки биологични проби. Сензорите са индивидуално калибрирани във фабриката с предварително калибрирани настройки на пружините. Константите на пружините на сондите, използвани в това изследване, бяха в диапазона от 0,05–0,1 N/m. За да се определи точно формата и размерът на върха, сондата беше подробно характеризирана с помощта на SEM. На фиг. Фигура 1а показва снимка с висока резолюция и ниско увеличение, получена от сканиращ електронен микроскоп на сондата PFQNM-LC-A-CAL, предоставяща цялостен поглед върху дизайна на сондата. На фиг. 1b е показан уголемен изглед на горната част на върха на сондата, предоставящ информация за формата и размера на върха. В крайния си край иглата е полусфера с диаметър около 140 nm (фиг. 1c). Под нея върхът се стеснява в конична форма, достигайки измерена дължина от приблизително 500 nm. Извън областта на стесняване върхът е цилиндричен и завършва с обща дължина на върха от 1,18 µm. Това е основната функционална част на върха на сондата. Освен това, за тестване като колоидна сонда е използвана и голяма сферична полистиренова (PS) сонда (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) с диаметър на върха 45 µm и константа на пружината 2 N/m, с PFQNM-LC-A-CAL 140 nm сонда за сравнение.
Съобщава се, че течност може да бъде задържана между AFM сондата и полимерната четкова структура по време на нановдълговане, което ще упражни сила нагоре върху AFM сондата, преди тя действително да докосне повърхността69. Този вискозен екструдиращ ефект, дължащ се на задържане на течност, може да промени видимата точка на контакт, като по този начин повлияе на измерванията на модула на повърхността. За да се изследва ефектът от геометрията на сондата и скоростта на вдлъбване върху задържането на течност, кривите на силата на вдлъбване бяха нанесени за проби lehfilcon A CL, използвайки сонда с диаметър 140 nm при постоянни скорости на изместване от 1 µm/s и 2 µm/s. Диаметър на сондата 45 µm, фиксирана настройка на силата 6 nN, постигната при 1 µm/s. Експерименти със сонда с диаметър 140 nm бяха проведени при скорост на вдлъбване 1 µm/s и зададена сила от 300 pN, избрана да създаде контактно налягане във физиологичния диапазон (1–8 kPa) на горния клепач. налягане 72. Меки, готови проби от PAA хидрогел с налягане 1 kPa бяха тествани за сила на вдлъбване от 50 pN при скорост 1 μm/s, използвайки сонда с диаметър 140 nm.
Тъй като дължината на коничната част на върха на сондата PFQNM-LC-A-CAL е приблизително 500 nm, за всяка дълбочина на вдлъбване < 500 nm може спокойно да се предположи, че геометрията на сондата по време на вдлъбване ще остане вярна на конусовидна форма. Освен това се приема, че повърхността на тествания материал ще прояви обратим еластичен отговор, което също ще бъде потвърдено в следващите раздели. Следователно, в зависимост от формата и размера на върха, ние избрахме модела за конусно-сферично напасване, разработен от Briscoe, Sebastian и Adams, който е наличен в софтуера на доставчика, за да обработим нашите AFM наноиндентационни експерименти (NanoScope). Софтуер за анализ на данни от разделяне, Bruker) 73. Моделът описва връзката сила-изместване F(δ) за конус със сферичен дефект на върха. На фиг. Фигура 2 показва геометрията на контакта по време на взаимодействието на твърд конус със сферичен връх, където R е радиусът на сферичния връх, a е радиусът на контакт, b е радиусът на контакт в края на сферичния връх, δ е радиусът на контакт. θ е дълбочината на вдлъбване, полуъгълът на конуса. SEM изображението на тази сонда ясно показва, че сферичният връх с диаметър 140 nm се слива тангенциално в конус, така че тук b е дефинирано само чрез R, т.е. b = R cos θ. Софтуерът, предоставен от производителя, предоставя зависимост конус-сфера за изчисляване на стойностите на модула на Юнг (E) от данни за разделяне на силите, приемайки a > b. Връзка:
където F е силата на вдлъбване, E е модулът на Юнг, ν е коефициентът на Поасон. Радиусът на контакт a може да се оцени с помощта на:
Схема на контактната геометрия на твърд конус със сферичен връх, притиснат в материала на контактна леща Lefilcon с повърхностен слой от разклонени полимерни четки.
Ако a ≤ b, зависимостта се свежда до уравнението за конвенционален сферичен индентор;
Смятаме, че взаимодействието на вдлъбващата се сонда с разклонената структура на PMPC полимерната четка ще доведе до по-голям радиус на контакт a от сферичния радиус на контакт b. Следователно, за всички количествени измервания на модула на еластичност, извършени в това изследване, използвахме зависимостта, получена за случая a > b.
Ултрамеките биомиметични материали, изследвани в това проучване, бяха цялостно изобразени с помощта на сканираща трансмисионна електронна микроскопия (STEM) на напречното сечение на пробата и атомно-силова микроскопия (AFM) на повърхността. Тази подробна характеристика на повърхността беше извършена като продължение на нашата публикувана по-рано работа, в която установихме, че динамично разклонената полимерна четкова структура на PMPC-модифицираната повърхност на lehfilcon A CL показва подобни механични свойства на естествената тъкан на роговицата 14. Поради тази причина ние наричаме повърхностите на контактните лещи биомиметични материали 14. На фиг. 3a,b са показани напречни сечения на разклонени PMPC полимерни четкови структури върху повърхността на lehfilcon A CL субстрат и необработен SiHy субстрат, съответно. Повърхностите на двете проби бяха допълнително анализирани с помощта на AFM изображения с висока резолюция, което допълнително потвърди резултатите от STEM анализа (фиг. 3c, d). Взети заедно, тези изображения дават приблизителна дължина на разклонената полимерна четкова структура на PMPC при 300–400 nm, което е критично за интерпретиране на AFM наноиндентационни измервания. Друго ключово наблюдение, получено от изображенията, е, че общата повърхностна структура на CL биомиметичния материал е морфологично различна от тази на SiHy субстратния материал. Тази разлика в тяхната повърхностна морфология може да стане очевидна по време на механичното им взаимодействие с индентиращата AFM сонда и впоследствие в измерените стойности на модула.
Напречни STEM изображения на (a) lehfilcon A CL и (b) SiHy субстрат. Мащабна лента, 500 nm. AFM изображения на повърхността на lehfilcon A CL субстрата (c) и основния SiHy субстрат (d) (3 µm × 3 µm).
Биовдъхновените полимери и полимерните четкови структури са по своята същност меки и са широко изучавани и използвани в различни биомедицински приложения74,75,76,77. Следователно е важно да се използва методът за AFM наноиндентиране, който може точно и надеждно да измери техните механични свойства. Но в същото време уникалните свойства на тези ултрамеки материали, като изключително нисък модул на еластичност, високо съдържание на течност и висока еластичност, често затрудняват избора на правилния материал, форма и размер на индентиращата сонда. Това е важно, за да не прободе инденторът меката повърхност на пробата, което би довело до грешки при определяне на точката на контакт с повърхността и площта на контакт.
За тази цел е от съществено значение цялостното разбиране на морфологията на ултрамеките биомиметични материали (lehfilcon A CL). Информацията за размера и структурата на разклонените полимерни четки, получена с помощта на метода на изобразяване, осигурява основата за механичното характеризиране на повърхността, използвайки техники за AFM наноиндентиране. Вместо сферични колоидни сонди с микронен размер, ние избрахме силициево-нитридната сонда PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) с диаметър на върха 140 nm, специално проектирана за количествено картографиране на механичните свойства на биологични проби 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Обосновката за използването на относително остри сонди в сравнение с конвенционалните колоидни сонди може да се обясни със структурните характеристики на материала. Сравнявайки размера на върха на сондата (~140 nm) с разклонените полимерни четки на повърхността на CL lehfilcon A, показани на Фиг. 3a, може да се заключи, че върхът е достатъчно голям, за да влезе в директен контакт с тези четкови структури, което намалява вероятността върхът да ги пробие. За да илюстрираме тази точка, на Фиг. 4 е показано STEM изображение на lehfilcon A CL и вдлъбващия се връх на AFM сондата (нарисувано в мащаб).
Схематично представяне на STEM изображение на lehfilcon A CL и ACM сонда за вдлъбване (начертана в мащаб).
Освен това, размерът на върха от 140 nm е достатъчно малък, за да се избегне рискът от някой от ефектите на лепкава екструзия, съобщени по-рано за полимерни четки, произведени чрез метода на нановдлъбване CP-AFM69,71. Предполагаме, че поради специалната конусно-сферична форма и относително малкия размер на този AFM връх (фиг. 1), естеството на кривата на силата, генерирана от нановдлъбването с lehfilcon A CL, няма да зависи от скоростта на вдлъбване или скоростта на натоварване/разтоварване. Следователно, то не се влияе от пороеластичните ефекти. За да се тества тази хипотеза, пробите от lehfilcon A CL бяха вдлъбнати при фиксирана максимална сила, използвайки сонда PFQNM-LC-A-CAL, но при две различни скорости, и получените криви на силата на опън и прибиране бяха използвани за нанасяне на силата (nN) при разстояние (µm), показано на Фигура 5a. Ясно е, че кривите на силата по време на натоварване и разтоварване се припокриват напълно и няма ясни доказателства, че силата на срязване при нулева дълбочина на вдлъбване се увеличава със скоростта на вдлъбване на фигурата, което предполага, че отделните четкови елементи са били характеризирани без поро-еластичен ефект. За разлика от това, ефектите на задържане на течности (вискозна екструзия и ефекти на поро-еластичност) са очевидни за AFM сондата с диаметър 45 µm при същата скорост на вдлъбване и са подчертани от хистерезиса между кривите на разтягане и прибиране, както е показано на Фигура 5b. Тези резултати подкрепят хипотезата и предполагат, че сондите с диаметър 140 nm са добър избор за характеризиране на такива меки повърхности.
Криви на силата на вдлъбване по CL метода lehfilcon A с помощта на ACM; (а) използване на сонда с диаметър 140 nm при две скорости на натоварване, демонстриращи липсата на поро-еластичен ефект по време на повърхностно вдлъбване; (б) използване на сонди с диаметър 45 µm и 140 nm. s показват ефектите на вискозната екструзия и поро-еластичността за големи сонди в сравнение с по-малки сонди.
За да се характеризират ултрамеки повърхности, методите за AFM наноиндентиране трябва да разполагат с най-добрата сонда за изучаване на свойствата на изследвания материал. В допълнение към формата и размера на върха, чувствителността на AFM детекторната система, чувствителността към отклонение на върха в тестовата среда и твърдостта на конзолата играят важна роля при определяне на точността и надеждността на измерванията при наноиндентиране. За нашата AFM система, границата на откриване на позиционно-чувствителния детектор (PSD) е приблизително 0,5 mV и се основава на предварително калибрираната пружинна якост и изчислената чувствителност към отклонение на флуида на сондата PFQNM-LC-A-CAL, която съответства на теоретичната чувствителност към натоварване, е по-малка от 0,1 pN. Следователно, този метод позволява измерване на минимална сила на вдлъбване ≤ 0,1 pN без никакъв периферен шумов компонент. Въпреки това е почти невъзможно AFM система да намали периферния шум до това ниво поради фактори като механични вибрации и динамика на флуидите. Тези фактори ограничават общата чувствителност на метода за AFM наноиндентиране и също така водят до фонов шумов сигнал от приблизително ≤ 10 pN. За характеризиране на повърхността, пробите от lehfilcon A CL и SiHy субстрат бяха индентирани при напълно хидратирани условия, използвайки 140 nm сонда за SEM характеризиране, и получените криви на силата бяха наложени между сила (pN) и налягане. Графиката на разделяне (µm) е показана на Фигура 6a. В сравнение с базовия SiHy субстрат, кривата на силата lehfilcon A CL ясно показва преходна фаза, започваща от точката на контакт с разклонената полимерна четка и завършваща с рязка промяна в наклона, маркираща контакт на върха с подлежащия материал. Тази преходна част от кривата на силата подчертава наистина еластичното поведение на разклонената полимерна четка върху повърхността, както се вижда от кривата на компресия, следваща плътно кривата на опън, и контраста в механичните свойства между структурата на четката и обемния SiHy материал. При сравняване на lefilcon. Разделяне на средната дължина на разклонена полимерна четка в STEM изображението на PCS (Фиг. 3a) и нейната крива на силата по абсцисата на Фиг. 3a. Фигура 6а показва, че методът е способен да открие върха и разклонения полимер, достигащи самия връх на повърхността. Контакт между четковите структури. Освен това, близкото припокриване на кривите на силата показва липса на ефект на задържане на течност. В този случай няма абсолютно никаква адхезия между иглата и повърхността на пробата. Най-горните части на кривите на силата за двете проби се припокриват, което отразява сходството в механичните свойства на материалите на основата.
(a) Криви на силата на AFM наноиндентиране за lehfilcon A CL субстрати и SiHy субстрати, (b) криви на силата, показващи оценка на точката на контакт, използвайки метода на прага на фоновия шум.
За да се изучат по-фините детайли на кривата на силата, кривата на опън на пробата lehfilcon A CL е преначертана на Фиг. 6b с максимална сила от 50 pN по оста y. Тази графика предоставя важна информация за оригиналния фонов шум. Шумът е в диапазона от ±10 pN, което се използва за точно определяне на точката на контакт и изчисляване на дълбочината на вдлъбване. Както е съобщено в литературата, идентифицирането на точките на контакт е от решаващо значение за точната оценка на свойствата на материала, като например модула85. Подход, включващ автоматична обработка на данни от кривата на силата, показа подобрено съответствие между напасването на данните и количествените измервания за меки материали86. В тази работа изборът ни на точки на контакт е сравнително прост и обективен, но има своите ограничения. Нашият консервативен подход за определяне на точката на контакт може да доведе до леко надценени стойности на модула за по-малки дълбочини на вдлъбване (< 100 nm). Използването на алгоритмично базирано откриване на точки на допир и автоматизирана обработка на данни би могло да бъде продължение на тази работа в бъдеще за по-нататъшно подобряване на нашия метод. По този начин, за вътрешен фонов шум от порядъка на ±10 pN, ние дефинираме точката на контакт като първата точка от данните на оста x на Фигура 6b със стойност ≥10 pN. След това, в съответствие с прага на шума от 10 pN, вертикална линия на ниво ~0,27 µm маркира точката на контакт с повърхността, след което кривата на разтягане продължава, докато субстратът достигне дълбочината на вдлъбване от ~270 nm. Интересното е, че въз основа на размера на разклонените полимерни четки (300–400 nm), измерени с помощта на метода на изобразяване, дълбочината на вдлъбване на пробата CL lehfilcon A, наблюдавана с помощта на метода на прага на фоновия шум, е около 270 nm, което е много близко до размера на измерване със STEM. Тези резултати допълнително потвърждават съвместимостта и приложимостта на формата и размера на върха на AFM сондата за вдлъбване на тази много мека и силно еластична разклонена полимерна четка. Тези данни също така предоставят убедителни доказателства в подкрепа на нашия метод за използване на фонов шум като праг за точно определяне на точките на контакт. Следователно, всички количествени резултати, получени от математическо моделиране и апроксимация на кривата на силата, трябва да бъдат относително точни.
Количествените измервания чрез AFM наноиндентационни методи са изцяло зависими от математическите модели, използвани за избор на данни и последващ анализ. Следователно е важно да се вземат предвид всички фактори, свързани с избора на индентор, свойствата на материала и механиката на тяхното взаимодействие, преди да се избере конкретен модел. В този случай геометрията на върха беше внимателно характеризирана с помощта на SEM микрографии (фиг. 1) и въз основа на резултатите, AFM наноиндентиращата сонда с диаметър 140 nm с твърд конус и сферична геометрия на върха е добър избор за характеризиране на проби lehfilcon A CL79. Друг важен фактор, който трябва да бъде внимателно оценен, е еластичността на тествания полимерен материал. Въпреки че началните данни от наноиндентирането (фиг. 5а и 6а) ясно очертават характеристиките на припокриването на кривите на опън и натиск, т.е. пълното еластично възстановяване на материала, изключително важно е да се потвърди чисто еластичният характер на контактите. За тази цел бяха извършени две последователни вдлъбнатини на едно и също място върху повърхността на пробата lehfilcon A CL със скорост на вдлъбване от 1 µm/s при условия на пълна хидратация. Получените данни за кривата на силата са показани на фиг. 7 и, както се очакваше, кривите на разширение и компресия на двата отпечатъка са почти идентични, което подчертава високата еластичност на разклонената полимерна четкова структура.
Две криви на силата на вдлъбване на едно и също място върху повърхността на lehfilcon A CL показват идеалната еластичност на повърхността на лещата.
Въз основа на информация, получена от SEM и STEM изображения съответно на върха на сондата и повърхността на lehfilcon A CL, конусно-сферичният модел е разумно математическо представяне на взаимодействието между върха на AFM сондата и тествания мек полимерен материал. Освен това, за този конусно-сферичен модел, основните предположения за еластичните свойства на отпечатания материал са валидни за този нов биомиметичен материал и се използват за количествено определяне на модула на еластичност.
След цялостна оценка на метода AFM наноиндентиране и неговите компоненти, включително свойствата на сондата за вдлъбване (форма, размер и твърдост на пружината), чувствителност (фонов шум и оценка на точката на контакт) и модели за напасване на данните (количествени измервания на модула), методът беше използван за характеризиране на търговски достъпни ултрамеки проби, за да се проверят количествените резултати. Търговски полиакриламиден (PAAM) хидрогел с модул на еластичност 1 kPa беше тестван при хидратирани условия, използвайки сонда 140 nm. Подробности за тестването на модулите и изчисленията са предоставени в допълнителната информация. Резултатите показват, че средният измерен модул е ​​0,92 kPa, а %RSD и процентното (%) отклонение от известния модул са по-малки от 10%. Тези резултати потвърждават точността и възпроизводимостта на метода AFM наноиндентиране, използван в тази работа за измерване на модулите на ултрамеки материали. Повърхностите на пробите lehfilcon A CL и SiHy базовия субстрат бяха допълнително характеризирани, използвайки същия AFM наноиндентиращ метод, за да се изследва видимият контактен модул на ултрамеката повърхност като функция на дълбочината на вдлъбване. Кривите на разделяне на силата на вдлъбване бяха генерирани за три образци от всеки тип (n = 3; едно вдлъбване на образец) при сила от 300 pN, скорост от 1 µm/s и пълна хидратация. Кривата на разпределение на силата на вдлъбване беше апроксимирана с помощта на конусно-сферичен модел. За да се получи модул, зависим от дълбочината на вдлъбване, беше зададена част от кривата на силата с ширина 40 nm на всяко нарастване от 20 nm, започвайки от точката на контакт, и бяха измерени стойности на модула на всяка стъпка от кривата на силата. Spin Cy et al. Подобен подход е използван за характеризиране на градиента на модула на полимерни четки от поли(лаурилметакрилат) (P12MA), използвайки колоидна AFM сонда наноиндентация, и те са в съответствие с данните, използващи контактния модел на Hertz. Този подход предоставя графика на видимия контактен модул (kPa) спрямо дълбочината на вдлъбване (nm), както е показано на Фигура 8, която илюстрира градиента на видимия контактен модул/дълбочина. Изчисленият модул на еластичност на пробата CL lehfilcon A е в диапазона от 2–3 kPa в горните 100 nm на пробата, след което започва да се увеличава с дълбочината. От друга страна, при тестване на SiHy базовия субстрат без четковиден филм върху повърхността, максималната дълбочина на вдлъбване, постигната при сила от 300 pN, е по-малка от 50 nm, а стойността на модула, получена от данните, е около 400 kPa, което е сравнимо със стойностите на модула на Юнг за насипни материали.
Видим контактен модул (kPa) спрямо дълбочината на вдлъбване (nm) за lehfilcon A CL и SiHy субстрати, използвайки AFM наноиндентиращ метод с конус-сферична геометрия за измерване на модула.
Най-горната повърхност на новата биомиметична разклонена полимерна четка показва изключително нисък модул на еластичност (2–3 kPa). Това ще съответства на свободно висящия край на раздвоената полимерна четка, както е показано на STEM изображението. Въпреки че има някои доказателства за градиент на модула на външния ръб на CL, основният субстрат с висок модул е ​​по-влиятелен. Горните 100 nm на повърхността обаче са в рамките на 20% от общата дължина на разклонената полимерна четка, така че е разумно да се предположи, че измерените стойности на модула в този диапазон на дълбочина на вдлъбване са относително точни и не зависят силно от ефекта на долния обект.
Поради уникалния биомиметичен дизайн на контактните лещи lehfilcon A, състоящи се от разклонени PMPC полимерни четкови структури, присадени върху повърхността на SiHy субстрати, е много трудно надеждно да се характеризират механичните свойства на техните повърхностни структури, използвайки традиционни методи за измерване. Тук представяме усъвършенстван AFM метод за наноиндентиране за точно характеризиране на ултрамеки материали като lefilcon A с високо съдържание на вода и изключително висока еластичност. Този метод се основава на използването на AFM сонда, чийто размер и геометрия на върха са внимателно подбрани, за да съответстват на структурните размери на ултрамеките повърхностни характеристики, които ще бъдат отпечатани. Тази комбинация от размери между сондата и структурата осигурява повишена чувствителност, което ни позволява да измерваме ниския модул и присъщите еластични свойства на разклонените полимерни четкови елементи, независимо от пороеластичните ефекти. Резултатите показват, че уникалните разклонени PMPC полимерни четки, характерни за повърхността на лещата, имат изключително нисък модул на еластичност (до 2 kPa) и много висока еластичност (близо 100%), когато са тествани във водна среда. Резултатите от AFM наноиндентирането ни позволиха също да характеризираме видимия градиент на контактния модул/дълбочина (30 kPa/200 nm) на повърхността на биомиметичната леща. Този градиент може да се дължи на разликата в модулите между разклонените полимерни четки и SiHy субстрата, или на разклонената структура/плътност на полимерните четки, или на комбинация от тях. Необходими са обаче по-нататъшни задълбочени изследвания, за да се разбере напълно връзката между структурата и свойствата, особено ефектът от разклоняването на четките върху механичните свойства. Подобни измервания могат да помогнат за характеризиране на механичните свойства на повърхността на други ултрамеки материали и медицински устройства.
Наборите от данни, генерирани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответните автори при разумно искане.
Рахмати, М., Силва, ЕА, Резеланд, Дж. Е., Хейуърд, К. и Хауген, Х. Дж. Биологични реакции към физични и химични свойства на повърхностите на биоматериали. Chemical society. Ed. 49, 5178–5224 (2020).
Чен, Ф. М. и Лиу, Х. Подобряване на биоматериали, получени от човека, за тъканно инженерство. програмиране. полимер. науката. 53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al. Проектиране, клинично приложение и имунен отговор на биоматериали в регенеративната медицина. National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK и Farr GM Подобрен метод за определяне на твърдост и модул на еластичност чрез експерименти с вдлъбване с измервания на натоварване и изместване. J. Alma mater. storage tank. 7, 1564–1583 (2011).
Уоли, С. М. Исторически произход на изпитването на твърдост чрез вдлъбване. Алма матер. Науката. Технологии. 28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Измервания на твърдост чрез вдлъбване в макро-, микро- и наномащаб: Критичен преглед. tribe. Wright. 65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD и Clapperich, SM Грешки при откриване на повърхности водят до надценяване на модула при наноиндентиране на меки материали. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 312–317 (2009).
Каримзаде А., Колор ССР, Аятолахи МР, Бушроа АР и Яхя М.Ю. Оценка на метода на наноиндентиране за определяне на механичните характеристики на хетерогенни нанокомпозити с помощта на експериментални и изчислителни методи. The science. House 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR и Owart, TS Механично характеризиране на меки вискоеластични гелове чрез вдлъбване и оптимизационно-базиран обратен анализ с крайни елементи. J. Mecha. Behavior. Biomedical Science. alma mater. 2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J и Chaneler D. Оптимизация на определянето на вискоеластичността с помощта на съвместими измервателни системи. Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. и Pellillo, E. Наноиндентиране на полимерни повърхности. J. Physics. D. Apply for physics. 31, 2395 (1998).
Михайлович А.С., Цин Б., Фортунато Д. и Ван Влиет К.Й. Характеризиране на вискоеластичните механични свойства на високоеластични полимери и биологични тъкани чрез ударно вдлъбване. Journal of Biomaterials. 71, 388–397 (2018).
Перепелкин Н.В., Ковальов А.Е., Горб С.Н., Бородич Ф.М. Оценка на модула на еластичност и адхезионната работа на меки материали с помощта на разширения метод на Бородич-Галанов (БГ) и дълбоко вдлъбване. fur. alma mater. 129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al. Наномащабна морфология и механични свойства на биомиметични полимерни повърхности на силиконово-хидрогелни контактни лещи. Langmuir 37, 13961–13967 (2021).